蛋白表達、分離和純化

1、蛋白質的表達、分離、純化和鑒定來源：易生物實驗 瀏覽次數(shù)： 2704網(wǎng)友評論 0 條第一部分 蛋白質的表達、分離、純化 克隆基因在細胞中表達對理論研究和實驗應用都具有重要的意義。 通過表達能探索和研究基因的功能以及基因表達調(diào)控的機理，同時克隆基因表達出所編碼的蛋白質可供作 結構與功能的研究。第二部分 蛋白質的鑒定 電泳可用于分離復雜的蛋白質混合物，研究蛋白質的亞基組成等。在聚丙烯酰胺 凝膠電泳中，凝膠的孔徑，蛋白質的電荷，大小，性質等因素共同決定了蛋白質的電泳遷移率。關鍵詞：蛋白質蛋白質表達克隆基因聚丙烯酰胺凝膠電泳氯霉素?；D移酶十二烷基硫酸鈉 SDS 聚丙烯酰胺凝膠第一部分 蛋白質的表達、

2、分離、純化目的要求（1）了解克隆基因表達的方法和意義。（2）了解重組蛋白親和層析分離純化的方法。實驗原理克隆基因在細胞中表達對理論研究和實驗應用都具有重要的意義。 通過表達能探索和研究基 因的功能以及基因表達調(diào)控的機理， 同時克隆基因表達出所編碼的蛋白質可供作結構與功能 的研究。 大腸桿菌是目前應用最廣泛的蛋白質表達系統(tǒng)，其表達外源基因產(chǎn)物的水平遠高于其它基因表達系統(tǒng)，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌 總蛋白 量的 80% 。本實驗中，攜帶 有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌 BL21 中，在 37， IPTG 誘導下，超量表達攜帶有 6 個連續(xù)組氨酸殘基的重組氯霉素?；?轉移酶 蛋白，該蛋白可用一

3、種通過共價偶連的次氨基三 乙酸（ NTA ）使鎳離子（ Ni2+ ）固相化的層析介質加以提純，實為金屬熬合親和層析（ MC AC）。蛋白質的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。試劑和器材、試劑1 LB 液體培養(yǎng)基： Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用 蒸餾 水配至 1000mL.2 氨芐青霉素： 100mg/mL3 上樣緩沖液： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris , 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.04 Washing Buffer ：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Ur

4、ea, pH6.35 Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH 8.06 IPTG易生物儀器庫： .ebioe./yp/product-list-42.html易生物試劑庫： .ebioe./yp/product-list-43.html二、器材搖床，離心機 ，層析柱（ 110c m）操作方法一、氯霉素?；?轉移酶 重組蛋白的誘導1. 接種含有重組氯霉素?；D移酶蛋白的大腸桿菌 BL21 菌株于 5mL LB 液體培養(yǎng)基中 （含 100ug/mL 氨芐青霉素）， 37 震蕩培養(yǎng)過夜。2. 轉接

5、 1mL 過夜培養(yǎng)物于 100mL （含 100ug/mL 氨芐青霉素） LB 液體培養(yǎng)基中， 37 震 蕩培養(yǎng)至 OD600 = 0.6 - 0.8。取 10ul 樣品用于 SDS -PAGE 分析。3. 加入 IPTG 至終濃度 0.5 mmol/l, 37 繼續(xù)培養(yǎng) 1-3h.二、氯霉素?；D移酶重組蛋白的分離，純化1. NTA 層析柱的準備：在層析柱中加入 1mL NTA 介質，并分別用 8mL 去離子水， 8mL 上樣緩沖液洗滌。2. 重組蛋白的變性裂解： 在冰浴中凍融菌體沉淀， 加入 5mL 上樣緩沖液 , 用吸管 抽吸重懸， 超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品 60min,

6、 4 12000rpm 離心 30 min, 將上 清吸至一個干凈的容器中，并棄沉淀。取 10ul 上清樣品用于 SDS -PAGE 分析。3. 上清樣品以 10-15mL/h 流速上 Ni2+-NTA 柱，收集流出液，取 10ul 樣品用于 SDS-PA GE 分析。4. 洗脫雜蛋白：用 Washing Buffer 以 10-15mL/h 流速洗柱，直至 OD280 = 0.01. 分步收 集洗脫液，約 3-4h, 取 10ul 洗脫開始時的樣品用于 SDS-PAGE 分析。5. 洗脫目標蛋白：用 Elution Buffer 洗柱，收集每 1 mL 級分，分別取 10ul 樣品用于 SD

