HPLC Column 原理

1、 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 1UltimateTM Column for Ultimate Performance Welch Materials, Inc. UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 2色譜分離的基本原理色譜方法的分類色譜方法的分類 液相色譜分離方法大致可以分為正相色譜、反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜、體積排除色譜、親和色譜以及手性色譜。 在高效液相色譜法中，目前應(yīng)用得最廣泛的是正相色譜和反相

2、色譜，其中反相色譜又是重中之中。 色譜分離原理色譜分離原理 正相色譜的分離原理：根據(jù)溶質(zhì)極性的不同而產(chǎn)生的溶質(zhì)在吸附劑上吸附性強弱的差異而分離。 反相色譜的分離原理：根據(jù)因溶質(zhì)疏水性的不同而產(chǎn)生的溶質(zhì)在流動相與固定相之間分配系數(shù)的差異而分離。 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 3色譜分離效果圖 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 4高效液相色譜儀的分析原理 高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu) 色譜柱在高效液相色譜儀中的作用和峰形產(chǎn)生

3、原理高壓泵進(jìn)樣器檢測器色譜工作站色譜柱 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 5高效液相色譜柱發(fā)展史高效液相色譜柱發(fā)展史19世紀(jì)70年代中期，HPLC儀開始出現(xiàn)，主要填料：10 m 的無定型硅膠顆粒。70年代后期，發(fā)展了反相液相色譜。80年代，HPLC 被廣泛應(yīng)用于化合物的分離，主要填料：粒徑為5 10 m 球形硅膠。90年代早期，粒徑為 5 m 的高純硅膠，即所謂的 B 型硅膠被發(fā)展，并成為這個行業(yè)填料的標(biāo)準(zhǔn)，這種 B 型硅膠含有微量的金屬。90年代后期，為了滿足快速分離的需求，發(fā)展了 3 m 或 3.5

4、m 的球形硅膠，其作用和性能逐漸的獲得了人們的認(rèn)同和接受。21世紀(jì)早期，為適應(yīng)超快速的分離要求，粒徑小于 2 m 的填料被開發(fā)出來，發(fā)展出了整體柱、無機和有機雜化硅膠。目前，市場上流行的分析用的 HPLC 硅膠基質(zhì)填料主要為 B 型硅膠。 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 6HPLC色譜柱及其填料的特征 HPLC 色譜柱的基質(zhì)材料色譜柱的基質(zhì)材料 硅膠與聚合物 現(xiàn)代高效液相色譜填料的特征 色譜柱結(jié)構(gòu)色譜柱結(jié)構(gòu) 固定相固定相 鍵合相 色譜柱接頭 鍵合相穩(wěn)定性 UltimateTM Column for Ul

5、timate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 7硅膠基質(zhì)材料1.目前應(yīng)用最為廣泛的基質(zhì)材料。2.高機械強度和高的比表面積。3.可利用直接的廣泛的表面鍵合反應(yīng)來滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求。4.高效。5.重現(xiàn)性好。6.pH 適用范圍為pH 28。7.具有容易導(dǎo)致強堿性物質(zhì)拖尾的，表面活性和帶酸性的硅羥基。 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 8聚合物基質(zhì)材料交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。 pH 穩(wěn)定性好：pH 1 13?？梢栽诤軐挼姆秶鷥?nèi)進(jìn)行

6、表面化學(xué)處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體積排阻色譜的需求。在中等 pH 條件下對強堿性物質(zhì)具有更好的峰形。填料的體積隨著流動相的不同而改變，如膨脹或收縮。分離效率相對硅膠而言比較低重現(xiàn)性不好 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 9硅膠外形的影響無定型硅膠無定型硅膠: 最初的 HPLC 填料粒徑 5 m柱床穩(wěn)定性差比表面積較小價格便宜球形硅膠球形硅膠: 現(xiàn)代 HPLC 填料粒徑小 (5 m, 3 m, 2 m)重現(xiàn)性好 穩(wěn)定性好分離效率高 UltimateTM Column for Ulti

7、mate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 10硅膠純度的影響硅膠純度對強極性化合物的分離最重要。以前的純度較低的硅膠（稱為 A 型硅膠）, A 型硅膠是以金屬硅酸鹽制備而來，具有很高的金屬含量，可被用作中性化合物和非離子化合物的分離。純度高、酸性較弱的硅膠 (稱為 B 型硅膠)，這種硅膠是以無金屬的工藝制備而來，只含有微量的金屬，建議用于分離離子化合物和可電離的化合物，特別是堿性化合物。金屬雜質(zhì)引起對螯合劑和堿性化合物的分離產(chǎn)生不對稱峰或拖尾峰。 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http

8、:/ 11硅膠純度的影響M+表面金屬能與螯合化合物絡(luò)合 M Si OH 內(nèi)部的金屬對表面硅羥基具有活化作用強酸性A 型硅膠 C18B 型硅膠C18 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 12硅膠孔徑的影響孔徑作用和效能 60 nm對 HPLC 分析沒有用，會引起峰形拖尾和較低的分離效率60 150 nm對小分子的分離效果理想 (MW 1,000 nm對聚合物的分離效果理想，如DNA和生物大分子 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 htt

