融合蛋白標簽

1、在蛋白質功能及結構研究過程中，研究的首要任務就是利用多種方法獲得純化的具有完整結構及生物學功能并能夠正確折疊的高度純化蛋白質。除了蛋白質的研究，具有特定生物活性的高價值蛋白質的生產(chǎn)也需要對蛋白質產(chǎn)品進行純化。因此，科研人員和工業(yè)生產(chǎn)往往大量采用多種多樣的表達系統(tǒng)來獲得高表達的蛋白質，對其純化后進行研究或加工，這些表達系統(tǒng)包括原核表達系統(tǒng)、酵母菌表達系統(tǒng)、昆蟲動物細胞表達系統(tǒng)、真核細胞表達系統(tǒng)等。  如何將系統(tǒng)中表達的目標蛋白質與其他蛋白分離，一直是表達純化中的一個重點。為了克服從復雜樣品中純化單一蛋白質這種困難，科學家利用生物物質，特別是酶和抗體等蛋白質，具有識別某種特定物

2、質并與該物質分子特異性結合的能力，利用生物分子間的這種特異性結合能力而形成的親和純化技術。親和標簽純化技術已廣泛應用于蛋白質，特別是重組蛋白的分離純化中。在重組蛋白的親和純化中，利用基因工程技術，將經(jīng)過改造優(yōu)化的親和標簽與目標蛋白融合表達，通過一步簡單快速的親和層析，直接獲得純度較高的重組融合蛋白，已成為重組蛋白純化的一個通用方法，具有結合特異性高、純化步驟簡便、純化條件溫和、適用性廣泛等優(yōu)點，為蛋白質的有效純化提供了一條解決的途徑，廣泛應用于蛋白質結構與功能的研究及重組蛋白純化工藝的開發(fā)中。自從20世紀70年代中期融合標簽技術出現(xiàn)以來， 親和標簽已成為一種重組蛋白純化十分有效的工具，具有結合

3、特異性高、純化條件溫和、純化步驟簡便、適用性廣泛等顯著優(yōu)勢。通常，親和標簽定義為對特定的生物或化學配基具有高度親和力的一段氨基酸序列。到目前為止，已經(jīng)出現(xiàn)了種類眾多、功能各異、用途多樣的親和標簽，極大地促進了對重組蛋白的有效純化。根據(jù)自身分子量大小的不同，親和標簽可以分為兩大類：一類是結合固定化配基的短肽標簽，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tag等；另一類是識別小分子配基的蛋白標簽，如GST、MBP等。短肽標簽：His-tag：His標簽是目前高通量蛋白純化最普遍使用的親和標簽，廣泛用于多種重組蛋白在各種表達系統(tǒng)的表達與純化中。His標簽一般為515個組氨酸，被認為是重組蛋白

4、純化的首選標簽，具有以下優(yōu)點：（1）位于目標蛋白端的His標簽與細菌的轉錄翻譯機制相互兼容，利于蛋白的表達；（2）His標簽幾乎不影響目標蛋白的理化性質；（3）His標簽很小，不會改變目標蛋白的可溶性；（4）His標簽在目標蛋白結晶后對蛋白結構幾乎沒有影響；（5）采用固定化金屬離子親和層析純化His標簽融合蛋白時，其操作非常簡便?；谏鲜鰞?yōu)點，幾乎所有的大型結構基因組研究中心都把純化His標簽融合蛋白的固定化金屬離子親和層析（immobilized metal-ion affinity chromatography，IMAC）作為主要的蛋白純化方法。  然而，并不是所有的蛋

5、白質都可以與His標簽融合后，采用固定化金屬離子親和層析分離純化。宿主蛋白中含有半胱氨酸及天然發(fā)生的組氨酸豐富區(qū)域，在固定化金屬離子親和層析時可能會導致其他蛋白的非特異性結合；目標蛋白含有金屬離子，一般也不采用His標簽與固定化金屬離子親和層析。 FLAG-tag：除了His標簽外，另一個廣泛使用的小分子短肽標簽是FLAG標簽。FLAG標簽是由8個氨基酸（DYKDDDDK）組成的一個短肽，分子量很小，因而不會遮蓋融合蛋白中其他的蛋白表位與結構域，也不會改變融合蛋白的功能、分泌或運輸。該標簽具有天然的親水特性，很容易定位于融合蛋白的表面，便于利用抗體檢測；同時含有一個腸激酶切割位點（D

