第九章同位素示蹤技術(shù)

1、第九章 同位素示蹤技術(shù)在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究中的應(yīng)用第一節(jié) 同位素示蹤技術(shù)的原理與方法簡(jiǎn)介同位素示蹤是除能量平衡、物質(zhì)平衡（C、N）試驗(yàn)及相關(guān)的化學(xué)分析技術(shù)之外的另一類(lèi)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)的重要研究方法。同位素示蹤主要應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)動(dòng)態(tài)代謝過(guò)程的觀察，這方面的研究用常規(guī)技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)。諸如食糜流通量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等方面的研究，常規(guī)研究手段也可以實(shí)現(xiàn)，但應(yīng)用同位素示蹤技術(shù)可以提高測(cè)定的準(zhǔn)確性、減少對(duì)動(dòng)物的外科手術(shù)處理、重復(fù)利用相同的動(dòng)物或得到更多的信息。另外，同位素研究還是礦物質(zhì)代謝研究的重要手段。雖然同位素示蹤技術(shù)的應(yīng)用受到對(duì)儀器設(shè)備條件要求較高的限制，但其獨(dú)特的優(yōu)越性已使其得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。一. 同位素

2、示蹤技術(shù)的原理同位素示蹤技術(shù)在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究中的用途廣泛。如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、食糜的流通量測(cè)定、菌體蛋白合成、體組織的合成與分解、器官代謝、礦物質(zhì)代謝乃至能量代謝和體成分估測(cè)等均可應(yīng)用不同的同位素示蹤技術(shù)實(shí)現(xiàn)。這些同位素示蹤技術(shù)均利用了同位素原子化學(xué)性質(zhì)相同、物理性質(zhì)不同的特點(diǎn)，通過(guò)示蹤原子位置、數(shù)量的變化觀察物質(zhì)的代謝。在方法原理上主要有以下三個(gè)方面。這些原理的組合運(yùn)用形成了各種技術(shù)方法。 同位素稀釋?zhuān)喝鐪y(cè)定某種代謝物在代謝池中的總量，在無(wú)法測(cè)定代謝池總?cè)萘康那闆r下，向代謝池中注入一定數(shù)量的同位素標(biāo)記代謝物，取得代表性樣品后測(cè)定同位素富集度（比活度），可以計(jì)算出池中代謝物總量。假設(shè)使用穩(wěn)

3、定性同位素標(biāo)記的代謝物進(jìn)行示蹤。注入代謝物的該同位素富集度（某同位素量/代謝物中該元素總量）為，代謝物注入量為；代謝池中代謝物中該同位素的富集度為，代謝物總量為；注入示蹤物后代謝池的同位素富集度為。其中、為已知量，、為可測(cè)量，求。 則：同時(shí)測(cè)定池中代謝物的濃度，可以求出代謝池的容積。 物質(zhì)代謝動(dòng)力學(xué)分析：動(dòng)物體內(nèi)代謝池中的代謝物一般處于動(dòng)態(tài)變化之中，向代謝池中注入示蹤物，測(cè)定池內(nèi)和流出代謝池的示蹤物變化以反映物質(zhì)的代謝。相關(guān)的測(cè)定技術(shù)及數(shù)學(xué)計(jì)算方法稱(chēng)為動(dòng)力學(xué)分析。代謝動(dòng)力學(xué)分析一般要求代謝池處于恒態(tài)或準(zhǔn)恒態(tài)代謝狀態(tài)，在反芻動(dòng)物一般通過(guò)連續(xù)飼喂和盡可能減少環(huán)境對(duì)動(dòng)物的刺激來(lái)實(shí)現(xiàn)。示蹤物的注入方法

4、分一次性注入和恒速連續(xù)注入兩種，采樣方法則分為代謝池內(nèi)同位素達(dá)到穩(wěn)定后采樣和按時(shí)間序列采樣兩種。試驗(yàn)之前，首先需要根據(jù)研究目的確定代謝池的數(shù)量、之間的關(guān)系和各代謝池的含義，即建立房室模型，其次確定示蹤物的注入量、注入方法及采樣點(diǎn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析方法的復(fù)雜程度隨房室數(shù)量、示蹤物注入方式、采樣方式的不同而有很大差別。有關(guān)問(wèn)題將在后續(xù)內(nèi)容討論。 微量成份代謝：礦物質(zhì)元素，尤其是微量元素在飼料及體組織中的含量很小，在樣品量較小，化學(xué)分析的靈敏度不足的研究中，需要利用放射性測(cè)量靈敏度高的特點(diǎn)。二. 同位素示蹤技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和局限性同位素示蹤技術(shù)除具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)外，應(yīng)用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的最大優(yōu)點(diǎn)是可以分別觀

