臨床微生物檢測的基因同源性分析

1、臨床微生物檢測的基因同源性分析      醫(yī)院感染的流行病學研究是臨床微生物學工作者的重要課題，在醫(yī)院感染監(jiān)測的研究中，一個很重要的問題就是如何確定感染途徑和傳播途徑，以采取有效預(yù)防和控制措施，從而防止醫(yī)院感染或者暴發(fā)流行，因此對微生物鑒定和菌株同源性分析提出了更高的要求。      目前，傳統(tǒng)的細菌鑒定和同源性分析技術(shù)已不能很好地滿足醫(yī)院感染診斷和流行病學調(diào)查的需要，從型、亞型、株，甚至分子水平上去認識細菌變得愈來愈重要了。近年來分子生物學的理論和技術(shù)在細菌感染診斷中的滲透

2、和廣泛應(yīng)用，使得細菌鑒定、耐藥基因的檢測、分子流行病學調(diào)查變得更加準確、簡潔和快速。細菌DNA 同源性分析技術(shù)如脈沖場凝膠電泳、聚合酶鏈反應(yīng)、DNA 探針雜交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析細菌的主要手段，它在鑒定細菌感染的爆發(fā)、確定院內(nèi)交叉感染、感染病原菌之間的基因同源性等方面有著重要的作用，本文將對常用基因同源性分析方法的機理和過程做簡要綜述。 一、質(zhì)粒分型(Plasmid profile assay)：1、原理：     質(zhì)粒是可移動的染色體外元件，可以自發(fā)丟失或者被宿主穩(wěn)定地獲得

3、，因此流行病學上相關(guān)的分離菌株有可能表現(xiàn)出不同的質(zhì)粒圖譜。把質(zhì)粒提取出來，進行常規(guī)的瓊脂糖電泳分析，就可以知道分離菌株攜帶質(zhì)粒的大小和數(shù)目。2、實驗過程：a.質(zhì)粒抽提；b.0.8%瓊脂糖電泳；c.EB染色、凝膠成像。3、實驗方法的評價：   優(yōu)勢：         a.步驟比較簡單，對實驗儀器要求不高。         b.在評價那些從局限的時間和地點（如一個醫(yī)院中的急性爆發(fā)）分離出來的

4、菌株非常有效。   缺點：          a.實驗結(jié)果的重復(fù)性不好。          b.分辨力不高。 二、染色體DNA的限制性內(nèi)切核酸酶分析(Restriction Endonuclease Assay REA)1、原理：    限制性內(nèi)切核酸酶（REA）在特異的核酸識別序列切割D

5、NA，DNA被消化后，所得到的限制性片段的數(shù)目和大小是由酶的識別位點和DNA的組成共同決定的。在傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切核酸酶分析中，人們用含有相對多的限制性位點的內(nèi)切核酸酶消化細菌的DNA，這樣就會得到成百上千條長度在0.5-50Kb范圍內(nèi)的DNA片段。恒定的電場瓊脂糖電泳，可以根據(jù)分子質(zhì)量的大小將這些DNA片段分開，然后通過EB染色并在紫外燈下觀察其圖譜。同一種的不同分離菌株的DNA序列的變異可造成限制性位點數(shù)目和分布的變化，所以可以導致其REA圖譜出現(xiàn)差異。2、實驗流程：a.染色體DNA抽提；b.限制性內(nèi)切酶消化DNA（主要是Hind III）；c.0.7%瓊脂糖電泳；d.EB染色、凝

6、膠成像。3、實驗方法的評價：  優(yōu)勢：        a.實驗流程簡單。       b.所有的菌株都可以這個方法來分型。   缺點：       a.REA圖譜包括成百上千條帶，一些條帶可能不能檢測到，一些條帶可能會重疊。        b.REA

7、圖譜分析復(fù)雜。       c.分辨力不高。三、染色體DNA的脈沖場凝膠電泳(Pulsed-Field Gel Eelectrophoresis PFGE)1、原理：    用識別位點相對多的酶進行REA的一個重要的局限性，是分析那些大量的、重疊的、分辨力較差的限制性酶切片段構(gòu)成的圖譜相當困難。如果用限制性位點相對少的酶消化細菌的基因組，那么就可以得到數(shù)量相當少但更大的限制性片段，這樣在電泳中，穿過瓊脂糖的電場作周期性的改變，就可以產(chǎn)生一個有5-20條清晰

8、的分辨較好的圖譜。2、實驗流程：a.染色體DNA抽提；b.限制性內(nèi)切酶消化DNA（主要是XbaI）；c.凝膠電泳(脈沖場；d.EB染色、凝膠成像；e.軟件分析。3、實驗方法的評價：      優(yōu)勢：          a.PFGE方法的分辨力和可重復(fù)性都很高，          b.PFGE方法是腸球菌, 腸桿菌和葡萄球菌基因分