6、DDK），可以利用腸激酶切除標簽。FLAG標簽有3個特異性的單克隆抗體，分別為M1單抗、M2單抗、M5單抗。FLAG短肽合成成本較高，不適用于大規(guī)模純化，且需要額外步驟除去結合在層析介質上的短肽。Strep-tag ：與His-tag、FLAG-tag相似，Strep-tag 也是一個小分子的短肽標簽，廣泛用于多種目標蛋白在原核表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)等的表達與純化中。在自然界中，鏈霉親和素（streptavidin）與生物素（biotin）之間存在著非常強烈的非共價相互作用，其生物學上的解離常數(shù)極低；即使生物素與其他蛋白質共價結合之后，兩者仍可以相互作用。基于這兩者之間的強烈相互作用，

7、運用一系列蛋白質工程手段，通過對短肽文庫的篩選，第一個鏈霉親和素結合肽應運而生，即Strep-tag，極大地方便了重組蛋白的一步快速親和純化。然而，Strep-tag與鏈霉親和素結合時需要一個自由的羧基末端，因而該標簽只能位于目標蛋白的C端，限制了它的應用范圍。在Strep-tag的基礎上，通過對合成短肽的篩選，獲得了一個與其相似、由個氨基酸（WSHPQFEK）組成的鏈霉親和素結合肽，即Strep-tag，可以位于融合蛋白的任意位置，從而彌補了Strep-tag的不足。同時，通過對鏈霉親和素特定氨基酸的定向突變，獲得了與Strep-tag具有更高親和力的親和介質Strep-tactin，在St

8、rep-tag融合蛋白的親和純化中表現(xiàn)出良好的純化效果，且蛋白質產(chǎn)量較高，所需成本適中。Strep-tag系統(tǒng)的純化條件比較寬泛，在普通緩沖液下就可與strep-Tactin層析介質結合，使用2.5mmol/L的脫硫生物素就可將Strep-tag融合蛋白洗脫下來，螯合劑、去污劑、還原劑 及高達1mol/L的鹽均可加入到緩沖液中。此外，Strep-tag 在純化過程中不依賴金屬離子，十分適合含金屬離子蛋白質的純化。蛋白標簽：GST：GST標簽由211個氨基酸組成，大小約為26kDa，是目前廣泛用于重組蛋白融合表達與親和純化的一種蛋白標簽。大量的表達實驗發(fā)現(xiàn)，外源蛋白在大腸桿菌表達系統(tǒng)中過量表達時

9、，常會以包涵體的形式形成不溶性的聚合體，大大降低了可溶性重組蛋白的產(chǎn)量，增加了后續(xù)蛋白分離純化的難度。 然而，在融合GST標簽進行原核表達的過程中發(fā)現(xiàn)，原 本用于親和純化的GST標簽能在一定程度上增大融合蛋白的可溶性，使融合蛋白以可溶形式存在于細胞質中，不僅促進了目標蛋白的正確折疊，提高了蛋白產(chǎn)量，而且有助于后續(xù)的蛋白純化。除了增大融合蛋白的可溶性之外，GST標簽還具有高效的翻譯起始、純化條件溫和、親和樹脂成本相對低廉等顯著優(yōu)點，成為重組蛋白融合表達經(jīng)常使用的親和標簽。 MBP：MBP標簽由大腸桿菌K12的malE基因編碼的396個氨基酸組成，大小約為40kDa，是除了GST標簽之外

10、又一個很好的增大融合蛋白可溶性的蛋白標簽。MBP標簽能夠增大在原核表達系統(tǒng)中過量表 達的融合蛋白的可溶性，提高其表達量，已在多個表達實驗中得到確認。研究發(fā)現(xiàn)，當改變MBP“開放”與“關閉”構象之間的平衡時，MBP增大融合蛋白可溶性的能力將受到明顯影響，表明 MBP增大融合蛋白可溶性的特性是由其“開放”構象所介導；同時，對MBP配基結合間隙中保守的疏水性氨基酸殘基進行定向突變，MBP表現(xiàn)出相似的表型，表明這個配基結合間隙在MBP增大融合蛋白可溶性的機制中具有一定的作用。然而，從蛋白純化的角度來看，MBP標簽并不是一個最有效的親和標簽；在某些情況下，MBP標簽并不能特異性地與親和樹脂有效結合，親和

11、層析后融合蛋白的純度也并不合適。  自從上世紀70年代中期親和標簽融合技術出現(xiàn)以來，多種多樣的短肽或蛋白親和標簽極大地方便了外源表達重組蛋白的分離與蛋白質復合體的純化，已成為蛋白質研究領域不可或缺的工具。一般而言，一個完美的親和標簽應該具備以下特性：（1）能夠用于純 化任何表達宿主或表達系統(tǒng)所表達的重組蛋白；（2）可以位于目標蛋白的任意位置而不影響其結構；（3）增大目標蛋白的可溶性，促進其正確折疊，提高蛋白表達量；（4）便于重組蛋白的檢測。目前，商品化的親和標 簽已具備其中諸多特性，但性能更加優(yōu)越、純化效果更加顯著的親和標簽仍需不斷尋找與開發(fā)。 重組蛋白表達技術現(xiàn)

