第二章植物組織培養(yǎng)基本操作

1、教學目的：了解植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)的培養(yǎng)基種類、成分及其特點，學習植物組織培養(yǎng)基本操作，了解離體培養(yǎng)環(huán)境條件，以及煉苗移栽基本方法。職業(yè)技能教學點：具有植物組織培養(yǎng)基本操作程序的認知。能夠識別各類培養(yǎng)基特點，熟悉MS培養(yǎng)基成分；具有制作培養(yǎng)基能力，具有選擇外植體、表面滅菌、無菌接種等基本能力；具有植物組織培養(yǎng)條件控制基本能力；有進行組培苗馴化練苗的基本能力。教學時間：10學時教學重點：各類培養(yǎng)基特點，固體培養(yǎng)基制作，外植體的選擇及表面滅菌，外植體培養(yǎng)條件，組培苗馴化原則及常規(guī)移栽方法。教學難點：各類培養(yǎng)基特點，培養(yǎng)基制作及高壓滅菌操作，外植體的表面滅菌，外植體培養(yǎng)中易出現的問題及其解決辦法，試管苗

2、的特點。教學內容：第一節(jié) 培養(yǎng)基成分、種類及特點植物生長必需16種基本元素：N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。離體培養(yǎng)條件下，各種元素主要從培養(yǎng)基中獲得：H 和O來源于水，C來源于添加的糖類，其它礦質元素來源于組成培養(yǎng)基的無機鹽。培養(yǎng)基是根據植物生長所需營養(yǎng)成分，配制成的供植物生長的人工制作的營養(yǎng)物質。一、培養(yǎng)基的成分不同植物組織器官所需要的營養(yǎng)條件不完全一樣，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分也有差異，但總的來說，培養(yǎng)基一般包括無機鹽、有機化合物和生長調節(jié)劑三大基本組成成分。1、無機鹽類 離體組織生長發(fā)育的基本成分，根據植物對必需元素需要的量，可以分為以下兩類：大量

3、元素植物所需元素的使用量一般在每升幾十-幾千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。微量元素植物所需元素的濃度小于10-510-7mol/L，Fe、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。除C、H、O外，其它礦質元素通常以一定濃度的無機化合物形式，按一定比例配制而成，溶于水中以離子態(tài)被吸收，N有硝態(tài)氮KNO3和銨態(tài)氮（NH4）2SO4兩類提供。2、有機化合物培養(yǎng)基中只有無機鹽叫做基本培養(yǎng)基，為使培養(yǎng)物更好的生長，還需添加有機成分，常用有糖類、維生素、醇類、嘌呤、氨基酸等。糖類 離體培養(yǎng)物生長與發(fā)育不可缺少的有機成分，即作為碳源，又維持培養(yǎng)基的滲透壓在1.5-4.1MPa。多使用蔗糖，試管苗生

4、長與繁殖濃度2-3%，幼胚培養(yǎng)4-6%，某些特殊培養(yǎng)中用8-10%。細胞和原生質體培養(yǎng)還用麥芽糖、葡萄糖、果糖。維生素類 參與酶的形成、蛋白質、脂肪代謝，明顯的促進離體培養(yǎng)物的生長。鹽酸硫胺素-VB1、鹽酸吡哆醇-VB6、煙酸-Vpp、生物素-VH、維生素C-Vc。肌醇 促進糖的轉化、維生素和激素的利用，對胚狀體和芽的形成有良好影響。用量一般50-100mg/L。腺嘌呤 合成各種細胞分裂素的前體物質之一，利于細胞分裂，促進芽的形成和生長。氨基酸 蛋白質的成分，是有機氮化合物，常用甘氨酸和多種氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。其它復合成分 成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、酵母提取液

5、、番茄汁、麥芽糖等。3、生長調節(jié)物質 組織培養(yǎng)中常用：生長素類-生長素主要促進細胞分裂的生長，促進細胞脫分化，有利于誘導愈傷組織的產生，生長素與細胞分裂素同時使用有協(xié)調作用，在離體培養(yǎng)分化調節(jié)中，生長素促進根的形成抑制芽的形成，液體培養(yǎng)中利于體細胞胚胎發(fā)生。常用IAA、IBA、NAA、2,4-D。細胞分裂素類-促進細胞分裂和擴大，調解器官分化，延緩組織衰老，增強蛋白質合成，能改善其它激素作用，離體培養(yǎng)中，促進不定芽的發(fā)生，與生長素協(xié)調作用可有效控制培養(yǎng)物的生長與分化。常用6-BA、ZT、KT、2iP。赤霉素類-促進細胞伸長生長、誘導花芽形成、打破種子休眠以及誘導單性結實等生理功能。目前主要是赤

