植物原生質(zhì)體的分離與純化

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模?2 了解原生質(zhì)體在植物體細(xì)胞遺傳學(xué)上的意義。了解原生質(zhì)體在植物體細(xì)胞遺傳學(xué)上的意義。 1 學(xué)習(xí)植物原生質(zhì)體的分離和純化技術(shù)；學(xué)習(xí)植物原生質(zhì)體的分離和純化技術(shù)；實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理： 植物原生質(zhì)體即為去除了細(xì)胞壁的植物細(xì)胞。植物原生質(zhì)體即為去除了細(xì)胞壁的植物細(xì)胞。分離原生質(zhì)體的基本要求是獲得分離原生質(zhì)體的基本要求是獲得大量大量的的有活力有活力的原的原生質(zhì)體。去除細(xì)胞壁有兩種方法，機(jī)械法和酶法。生質(zhì)體。去除細(xì)胞壁有兩種方法，機(jī)械法和酶法。其中酶法是一種溫和、有效的方法，但是僅局限于其中酶法是一種溫和、有效的方法，但是僅局限于具有初生細(xì)胞壁的組織。植物的細(xì)胞壁由纖維素、具有初生細(xì)

2、胞壁的組織。植物的細(xì)胞壁由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和少量的蛋白質(zhì)和脂類組成的，半纖維素、果膠質(zhì)和少量的蛋白質(zhì)和脂類組成的，通常使用纖維素酶和果膠酶的混合酶液來分離原生通常使用纖維素酶和果膠酶的混合酶液來分離原生質(zhì)體。質(zhì)體。實(shí)驗(yàn)用品：實(shí)驗(yàn)用品： 用具：尼龍過濾網(wǎng)（用具：尼龍過濾網(wǎng)（400400目）、雙層漏斗、吸目）、雙層漏斗、吸管、離心管、顯微鏡、剪刀、鑷子、載玻片、蓋玻管、離心管、顯微鏡、剪刀、鑷子、載玻片、蓋玻片等。片等。 藥品：纖維素酶、果膠酶、藥品：纖維素酶、果膠酶、8%8%甘露醇甘露醇鹽鹽溶液、溶液、20%20%蔗糖蔗糖鹽鹽溶液等。溶液等。實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料： 菠菜、油菜等。菠菜、油菜

3、等。實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟： 1 取材：取材：選取選取充分伸展開充分伸展開的的幼嫩幼嫩葉片葉片，沖洗干，沖洗干凈。凈。 3 酶解：去除下表皮的葉片剪成小塊，鋪于酶酶解：去除下表皮的葉片剪成小塊，鋪于酶液中，液中，充分接觸充分接觸酶液。酶液。25253030酶解酶解1 11.5小時(shí)，期小時(shí)，期間可晃動(dòng)培養(yǎng)皿間可晃動(dòng)培養(yǎng)皿12次次。 4 純化：純化： 1 1）過濾：用雙層漏斗將原生質(zhì)體過濾到離心）過濾：用雙層漏斗將原生質(zhì)體過濾到離心管中。管中。 2 2）純化）純化- -漂浮法漂浮法：用比原生質(zhì)體比重大的：用比原生質(zhì)體比重大的20%20%蔗糖鹽溶液經(jīng)過離心后原生質(zhì)體漂浮在蔗糖溶液的蔗糖鹽溶液經(jīng)過離心后原

4、生質(zhì)體漂浮在蔗糖溶液的表面。（還有表面。（還有沉降法沉降法） 2 去下表皮：用鑷子將下表皮撕掉，讓葉肉細(xì)去下表皮：用鑷子將下表皮撕掉，讓葉肉細(xì)胞暴露，注意不要損傷細(xì)胞。胞暴露，注意不要損傷細(xì)胞。過濾后的液體進(jìn)行過濾后的液體進(jìn)行500rpm，3min離心，離心，收集原生質(zhì)體收集原生質(zhì)體 棄上清，沉淀用棄上清，沉淀用 2 ml 8%甘露醇鹽溶液甘露醇鹽溶液輕輕懸浮輕輕懸浮在一新離心管中加入在一新離心管中加入68 ml的的20%蔗糖鹽溶液，將原生蔗糖鹽溶液，將原生質(zhì)體懸浮液質(zhì)體懸浮液輕輕輕輕環(huán)加環(huán)加在蔗糖鹽溶液上面在蔗糖鹽溶液上面1000rpm，3min離心，離心，漂浮原生質(zhì)體漂浮原生質(zhì)體原生質(zhì)體在

5、蔗糖溶液上面形成原生質(zhì)體在蔗糖溶液上面形成綠環(huán)綠環(huán)，吸出原生質(zhì)體置于，吸出原生質(zhì)體置于另一離心管中另一離心管中再加入再加入8%甘露醇鹽溶液進(jìn)行甘露醇鹽溶液進(jìn)行洗滌洗滌23次次 5 鏡檢：將原生質(zhì)體懸浮液滴在載玻片上，輕鏡檢：將原生質(zhì)體懸浮液滴在載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，先在低倍鏡下找到原生質(zhì)體，再換輕蓋上蓋玻片，先在低倍鏡下找到原生質(zhì)體，再換成高倍鏡仔細(xì)觀察。成高倍鏡仔細(xì)觀察。實(shí)驗(yàn)報(bào)告：實(shí)驗(yàn)報(bào)告： 1 畫出在顯微鏡下看到的原生質(zhì)體的圖像；畫出在顯微鏡下看到的原生質(zhì)體的圖像； 2 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程中需要注意哪些問題？在整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程中需要注意哪些問題？結(jié)果與討論：結(jié)果與討論： 1 預(yù)期結(jié)果：完整的原生質(zhì)體形態(tài)上是圓球狀預(yù)期結(jié)果：完整的原生質(zhì)體形態(tài)上是圓球狀的，顏色鮮艷，富含細(xì)胞質(zhì)。的，顏色鮮艷，富含細(xì)胞質(zhì)。過過 濾濾 前前 的的 酶酶 解解 液液過過 濾濾 前前 的的 酶酶 解解 液液過過 濾濾 前前 的的 酶酶 解解 液液 2 討論：討論： 選擇合適的材料是實(shí)驗(yàn)成功的首要因素，選擇合適的材料是實(shí)驗(yàn)成功的首要因素，請問該實(shí)