7、 S-PAGE 分析。第二部分 蛋白質的鑒定目的要求（1 ）了解 SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗原理。（2）掌握凝膠電泳實驗操作規(guī)程。實驗原理電泳可用于分離復雜的蛋白質混合物， 研究蛋白質的亞基組成等。 在聚丙烯酰胺凝膠電泳中， 凝膠的孔徑，蛋白質的電荷，大小，性質等因素共同決定了蛋白質的電泳遷移率。蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時， 它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。 但如果加入某種試劑使電荷因素消除， 則電泳遷移率就取決于分子的大小， 就可以 用電泳技術測定蛋白質的分子量。十二烷基硫酸鈉( SDS )就具有這種作用。在蛋白質溶 液中加入足夠量 SDS 和巰基乙醇， S

8、DS 可使蛋白質分子中的二硫鍵還原，蛋白質 SDS復合物帶上相同密度的負電荷， 并可引起蛋白質構象改變， 使蛋白質在凝膠中的遷移率， 不 再受蛋白質原的電荷和形狀的影響， 而取決于分子量的大小， 因此聚丙烯酰胺凝膠電泳可以 用于測定蛋白質的分子量。SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)系統(tǒng)中進行，其電泳漕緩沖液的 pH 值與離子強度 不同于配膠緩沖液。 該凝膠包括積層膠和分離膠兩部分。 當兩電極間接通電流后， 凝膠中形 成移動界面，并帶動加入凝膠的樣品中的 SDS 多肽復合物向前推進。樣品通過高度多孔性 的積層膠后，復合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶 (或稱積層)。 由于不連續(xù)緩沖系 統(tǒng)具

9、有把樣品中的復合物全部濃縮于極小體積的能力，從而大大提高了 SDS 聚丙烯酰胺凝 膠的分辨率，使蛋白依各自的大小得到分離。試劑和器材一、試劑1 30 Acr Bis 貯存液：30g Acr,0.8g Bis, 用無離子水溶解后定容至 100mL, 不溶物過濾 去除后置棕色瓶貯于冰箱。2 1.5mol/L Tris(pH8.8)3 10% (w/v) SDS4 10% 過硫酸銨： 4保存。5 TEMED6 3×SDS 凝膠加樣緩沖液： 50mmol/L Tris-HCl（pH6.8）, 300mmol/L DTT, 6% SDS, 0. 6% 溴酚藍， 30% 甘油7 5×T

10、ris- 甘氨酸電泳緩沖液： 15.1g Tris 堿，94g 甘氨酸（電泳級）， 50mL 10% SDS, 配至 1000mL.8 考馬斯亮藍染液： 0.25g 考馬斯亮藍 R250 溶于 90mL 甲醇：水（ 1： 1）和 10mL 冰乙 酸的混合液中。9 脫色液：水：乙酸：乙醇 = 6.7：0.8 ：2.5二、器材DYCZ-24D 型垂直板電泳槽 , 移液管 （1，5，10mL），燒杯（25，50，100mL ），細長頭 的吸管 ，微量注射器（ 10L或者 50L）。操作方法一、 SDS 聚丙烯酰胺凝膠的配置：1. 安裝玻璃板，檢查漏液情況。2. 制備分離膠：按表 1 分離膠所示，依次

11、在 試管 中混合各成分，一旦加入 TEMED 后，凝 膠馬上開始聚合， 故應立即快速懸動混合物， 迅速在兩玻板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液， 注 意流出積層膠所需空間。并在其上覆蓋一層水或異丁醇溶液。將凝膠垂直放置于室溫下。分離膠聚合后（約 30min ），倒出覆蓋層液體，用槍將殘留液體吸凈。制備濃縮膠： 按表 1 積層膠所示， 依次在 試管 中混合各成分， 一旦加入 TEMED 后，應立即快速懸動混合物， 迅速在分離膠上灌注濃縮膠溶液， 并立即在濃縮膠溶液中插入干凈 的電泳梳，小心避免混入氣泡。將凝膠垂直放置于室溫下。分離膠（ 5mL）水30%丙烯酰胺1.5M Tris （ PH8.8）10%S

12、DS10%過硫酸銨TEMED1.1mL2.5mL1.3mL50l50l2l濃縮膠（ 4mL）水30%丙烯酰胺1M Tris （ PH8.8）10%SDS10%過硫酸銨TEMED2.7mL0.67mL0.5mL40l40l4l二、上樣樣品的處理：將樣品置于 1×SDS凝膠加樣緩沖液中，在100 加熱 5min使蛋白質變性。加熱后 3000rpm 離心 1min.三、電泳：1. 濃縮膠聚合完全后（約 30min ），將凝膠固定于電泳裝置上，并加入Tris- 甘氨酸電泳緩沖液，然后小心移出電泳梳。2. 按預定順序加樣，小心緩慢加入樣品，每樣品加12ul 。3. 將電泳與電源相接，凝膠上所加電壓為 8V/cm, 當染料前沿進入分離膠后，把電壓提高到 15V/cm ，繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部（約4h ），然后關閉電源。4. 將玻璃板從電