6、霉酸GA3。離體培養(yǎng)下，還與生長素協(xié)調作用對形成層分化有影響，刺激體細胞胚進一步發(fā)育成植株。4、水一切生命活動不可缺少的重要成分，離體培養(yǎng)中，級是培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的溶劑，又是培養(yǎng)基的重要組成部分，占培養(yǎng)基成分的95%。天然水或自來水不能直接用于培養(yǎng)基配制，原生質體培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)及分生組織培養(yǎng)一般應用雙蒸水或超純水，大批量快速繁殖培養(yǎng)，可用一般蒸餾水或純凈水。5、其它附加成分瓊脂 來自海藻的多糖類物質，組織培養(yǎng)中最常用作凝固劑，是最方便、最好的凝固劑和支持物，常用量0.6%-1.0%，不是培養(yǎng)基必需成分?；钚蕴?常用的吸附劑，某些培養(yǎng)類型中，可以吸附培養(yǎng)過程中產生的一些有毒物質，有利于培養(yǎng)物的生長

7、。常用濃度0.5%左右，其吸附作用選擇性較差，常受溫度影響，低溫吸附效果好，高溫吸附能力降低甚至解吸附。二、常用培養(yǎng)基的種類、配方及特點（一）培養(yǎng)基種類1、根據態(tài)相分：固體培養(yǎng)基-加凝固劑的培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基-不加凝固劑的培養(yǎng)基。2、根據培養(yǎng)過程分：初代培養(yǎng)基-初次接種外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基-接種初代培養(yǎng)之后培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。3、根據作用分：誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基。4、根據營養(yǎng)水平分：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基。（二）幾種常用培養(yǎng)基組織培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基有：MS、MT、White、Nitsch、Blaydes、N6、B5、NT、SH、Miller、Heller等。（三）幾種常見培養(yǎng)

8、基的特點1、富鹽平衡培養(yǎng)基 無機鹽濃度高，元素比例適當，離子平衡好，具有較強的緩沖性，培養(yǎng)中維持較好的穩(wěn)定性，含高量氮、鉀，營養(yǎng)豐富，元素種類齊全，MS培養(yǎng)基使用最廣泛。2、低鹽培養(yǎng)基 無機鹽濃度低，有機成分含量低，多數作為生根培養(yǎng)基、胚胎培養(yǎng)使用，常用White培養(yǎng)基。3、高硝態(tài)鹽培養(yǎng)基 較低銨鹽，高硝酸鹽和鹽酸硫胺素B5培養(yǎng)基適合雙子葉植物特別是木本植物的生長。N6培養(yǎng)基為水稻等禾谷類花藥培養(yǎng)設計，KNO3和（NH4）2SO4含量高,不含鉬。SH培養(yǎng)基 (NH4)H2PO4代替（NH4）2SO4,礦質濃度較高，多數單子葉和雙子葉植物上使用較好。4、中鹽培養(yǎng)基 大量元素無機鹽為MS的1/2，

9、微量元素種類減少含量增高，無肌醇維生素種類多，增加生物素、葉酸，有H、Hitsch、Miller、Blaydes等培養(yǎng)基，適用于特殊細胞培養(yǎng)。第二節(jié) 培養(yǎng)基的制備一、培養(yǎng)基母液的配制制作一升培養(yǎng)基所需藥品20多種，在實際制作時如果每次制作都稱量20多次，浪費時間和精力；同時每升培養(yǎng)基所用藥品有的很少，如鹽酸硫胺素只需0.025mg，即使是電子天平也不可能感量那么小的單位。因此，為節(jié)省時間和配制的準確，需將各種藥品濃縮成一定倍數，并且混合成一定母液，進行保存。制作培養(yǎng)基時根據需制培養(yǎng)基數量取用母液。（一）營養(yǎng)成分的配制根據藥品性質將母液配制成以下四類：1、大量元素可以混在一起配制成1020倍液，