12、已經(jīng)廣泛應用于生物學各個具體領域。特別是體內功能研究和蛋白質的大規(guī)模生產(chǎn)都需要應用重組蛋白表達載體。美國GeneCopoeia的蛋白表達載體按照表達宿主的不同新推出3類，分別為表達宿主為大腸桿菌，哺乳動物細胞的，以及慢病毒載體，宿主可以為哺乳動物細胞和原代細胞。除了必要的復制和篩選的元件，協(xié)助表達和翻譯的元件外，本文將各類載體分別按照功能標簽的不同確定種類并將個標簽的功能初步介紹如下：His6：His6是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當某一個標簽的使用，一是能構成表位利于純化和檢測；二是構成獨特的結構特征（結合配體）利于純化。組氨酸殘基側鏈與固態(tài)的鎳有強烈的

13、吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對重組蛋白進行分離純化。使用His-tag有下面優(yōu)點：1.標簽的分子量小，只有0.84KD，而GST和蛋白A分別為26KD和30KD，一般不影響目標蛋白的功能；2.His標簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強的蛋白得到應用，后者在純化包涵體蛋白時特別有用，用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復性不受其它蛋白的干擾，或進行金屬螯和親和層析復性；3.His標簽融合蛋白也被用于蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA相互作用研究；4.His標簽免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫制備

14、抗體；5.可應用于多種表達系統(tǒng)，純化的條件溫和；6.可以和其它的親和標簽一起構建雙親和標簽。Flag:Flag標簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時載體中構建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統(tǒng)中表達效率更高。FLAG作為標簽蛋白，其融合表達目的蛋白后具有以下優(yōu)點：1.FLAG作為融合表達標簽，其通常不會與目的蛋白相互作用并且通常不會影響目的蛋白的功能、性質，這樣就有利用研究人員對融合蛋白進行下游研究。2.融合FLAG的目的蛋白，可以直接通過FLAG進行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高。3.FLAG作為標簽蛋白，

15、其可以被抗FLAG的抗體識別，這樣就方便通過Western Blot、ELISA等方法對含有FLAG的融合蛋白進行檢測、鑒定。4.融合在N端的FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此現(xiàn)FLAG標簽已廣泛的應用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關領域。MBP:MBP（麥芽糖結合蛋白）標簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP標簽可通過免疫分析很方便地檢測。有必要用位點專一的蛋白酶切割標簽。如果蛋白在細菌中表達，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。純化：融合蛋白可

16、通過交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。結合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進行洗脫。結合親和力在微摩爾范圍。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效結合，而其他融合蛋白則不受影響。 緩沖條件為pH7.0到8.5，鹽濃度可高達1M，但不能使用變性劑。如果要去除MBP融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。檢測：可用MBP抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。GST:GST(谷胱甘肽巰基轉移酶) 標簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶，它的天然大小為26KD。將它應用在原核表達的原因大致有兩個，一個是因為它是一個高度可溶的蛋白，希望可以利

17、用它增加外源蛋白的可溶性；另一個是它可以在大腸桿菌中大量表達，起到提高表達量的作用。GST融合表達系統(tǒng)廣泛應用于各種融合蛋白的表達，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。結合的融合蛋白在非變性條件下用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫。在大多數(shù)情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二體。GST標簽可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測。標簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。在大多數(shù)情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。純化：該表達系統(tǒng)表達的GST標簽蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathionesepharose)親和樹脂進行純化。GST標簽

18、蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會失去對谷胱甘肽樹脂的結合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強變性劑如：鹽酸胍或尿素等。如果要去除GST融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。檢測：可用GST抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。HAHA標簽蛋白，標簽序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的紅細胞凝集素表面抗原決定簇，9個氨基酸，對外源靶蛋白的空間結構影響小, 容易構建成標簽蛋白融合到N端或者C端。易于用AntiHA抗體檢測和ELISA檢測。c-MycC-Myc標簽蛋白，是一個含11個氨基酸的小標簽，標簽序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Se

19、r-Glu-Glu-Asp-Leu，這11個氨基酸作為抗原表位表達在不同的蛋白質框架中仍可識別其相應抗體。C-Myc tag已成功應用在 Western-blot雜交技術、免疫沉淀和流式細胞計量術中, 可用于檢測重組蛋白質在靶細胞中的表達。eGFP/eCFP/eYFP/mCherry分別是增強型綠色熒光蛋白/增強型黃綠色熒光蛋白/增強型黃綠色熒光蛋白/單體紅色熒光蛋白,具有不同的激發(fā)波長發(fā)射波長為，均由野生型熒光蛋白通過氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來。就eGFP而言，相對于GFP，其熒光強度更強、熒光性質更穩(wěn)定。同時載體中構建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表達系統(tǒng)中表達效率更高。