9、型的金標準。       缺點：          a.必須使所有的酶和緩沖液都能浸透凝膠塊，準備合適的DNA樣品需要延長培育時間。近來也有報道葡萄球菌和腸球菌可以用相當短的時間來進行PFGE分析。          b.需要昂貴的專業(yè)設(shè)備。四、核糖體分型（Ribotyping）1、原理：   核糖

10、體操縱子包括編碼16SrRNA和25SrRNA以及一種或多種RNA的核苷酸序列。核糖體序列高度保守，針對大腸桿菌rRNA 制備的探針，或者是克隆的核糖體操縱子，可與許多細菌的染色體核糖體操縱子雜交，細菌的基因組中通常有多個核糖體基因，分別存在于不同長度的酶切片段中，因此核糖體分型可以得到類似指紋的結(jié)果，因此是可以分型的。2、實驗流程：a.堿性磷酸酶脫去E.coli rRNA末端磷酸；b.-32PATP末端標記上述E.coli rRNA；c.抽提DNA,限制性內(nèi)切酶消化DNA（主要是Hind III）；d.凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜；e.用標好的rRNA探針進行sou

11、ther 印記、放射性自顯影。  3、實驗方法的評價：   優(yōu)勢：         a.核糖體序列高度保守, 用大腸桿菌rRNA 制備的探針能對所有的細菌進行分型。   缺點：        a.分辨力中等。         b.

12、流行病學上無關(guān)的菌株，有可能有相同的核糖體型圖譜。        c.需要用到放射性同位素，成本很高。        d.實驗步驟繁瑣。   五、限制性內(nèi)切核酸酶片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP）的核酸雜交分析1、原理：    DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形

13、成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位點變異的突變?nèi)琰c突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點間的長度發(fā)生變化）等均可導致RFLP的產(chǎn)生。2、實驗流程：a.裂解細菌，抽提基因組DNA、pvuII酶消化；b.凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜；c.過氧化物酶標記過的IS110探針雜交、X-ray 膠片顯影；d. 軟件分析。3、實驗方法的評價：    優(yōu)勢：        a.能對所有攜帶與探針同源基因的菌株進行分型。 &#

14、160;      b.實驗的重復(fù)性很高。     缺點：        a.樣品用量大、純度要求高。        b.探針設(shè)計的難度大。        c. RFLP分析技術(shù)步驟繁瑣，工作量大，成本較高。 六、隨機擴增多態(tài)性D

15、NA(Random Amplified Polymorphic DNA   RAPD-PCR)1、原理：    由于整個基因組存在眾多反向重復(fù)序列，單一引物與反向重復(fù)序列結(jié)合。使重復(fù)序列之間的區(qū)域得以擴增。引物結(jié)合位點DNA序列的改變以及兩擴增位點之間DNA堿基的缺失、插入或置換均可導致擴增片段數(shù)目和長度的差異，經(jīng)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后通過EB染色以檢測DNA片段的多態(tài)性。2、實驗流程：a.抽提DNA； b.合成引物， c1. 普通PCR，d1. 

16、;瓊脂糖電泳，e1.凝膠成像；c2. PCR with -35SdATP，d2. 尿素多聚丙烯酰胺凝膠電泳，e2.干膠 X-ray顯影。3、實驗方法的評價：  優(yōu)勢：       a.分辨力高。  缺點：      a.可重復(fù)性差。      b.圖譜很難解釋。     

17、; c.實驗步驟繁瑣，過程中需要用到同位素。 七、擴增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism  AFLP-PCR）1、原理：    由于不同物種的基因組DNA 大小不同，基因組DNA 經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，產(chǎn)生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA 片段連接作為擴增反應(yīng)的模板，用含有選擇性堿基的引物對模板DNA 進行擴增，選擇性堿基的種類、數(shù)目和順序決定了擴增片段的特殊性，

18、只有那些限制性位點側(cè)翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后根據(jù)凝膠上DNA 指紋的有無來檢出多態(tài)性。2、實驗流程：a.裂解細菌，抽提基因組DNA；b.限制性內(nèi)切酶消化；c.PCR擴增；d.毛細管電泳；e.用ABI-310 Genetic Analyzer分析電泳結(jié)果。3、實驗方法的評價：   優(yōu)勢：        a.分辨力高。   缺點： 

19、      a.引物需要同位素標記。       b.對樣品DNA質(zhì)量要求嚴格。       c.實驗中需要用到毛細管電泳，一般實驗室不具備此儀器。八、重復(fù)片段PCR（repetitive extragenic palindromic rep-PCR）1、原理：    rep-PCR所使用的引物是以短的基因外重復(fù)序列為基礎(chǔ)的。腸

20、桿菌科成員、一些革蘭氏陽性菌和真菌中，都有這些序列，一般說來，這種序列在細菌染色體上有許多位點。當兩個序列的距離足夠近時，那么位點之間的DNA片段將被有效的復(fù)制。因為重復(fù)序列的數(shù)目和位點變化很大，所以不同菌株擴增產(chǎn)生重復(fù)片段的大小和數(shù)目也就相應(yīng)的不同。2、實驗流程：a.抽提基因組DNA； b.合成rep引物、PCR；c.1.5%瓊脂糖電泳；d.軟件分析結(jié)果。3、實驗方法的評價：  優(yōu)勢：       a.有較好的重復(fù)性。      b.