10、硫酸鎂和氯化鈣Ca+和Mg2+會與磷酸鹽混合，產生不溶性沉淀，要分別單獨配制Ca+與PO4-一起混合易沉淀，定容后消失。2、微量元素可配成100200倍混合母液，KI可單獨配。3、鐵鹽硫酸亞鐵和EDTA鈉鹽易沉淀，需單獨配制，配成100200倍鰲合劑不易沉淀。4、有機化合物維生素、肌醇、氨基酸等一起配成100或200液，也可分別配制。（二）植物生長調節(jié)物質的配制植物生長調節(jié)物質分別配成母液儲于冰箱，濃度一般為0.51mg/ml。1、IAA、NAA先用少量95%酒精使之充分溶解， 2、2,4D可用少量0.1mol/L的NaOH溶液充分溶解，再緩緩加蒸餾水定容至需要的體積。3、KT和BA等細胞分裂

11、素類，先用少量0.1mol/L 的HCl溶解，再用蒸餾水定容至需要的體積。（三）藥品用量的計算：配制母液時藥品用量(mg)=配方用量(mg)×濃縮倍數×制備容量（L）（四）保存1、各類母液寫上標簽，標簽上注明母液名稱及制備1L培養(yǎng)基的母液取用量。2、2-4冰箱保存。二、培養(yǎng)基的制備配制好培養(yǎng)基母液后，要用于植物的離體培養(yǎng)，還需制作成一定的培養(yǎng)基質培養(yǎng)基，才能進行植物的離體培養(yǎng)。（一）母液取用量的計算制備培養(yǎng)基時母液取用量（ml）=1000÷濃縮倍數×制備培養(yǎng)基數量（L）（二）培養(yǎng)基制作程序1、按大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分順序將母液取出，混合。2、

12、適量蒸餾水放入加熱容器，蒸餾水應少于所制培養(yǎng)基數量，約終體積的2/3-3/4，接通電源加熱。3、向加熱容器中加入稱量好的瓊脂（0.6-0.8%），攪拌加熱，至完全溶化。4、瓊脂熬化后，稱取相應量的蔗糖（2-3%），加入加熱容器中至溶解。5、將母液混合液加入到加熱容器中，混勻。6、蒸餾水定容至所需體積。7、測試培養(yǎng)基溶液的PH值(5.8-6.0)，過高滴加0.1mol/L的HCL調整，過低滴加0.1mol/L的NaOH調整。8、迅速分裝到培養(yǎng)瓶中，備用。培養(yǎng)基是離體培養(yǎng)物賴以生存和生長的人工環(huán)境的重要組成部分，常用的培養(yǎng)基依據其物理狀態(tài)的不同分為固態(tài)培養(yǎng)基和液態(tài)培養(yǎng)基。固態(tài)培養(yǎng)基一般使用瓊脂為凝

13、固劑，也有使用卡拉膠或魔芋粉為凝固劑的。液態(tài)培養(yǎng)基不使用凝固劑，但需要在容器中置入適當的支撐物，試管為培養(yǎng)容器的支撐物可用濾紙橋，底面積較大的培養(yǎng)容器，支撐物可選用脫脂棉以及某些性質穩(wěn)定的高分子材料。三、培養(yǎng)基及培養(yǎng)器械的滅菌制備好的培養(yǎng)基如果帶菌，會導致植物離體培養(yǎng)失敗，因而還要對培養(yǎng)基進行滅菌處理。（一）高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基的滅菌一般采用濕熱滅菌法：1、培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)器械放入高壓滅菌鍋。2、滅菌鍋加水至淹沒電熱絲3、封閉高壓滅菌鍋各出氣口。4、接通電源加壓至49kPa（0.5MPa）5、打開排氣閥，排冷氣至壓力為0 kPa。6、繼續(xù)加壓至108kPa（1.1mPa-1.2Mpa，即121）7、

14、當壓力至108kPa（1.1mPa-1.2Mpa，即121）時，穩(wěn)壓在此壓力15-20min。8、關閉電源，自然冷卻至壓力為0 kPa。9、取出培養(yǎng)基和器械冷卻，貯存于30以下室內。（二）干熱滅菌培養(yǎng)瓶、三角瓶、試管等玻璃器皿及接種器械，可以進行干熱滅菌。即將洗滌干凈的玻璃器皿放到烘箱中，在150溫度下，干熱滅菌1小時，或120下滅菌2小時。滅菌完畢冷卻后取出器械貯存。貯存室要保持無菌、干燥、以免造成培養(yǎng)基的二次污染。滅菌后的培養(yǎng)基一般應在2周內使用，時間過長易造成潛在的污染。此外，培養(yǎng)基滅菌后如果出現過多沉淀或瓊脂不凝固等現象，該培養(yǎng)基不能繼續(xù)使用，應查明原因重新配制。LAA、ZTA、BA及

