基因定點(diǎn)突變

1、基因定點(diǎn)突變一、定點(diǎn)突變的目的把目的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。二、定點(diǎn)突變的原理通過設(shè)計(jì)引物，并利用PCR將模板擴(kuò)增出來，然后去掉模板，剩下來的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個點(diǎn)變過來了，然后再轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，再測序確定就行了。三、引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)的一般原則不再重復(fù)。突變引物設(shè)計(jì)的特殊原則：（1）通常引物長度為2545 bp，我們建議引物長度為3035 bp。一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長度至少為11-12 bp。若兩邊引物太短了，很可能會造成突變實(shí)驗(yàn)失敗，因?yàn)橐镏辽僖?1-12個bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引

2、物搭上，所以兩邊最好各設(shè)至少12個bp，并且合成多一條反向互補(bǔ)的引物。 （2）如果設(shè)定的引物長度為30 bp，接下來需要計(jì)算引物的Tm值，看是否達(dá)到78（GC含量應(yīng)大于40%）。 （3）如果Tm值低于78，則適當(dāng)改變引物的長度以使其Tm值達(dá)到78（GC含量應(yīng)大于40%）。 （4）設(shè)計(jì)上下游引物時確保突變點(diǎn)在引物的中央位置。 （5）最好使用經(jīng)過純化的引物。       Tm值計(jì)算公式：Tm=0.41×(% of GC)675/L+81.5 注：L：引物堿基數(shù)；% of GC：引物GC含量。四、引物設(shè)計(jì)實(shí)例以GCGACG為例：5

3、-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3（1）首先設(shè)計(jì)30 bp長的上下游引物，并將A (T)設(shè)計(jì)在引物的中央位置。Primer #1: 5-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3 Primer #2: 5-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3（2）引物GC含量為40%，L為30，將這兩個數(shù)值帶入Tm值計(jì)算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通過計(jì)算可以看出其Tm低于78，這樣的引物是不合適的，所以必須調(diào)整引物長度。（3）重新調(diào)整引物長度。Primer #

4、1: 5-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3 Primer #2: 5-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3在引物兩端加5mer（斜體下劃線處），這樣引物的GC含量為45.7%，L值為35，將這兩個數(shù)值帶入Tm值計(jì)算公式，得到其Tm為80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），這樣的引物就可以用于突變實(shí)驗(yàn)了。五、突變所用聚合酶及Buffer引物和質(zhì)粒都準(zhǔn)備好后，當(dāng)然就是做PCR嘍，不過對于PCR的酶和buffer，不能用平時的，我們做PCR把整個質(zhì)粒擴(kuò)出來，延伸長度達(dá)到幾個K，所以要用

5、那些GC buffer或擴(kuò)增長片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來擴(kuò)增，防止引進(jìn)新的突變。除了使用基因定點(diǎn)突變試劑盒，如Stratagene和塞百盛的試劑盒，但價格昂貴?？梢允褂酶弑Ｕ娴木酆厦?，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase。六、如何去掉PCR產(chǎn)物最簡單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來的質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產(chǎn)物都是沒有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質(zhì)粒）而不

6、會影響PCR產(chǎn)物，從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。DpnI處理的時間最好長一點(diǎn)，最少一個小時吧，最好能有兩三個小時，因?yàn)槿绻０逄幚淼貌桓蓛簦呐轮挥心敲匆稽c(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長出來，就會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。七、如何拿到質(zhì)粒直接把通過DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了，然后再篩選出陽性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測序，驗(yàn)證突變結(jié)果。八、圖示九、定點(diǎn)突變操作步驟A 誘導(dǎo)突變基因（PCR反應(yīng)）以待突變的質(zhì)粒為模板，用設(shè)計(jì)的引物及Muta-direct酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，誘導(dǎo)目的基因突變。1. 設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物。  注參考引物設(shè)計(jì)指導(dǎo)2. 準(zhǔn)備模板質(zhì)粒D

7、N A注用dam+型菌株（例如DH5菌株）作為宿主菌。在end+型菌株中常有克隆數(shù)低的現(xiàn)象，但是對突變效率沒有影響。提取質(zhì)粒DNA時我們建議您使用本公司的質(zhì)粒提純試劑盒。3. 選項(xiàng)對照反應(yīng)體系（50l反應(yīng)體系）10×Reaction Buffer5lpUC18 control plasmid（10ng/l，total 20ng）2lControl primer mix（20pmol/l）2ldNTP mixture（each 2.5mM）2ldH2O 38lMuta-direct Enzyme1l4. 樣品反應(yīng)體系（50l反應(yīng)體系）10×Reaction Buffer5lS

8、ample plasmid（10ng/l，total 20ng） 2lSample primer (F)（10pmol/l）1lSample primer (R)（10pmol/l）1ldNTP mixture（each 2.5mM）2ldH2O38lMuta-direct Enzyme1l5. PCR反應(yīng)條件注按如下參數(shù)設(shè)置PCR擴(kuò)增條件。CyclesTemperature Reaction Time1cycle95 30sec15cycle9530sec551min721min per plasmid Kb6. PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后冰育5分鐘，然后置于室溫（避免反復(fù)凍融）。注 按

9、下列提供的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，控制PCR循環(huán)數(shù)。注意當(dāng)突變點(diǎn)位點(diǎn)超過4個時會發(fā)生突變率降低的現(xiàn)象。MutationCycles 12Nucleotide15cycles3Nucleotides18cyclesB 突變質(zhì)粒選擇PCR反應(yīng)結(jié)束后使用Mutazyme酶消化甲基化質(zhì)粒從而選擇突變質(zhì)粒DNA。1. 準(zhǔn)備PCR反應(yīng)產(chǎn)物2. 加入1l（10U/l）Mutazyme酶37溫育1小時。注當(dāng)質(zhì)粒DNA用量過多時Mutazyme酶可能發(fā)生與樣品反應(yīng)不完全的現(xiàn)象。因此我們建議為了保證突變率請嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。如果突變率低，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時間或增加Mutazyme酶用量。C轉(zhuǎn)化反應(yīng)完畢后在質(zhì)粒DNA上會產(chǎn)生缺口，當(dāng)