20、mCherry是從DsRed演化來的性能最好的一個單體紅色熒光蛋白，可以和GFP系列熒光蛋白共用，實現(xiàn)多色標記體內、外實驗表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白時，熒光蛋白活性和被融合的目標蛋白功能相互沒有明顯影響。 這些熒光標簽蛋白，其融合表達目的蛋白后具有以下優(yōu)點：1.不用破碎組織細胞和不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細胞中發(fā)出綠色熒光，實時顯示目的基因的表達情況，而且熒光性質穩(wěn)定，被譽為活細胞探針。2.其自發(fā)熒光，不需用目的基因的抗體或原位雜交技術就可推知目的基因在細胞中的定位等情況。3.同時細胞內的其它產(chǎn)物不會干擾標簽蛋白檢測，從而使其檢測更顯得快速、簡便、靈敏度高而且重

21、現(xiàn)性。4.其低消耗、高靈敏度檢測，十分適用于高通量的藥物篩選。因此現(xiàn)eGFP 表達標簽被廣泛地應用于基團表達調控、轉基因功能研究、蛋白在細胞中的功能定位、遷移變化及藥物篩選等方面。5.mCherry紅色熒光蛋白在標記病毒顆粒，研究病毒和宿主細胞之間更有得天獨厚的優(yōu)勢。如用mRFP或mCherry標記HIV病毒顆粒，研究H1V和宿主細胞問的相互作用以及HIV侵染宿主細胞的過程用mRFP標記慢病毒顆粒，研究慢病毒在小鼠體內的復制過程等。熒光素酶來源于生物體內的熒光素，常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia熒光素酶。這些熒光素酶作為“報告蛋白”被用于分子生物學研究中，這種技術被稱為報告

22、基因檢測法或螢光素酶檢測法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白標簽不同，使用熒光素酶構建的報告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究啟動子、miRNA 3'UTR克隆的功能與調控，因為它們對目的基因的調控可以是漸變的，而不是簡單的開和關兩種狀態(tài)。優(yōu)點：靈敏度高，檢測幅度寬；不是哺乳動物細胞內源性基因；重復性好；與HTS兼容等。螢火蟲和海腎熒光素酶已經(jīng)被廣泛應用于協(xié)同報告并進行均一化研究。由于它們都是快速，容易和高靈敏的監(jiān)測方法。而且螢火蟲和海腎熒光素酶是理想的雙基因報告系統(tǒng)，因為它們來源于不同的生物進化方向，蛋白結構和底物差異都很大，在實驗中不會產(chǎn)生相互影響。基于

23、熒光素酶的特性，我司研發(fā)提供的Secrete-Pair? Dual Luminescence Assay Kit可用于分析雙報告系統(tǒng)中Gaussia熒光素酶（GLuc）和分泌型堿性磷酸酶(SEAP)活性。GLuc 和SEAP均為分泌型報告蛋白，無需裂解細胞即可便捷的從細胞培養(yǎng)液中取得樣本，并對實驗結果進行精準的實時分析。Avi TagAviTag標簽蛋白是一個15 個氨基酸的短肽，具有一個單生物素化賴氨酸位點，與已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目標蛋白的N端和C端。融合表達后，可被生物素連接酶生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質分

24、離純化，還用于蛋白質相互作用研究。Avi Tag標簽系統(tǒng)具有以下幾大優(yōu)點:1.無論在體外或者體內，幾乎所有的蛋白都可以在一個獨特的Avi Tag位點輕易且有效地被生物素化；2.生物素化是通過酶和底物的反應來實現(xiàn)，反應條件相當溫和而且標記的專一性極高；3.生物素AviTag只有15個氨基酸，對蛋白空間結構的影響非常小。SNAP-TagSNAP-Tag是新一代的蛋白標簽技術，不僅專一性極高而且穩(wěn)定，最大的優(yōu)點是適用于多種環(huán)境下的蛋白質檢測與純化，如活細胞內、溶液中、或固態(tài)相(如SDS-PAGE gels)等。SNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）獲得。無論體內還是體外，SNAP-Tag都能與底物高特異性地共價結合，使蛋白標記上生物素或熒光基團（如熒光素和若丹明）。SNAP所帶的活性巰基位點接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側鏈苯甲基基團，釋放出了鳥嘌呤。這種新的硫醚鍵共價結合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團所帶的標記物。苯甲基鳥嘌呤在生化條件下穩(wěn)定，并且沒有其他蛋白會和這類物質作用，所以SNAP標簽反應是高特異的。檢測：生物素或各種顏色熒光的底物（如熒光素、若丹明）可滲透進入細胞，方便快捷地進行活細胞內SNA