15、維生素遇熱不穩(wěn)定，有條件最好進行過濾滅菌。第三節(jié) 外植體無菌接種一般來說，無論何種類型的組織培養(yǎng)技術，起始階段均涉及外植體取材、滅菌、接種與培養(yǎng)等基本過程。現在對這一共同過程進行介紹。一、植物材料的培養(yǎng)與取材外植體是指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織、器官等材料，是植物離體培養(yǎng)的基礎材料。外植體來源的環(huán)境以及外植體的類型，均會影響將來培養(yǎng)的效果，而滅菌、接種和培養(yǎng)條件的選擇與控制，也與外植體的來源和類型有關。1、外植體的來源生長在自然環(huán)境下的植物三種 有目的地培育在溫室控制條件下生長的植物無菌環(huán)境下已經過離體培養(yǎng)的植物自然環(huán)境中生長的植株，一般帶有微生物，有的甚至與某些微生物具有某種寄生關系，從而使

16、其具有所謂的內生菌。取自這些植物的外植體，盡管經過了嚴格的滅菌處理，但在培養(yǎng)過程中仍然會有微生物滋生，從而影響培養(yǎng)效果。因此，在大多數情況下，應盡量使用溫室或人工氣候室控制培養(yǎng)的植物材料作為外植體來源，減少培養(yǎng)過程中的微生物感染概率。同時，生長在控制條件下的植物可以保持培養(yǎng)料間的一致性，提高實驗的可重復性，也便于培養(yǎng)技術的規(guī)范。某些多年生植物或特殊材料，必須取自自然生長的植物，就需要盡可能避免使用那些生長過于潮濕和不潔凈環(huán)境中的植物。對于培養(yǎng)過程中可能出現內生菌污染的材料，應盡量取生長旺盛期的生長點部位作為起始培養(yǎng)的材料。2、供體植株的管理取自室外的外植體材料，供體植株的管理十分重要，這與外植

17、體培養(yǎng)時的污染率密切相關。植株管理中應注意：避免昆蟲危害 許多昆蟲如蚜蟲、螨類和飛虱是許多植物病蟲害的傳播媒介，會引起植物組織的潛在感染。注意防病 尤其是真菌和細菌病害的侵染，取自感病植株的外植體，在培養(yǎng)中的污染率遠遠高于來自健康植株的外植體，必要時需使用化學藥劑防治病害?？刂茲穸?給供體植株澆水時應從根部給水，避免從上部澆水，以免上部形成易于病原侵染的濕度環(huán)境；盡可能降低溫室濕度；取材前盡可能保持植株干爽。1、材料取材材料選擇 培養(yǎng)材料應選擇有代表性的主要植物、選擇性狀優(yōu)良的種質或特殊的基因型?？焖俜敝硶r應在植株生長的最適時期取材，花藥培養(yǎng)應在花粉發(fā)育到單核期取材。選取材料的大小一般在0.5

18、-1.0cm之間。胚胎培養(yǎng)或脫毒在0.5cm以下。材料太大易污染，材料太小難于成活。采收從生長健壯的無病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的器官和組織。最好采用莖尖，后代性狀較穩(wěn)定，攜帶細菌較少。二、預處理與表面滅菌1、預處理先對植物材料進行修剪整理，去掉不需要部分，將準備使用的植物材料（外植體）在流水中沖洗20-60分鐘，備用。如特別不潔的外植體，可先用加有洗滌劑的水清洗10-15分鐘，再用流水沖洗干凈。2、表面滅菌（1）操作人員穿戴滅菌過的工作服、口罩。進入接種室前雙手用洗滌劑清洗干凈，操作前再用70%酒精或消毒劑擦洗雙手。（2）操作期間雙手和臺面常用70%酒精或消毒劑擦拭。超凈工作臺使用前必須用紫