9、p:/ 13硅膠粒徑的影響粒 徑作 用 和 效 能5 m目前應(yīng)用最廣泛，可以滿足從分析到半制備的分離3 3.5 m常用于分析柱上的快速分離，色譜柱短，節(jié)省溶劑 2 m常應(yīng)用于超快速分離， high throughput, 分離度高7 10 m常用于半制備色譜柱10 20 m常用于制備色譜柱 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 14HPLC 色譜柱的構(gòu)成類 型內(nèi)徑D (cm)柱長(cm)粒徑 (m)分 析 柱0.3 0.463 - 253 - 10微 孔 柱0.1, 0.2115, 253 - 8半制備柱0.

10、8 1.010 - 255 - 20制 備 柱2.0 5.010 - 255 - 20 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 15鍵 合 相 鍵合相: 反相: 70%; C18, 65%; C8, 15%; Cyano, 5%, 苯基柱 5%, 正相: 20%; 硅膠、 -NH2、 -CN 其它 (手性柱, 離子交換柱): 10%反相色譜是目前應(yīng)用得最為廣泛的高效液相色譜方法。C18 和 C8 在反相色譜終應(yīng)用得最為廣泛。 UltimateTM Column for Ultimate Performance月

11、旭材料科技月旭材料科技 http:/ 16為什么反相色譜應(yīng)用如此廣泛?它能使中性化合物和極性化合物在一根色譜柱中得到分離。適用于多種基體中的多類不同性質(zhì)化合物的測定和分離。保留時間可以用分子的疏水性進(jìn)行描述和解釋。 所用高純度的水、甲醇和乙腈等溶劑價格便宜、實用。選擇性可通過用緩沖溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)（通過調(diào)節(jié)pH值來調(diào)節(jié)離子強度和膠團粒子大小等等），以實現(xiàn)最佳分離。 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 17封 尾封尾是用如三甲基硅烷等小分子與鍵合了C18以后的硅膠進(jìn)行進(jìn)一步的反應(yīng)。由于硅烷相對很大的體積，使得C1

12、8 和其它鍵合相在發(fā)生鍵合反應(yīng)時只能覆蓋不到硅膠表面的 50% 。硅膠表面未被鍵合的酸性硅羥基將會與被分析物相互作用，特別是在中性條件下會對強堿性化合物產(chǎn)生嚴(yán)重的峰形拖尾。封尾工藝使得表面殘余的硅羥基被進(jìn)一步的消除，為小分子所取代。封尾工藝能促使色譜柱對極性和堿性化合物的分離具有良好的峰形。 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 18評價色譜柱好壞的標(biāo)準(zhǔn) 1）理論塔板數(shù)N 2）拖尾因子Tf 3）色譜柱背壓 4) 色譜柱批與批之間的重現(xiàn)性 5）pH值的適用范圍 6）使用壽命 UltimateTM Column

13、for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 19理論塔板數(shù) N粒徑 (m)柱長 (cm)塔 板 數(shù) N10156,000-7,00010258,000-10,0005107,000-9,00051510,000-12,00052517,000-20,000356,000-7,00037.59,000-11,00031012,000-14,00031517,000-20,000 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 20拖尾因子TfAs = 1.0-1.05 很 好A

14、s = 1.2 一 般As = 2 差A(yù)s = 4 很差不對稱因子和拖尾因子的關(guān)系A(chǔ)s (at 10%)Tf (at 5%)1.01.02.0不對稱因子 (As) = BA A拖尾因子 (Tf) = A + B2A10% 峰高5% 峰高 UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 21色 譜 柱 背 壓1. 粒徑均一會使色譜柱的背壓相對較低。2. 色譜柱兩端的壓力降不應(yīng)超過公式計算所得的30。3. 硅膠粒徑對色譜柱的壓力具有很大的影響；硅膠粒子越小，色譜柱的背壓

15、越大。4. 色譜柱的背壓還與流動相的粘度有關(guān)。P = 3000Lt0dp2P 是色譜柱背壓 (psi)，L 是色譜柱的長度 (cm), 流動相的粘度 (cP)， t0 是色譜柱死時間, dp 是粒子的直徑 (m) UltimateTM Column for Ultimate Performance月旭材料科技月旭材料科技 http:/ 22為什么色譜柱會失去分離能力?部分原因是色譜柱塞板或柱床被堵塞 導(dǎo)致色譜柱背壓上升、峰形拖尾和柱效下降。吸附了樣品雜質(zhì) 導(dǎo)致柱效下降、選擇性和保留時間改變。色譜柱沒裝填好 導(dǎo)致柱效下降和峰形拖尾。物理損傷或受熱引起的缺口 導(dǎo)致柱效下降和峰形拖尾。對硅膠基質(zhì)或鍵合相的化學(xué)腐蝕 導(dǎo)致選擇性變?nèi)酢⒎逍瓮衔?、保留能力下降（或?qū)A性化合物的保留能力增強）。 Ultimat