21、實驗步驟比較簡單。  缺點：       a.中等的分辨力。       b.該方法的結(jié)果分析是基于Dendron software (Solltech, Inc.,Oakdale, Calif.)軟件分析，一般實驗室很少有此 軟件。九、核苷酸序列分析 （Nucleotide sequence determination）1、原理：  &

22、#160; 在細菌界中，核糖體的某些學列高度保守，人們可以設(shè)計幾乎從任何細菌都可以擴增到核糖體序列的引物。通過測定擴增產(chǎn)物以及分析核糖體操縱子相對變化的區(qū)域，就可以確定感染性微生物的類型。2、實驗流程：a.細菌基因組DNA抽提；b. PCR擴增；c.PCR產(chǎn)物測序；d.測序結(jié)果與GeneBank 序列比對，得出鑒定結(jié)果。3、實驗方法的評價：    優(yōu)勢：         a.實驗步驟比較簡單，結(jié)果容易分析。  

23、60;      b.對一些難于分型的菌株也能得到很好的結(jié)果。    缺點：          a.代測菌株必須有足夠的差異序列以保證切實有效。         b.目前還不清楚單一位點的測序能否提供可靠的鑒定結(jié)果。隨著越來越多的分子技術(shù)應(yīng)用到醫(yī)院感染的病原菌研究中，為流行病學調(diào)查和患者的治療提供了快捷準確的

24、支持。然而，醫(yī)院感染病原菌存在廣泛而迅速的變異，這些變異使得菌株的基因同源性分析資料的解釋變得錯綜復(fù)雜。在任何一種分析系統(tǒng)中，一個單一遺傳事件(如單個代謝酶的變化或者一條電泳條帶的變化)組成的改變，不足以得出兩個菌株代表不同菌株的結(jié)論，也就是說它們不一定在流行病學上無關(guān)。因此，多種分子分析技術(shù)的聯(lián)用，已成為分子流行病學調(diào)查和臨床微生物診斷的趨勢。脈沖場凝膠電泳1984年，Schwartz和Centor發(fā)明了交變脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)技術(shù)，與常規(guī)的直流單向電場凝膠電泳不同，這項技術(shù)采用定時改變電場方向的交變電源，每次電流方向改

25、變后持續(xù)1s到5min左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場。     一、PFGE的基本原理     脈沖電泳分離DNA大分子的介質(zhì)是瓊脂糖，大于20kb的線性DNA雙鏈片段，在瓊脂糖凝膠的網(wǎng)孔中的泳動，就像蛇行似的尋找彎曲蜿蜒的孔隙。普通的單方向恒定電場給DNA分子的泳動動力方向確定且不發(fā)生變化，所以嚴重影響凝膠電泳分離大分子量DNA片段的效果。    PFGE施加在凝膠上至少有兩個電場方向，時間與電流大小也交替改變，使得DNA分子能夠不斷地調(diào)整泳動方向，以適應(yīng)凝膠中不

26、規(guī)則的孔隙變化，達到分離大分子線性DNA的目的，最大分辨率為5000kb大小的線性DNA分子。在交變脈沖電場中，大分子量線性DNA改變泳動方向所需時間比小分子線性DNA要長，因為前者變形能力低于后者。當某一線性DNA在脈沖場中改變形狀調(diào)整方向進行遷移所需的時間大于脈沖場脈沖維持時間時，該DNA的遷移速度將減為最低。線性分子改變形狀和泳動方向所需時間與其分子量大致成正比，PFGE也是基于不同DNA分子量的差異作為分離不同DNA分子的依據(jù)。當DNA分子變形轉(zhuǎn)向所需時間與脈沖時間較接近時，遷移率與DNA分子量成反比。根據(jù)被分離DNA分子的范圍選擇適當?shù)拿}沖時間，經(jīng)過較長時間不斷變形轉(zhuǎn)向泳動，不同大小的DNA就被分離。DNA分子的凈遷移方向與普通電泳一樣，垂直于樣品孔。    影響PFGE分辨率的因素包括幾方面：兩個脈沖場的均一性；兩個脈沖場的脈沖時間以及它們之間的比率；兩個脈沖場的強度和方向。為了增強PFGE對大小差異較大的DNA樣品的分辨率，可采用交變脈沖梯度電場，即在電泳過程中，先用較短的交變脈沖時間使較小的DNA分子分離，然后用較長的交變脈沖時間分離