19、外燈照射殺菌，然后開啟風機。（3）接種用工具（解剖刀、剪刀、鑷子）可放入75%酒精中，使用時需火焰灼燒滅菌，冷卻后使用。（4）外植體放入超凈工作臺內，置70%酒精中5-60 秒，0.1升汞6-10分鐘，或10%的漂白粉上清液中10-15分鐘，然后用無菌水沖洗3-5次。滅菌時需進行攪動。三、外植體的接種無菌接種外植體的接種是把經過表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細胞、轉放到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。整個過程均需無菌操作。（1）借助接種用工具將材料切割分離。（2）將培養(yǎng)基放入超凈工作臺內，火焰灼燒培養(yǎng)基瓶口，然后打開培養(yǎng)瓶口，置培養(yǎng)瓶為斜角，避免灰塵落入平中。（3）迅速將切割分離下的

20、所需組織、細胞、器官，放入培養(yǎng)基上，及時蓋上瓶蓋。（4）工具用后應及時滅菌，避免交叉污染。（5）工作人員操作時禁止不必要的談話。第四節(jié) 外植體的培養(yǎng)接種只是完成了離體培養(yǎng)的第一步，植物離體培養(yǎng)和栽培植物一樣，生長過程中也受到各種環(huán)境因素的影響。培養(yǎng)條件是離體培養(yǎng)能否成功的關鍵。在培養(yǎng)基條件適宜的基礎上，影響試管苗生長的主要因素有光照、溫度、濕度、氧氣。一、外植體的培養(yǎng)條件1、光照 光照對植物生長發(fā)育有重要作用，是離體培養(yǎng)中非常重要的環(huán)境因素。光照強度、光質以及光照時間，對細胞的增殖、器官的分化都有很大影響。除特殊要求外，一般都采用日光燈作光源，光照強度1000-5000Lx，根據不同植物或器官

21、需要，可以每天連續(xù)光照12-16小時，也可每天光照16小時，8小時黑暗。2、溫度 離體培養(yǎng)中對溫度的控制比光照更為重要，大所數植物最適溫度在23-32之間。培養(yǎng)室溫度是25±2。低于15時，培養(yǎng)的組織生長停頓，高于35對生長也不利。因此，培養(yǎng)室應安裝空調機或其他的控溫設備。3、 濕度培養(yǎng)瓶內相對濕度通常是100%，而環(huán)境中的相對濕度會直接影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)。因此，培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)室一般要求相對濕度保持在70-80%，相對濕度過低影響培養(yǎng)物生長和分化，應向室內噴灑水，以提高濕度；過高雜菌滋生，大量污染，應及時地通風除濕。4、氧氣離體培養(yǎng)的試管苗是需要氧氣的，在固體培養(yǎng)或液體靜置培養(yǎng)時

22、，如果組織完全浸入培養(yǎng)基中，與氧氣隔絕，就會停止生長。因此，接種時要有部分組織合空氣接觸。振蕩培養(yǎng)是解決通氣的良好辦法。固體培養(yǎng)中，如瓶塞不透氣，培養(yǎng)物也不能生長，要選擇通氣性好的培養(yǎng)瓶蓋，增加可利用的氧氣，迅速除去釋放出來的CO2，有利于外植體外層細胞開始分裂。離體培養(yǎng)中容易出現三個問題：污染、褐變、玻璃化二、外植體的成苗途徑外植體的成苗途徑有三種：（一）外植體-愈傷組織-完整植株。 具體又可分為三種： 1、愈傷組織-同時長芽和根-植株。2、愈傷組織-莖-根-植株。3、愈傷組織-根-芽-植株。（二）外植體-胚狀體-植株?？蓮囊韵聨追N培養(yǎng)物中產生：1、器官上發(fā)生。2、愈傷組織上發(fā)生。3、游離單

23、細胞發(fā)生。4、小孢子發(fā)生。誘導胚狀體比誘導芽數量多、速度快、結構完整。（三）外植體-直接形成根與芽-植株。如莖尖培養(yǎng)。三、離體培養(yǎng)中常見問題（一）污染的原因及其預防措施1、污染原因污染是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導致培養(yǎng)失敗的現象。病原菌：細菌及真菌兩大類。污染特點：細菌污染特點-菌斑呈黏液狀，接種后1-2天發(fā)現。污染途徑：外植體帶菌培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底操作人員未遵守操作規(guī)程真菌污染的特點-污染部分長有不同顏色的霉菌，接種后3-10天發(fā)現。 污染途徑：周圍環(huán)境不清潔超凈工作臺過濾裝置失效培養(yǎng)瓶的口徑過大2、污染的預防措施防止材料帶菌的措施-莖尖作外植體時，進行預培養(yǎng)（無糖）

24、或暗培養(yǎng)。-無糖營養(yǎng)液或自來水使枝條抽枝，以新抽嫩枝作外植體。-晴天取材，下午取材，經日曬過可殺死部分細菌或真菌。-接種時除去外部韌皮組織，只接內部的分生組織。外植體的滅菌-多次滅菌法，1.3%次氯酸鈉30min-無菌水3次-過夜-2.6%次氯酸鈉30min-蒸餾水3次-多種藥液交替浸泡法，肥皂水-70-75%酒精數秒-0.5%RoccalB稀釋液5min-5-10%次氯酸鈉15-30min或0.1-0.2%升汞溶液5-10min -無菌水5次。 器皿與金屬器械的滅菌玻璃器皿可采用濕熱滅菌或干熱滅菌金屬器皿一般火焰滅菌，也可干熱滅菌布質制品的滅菌 濕熱滅菌無菌操作室的滅菌 2%新捷爾滅或70%

25、酒精擦拭（噴霧），紫外燈照射，定期甲醛和高錳酸鉀熏蒸。嚴格按照操作程序。（二）外植體的褐變及其防止措施。1、褐變的原因褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中體內的多酚氧化酶被激活，使細胞內的酚類物質氧化成棕褐色的醌類物質，這種致死的褐變物向外擴散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，抑制其它酶的活性，影響外植體的分化，最后變褐死亡的現象。基因型 某些植物酚類物質含量較多。外植體的生理狀態(tài) 幼年的材料培養(yǎng)含醌類物質較少。培養(yǎng)基的成分-過高的無機鹽濃度-生長調節(jié)物質使用不當，BA過多-分生能力強的材料，氧化受抑制，褐變也被抑制-培養(yǎng)條件不適宜，溫度過高或光照過強，褐變加速。材料轉移時間 時間過長引起材料褐變。2、褐變的防止

26、措施選擇適宜的外植體及最佳培養(yǎng)基。連續(xù)轉移。加抗氧化物。加活性炭。（三）玻璃化現象及其預防措施1、玻璃化現象及其產生原因玻璃化是在細胞生長過程中的環(huán)境產生變化，試管苗為了適應變化了的環(huán)境而呈玻璃狀。主要原因是：激素濃度 BA濃度提高，導致玻璃化苗的產生。瓊脂濃度 瓊脂濃度低，玻璃化苗增加。溫度 低溫易形成玻璃化苗。光照時間 一般要求10-12h，大于15h玻璃苗增加。通風條件 培養(yǎng)瓶容量小，氣體交換不良，玻璃化苗多。離子水平 植物種類不同，離子形態(tài)比例量要求不同。2、預防措施控制無機營養(yǎng)成分，降低氮（銨態(tài)氮）和氯。提高蔗糖和瓊脂濃度降低細胞分裂素和赤霉素濃度，增加生長素比例。增加自然光照100

27、0-1800lx，控制光照時間8-12h。適溫生長，熱擊處理防止玻璃化發(fā)生。使用透氣性好的封口膜。培養(yǎng)基中加入間苯三酚、根皮苷或多效唑、矮壯素。第五節(jié) 試管苗的馴化移栽一、試管苗的特點1、試管苗的生態(tài)環(huán)境組織培養(yǎng)出來的苗通稱試管苗或組培苗。試管苗長期生活在密閉容器中，形成其獨特生態(tài)系統(tǒng)，與外界環(huán)境相比，有四大差異高恒溫試管苗整個生長過程中采用的是恒溫培養(yǎng)，溫差很小。并且溫度一般控制在25+2甚至更高。外界環(huán)境條件溫度不斷變化，其調節(jié)由太陽輻射決定，溫差很大，而且一般不會達到25+2。高濕試管瓶內水分移動途徑有兩條：試管苗水分從氣孔蒸騰培養(yǎng)基向外蒸發(fā)，凝結后又進入培養(yǎng)基水分移動循環(huán)造成瓶內相對濕度接近100%，遠遠大于瓶外空氣濕度，故試管苗蒸騰小。弱光試管瓶內光照一般比太陽光弱，幼苗生長也較弱，不能受太陽光直接照射。無菌試管苗所在環(huán)境無菌，與外界有菌環(huán)境不同，試管苗也無菌，同時，培養(yǎng)瓶內氣體環(huán)境較為特殊，與外界環(huán)境有很大差異。因此，培養(yǎng)