5、測(cè)代謝物的合成與分解過(guò)程，進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。如利用化學(xué)分析方法只能測(cè)定血糖的含量，而利用同位素示蹤的方法可以測(cè)定出血糖產(chǎn)生與消失的速度。其次一些利用傳統(tǒng)方法必須進(jìn)行屠宰測(cè)定的研究，利用同位素示蹤技術(shù)可以在相同的試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。同位素示蹤技術(shù)的局限性主要有以下幾個(gè)方面： 需要經(jīng)過(guò)特殊訓(xùn)練專(zhuān)業(yè)人員的協(xié)助：放射性標(biāo)記物的操作、放射性防護(hù)、放射性測(cè)量以及穩(wěn)定性同位素的測(cè)量均屬專(zhuān)門(mén)技術(shù)，有關(guān)人員需要經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)的訓(xùn)練。很難要求從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的專(zhuān)業(yè)人員同時(shí)具備這些方面的專(zhuān)業(yè)能力，因此具備同位素示蹤研究能力的實(shí)驗(yàn)室一般配備專(zhuān)業(yè)人員。 對(duì)設(shè)備、設(shè)施條件要求較高：進(jìn)行放射性操作要求實(shí)驗(yàn)室符合安全防護(hù)條件。放射性

6、測(cè)量及穩(wěn)定性同位素測(cè)量?jī)x器結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價(jià)格較高。在一定程度上限制了同位素示蹤技術(shù)的應(yīng)用。 試驗(yàn)費(fèi)用較高：放射性、穩(wěn)定性同位素的價(jià)格及樣品分析費(fèi)用較高是造成同位素示蹤試驗(yàn)費(fèi)用較高的主要原因。但同位素標(biāo)記物的用量較少，同位素示蹤的試驗(yàn)費(fèi)用在一般科研項(xiàng)目的承受范圍之內(nèi)。國(guó)內(nèi)同位素示蹤技術(shù)應(yīng)用較少的主要原因是實(shí)驗(yàn)室條件不足和對(duì)同位素示蹤技術(shù)的了解不夠。三. 原子核物理的基本概念 原子、原子核、核素：自然界中的所有物質(zhì)均是由元素組成的，組成元素的基本單位是原子。原子由原子核和核外電子構(gòu)成。原子的質(zhì)量很輕，約為g。原子的質(zhì)量用原子質(zhì)量單位表示，1的絕對(duì)質(zhì)量是原子質(zhì)量的十二分之一，即g。核外電子帶負(fù)電，每個(gè)電

7、子的質(zhì)量為0.000549。原子核由質(zhì)子和中子組成，質(zhì)子帶正電，帶電量與電子相等，中子不帶電。原子核的質(zhì)子數(shù)與核外電子數(shù)相等，因此原子呈電中性。質(zhì)子的質(zhì)量為1.007276，中子的質(zhì)量為1.008665，因此原子的質(zhì)量主要集中在原子核。質(zhì)子與中子數(shù)的和稱(chēng)為核子數(shù)，核子數(shù)與質(zhì)子數(shù)決定了原子核的基本特征，通常表示不同元素的原子核，稱(chēng)為核素。其中A為核子數(shù)，Z為質(zhì)子數(shù)，X為所屬元素的名稱(chēng)。元素在元素周期表中的位置是由核外電子數(shù)（亦即質(zhì)子數(shù)）決定的，核子數(shù)不同而質(zhì)子數(shù)相同的原子屬于同一種元素，由于處于元素周期表的同一位置，習(xí)慣上稱(chēng)它們?yōu)橥凰亍?放射性同位素、穩(wěn)定性同位素：原子核是否穩(wěn)定完全決定于內(nèi)在

8、因素。原子核內(nèi)存在質(zhì)子之間的靜電斥力和核子之間的核力。核力是核子（質(zhì)子、中子）之間的相互吸引力，與電荷無(wú)關(guān)，強(qiáng)度為電磁力的倍，作用距離只有cm。作用距離超出這一數(shù)量級(jí)時(shí)，核力很快減小近于零，是一種“短程力”。核力具有飽和性，即一個(gè)核子只與附近的幾個(gè)核子起作用，而不與所有核子起作用。存在核力的任意兩個(gè)核子之間的核力大小大致相等。質(zhì)子之間的靜電斥力是長(zhǎng)程力，斥力的大小與質(zhì)子間距離的平方呈反比。原子核的穩(wěn)定性與核子數(shù)和質(zhì)子與中子的比例有關(guān)，不穩(wěn)定的原子核總是自發(fā)地向穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)變，這一過(guò)程稱(chēng)為核衰變。發(fā)生核衰變時(shí)，原子核放射出帶電或不帶電的粒子，因此核衰變又稱(chēng)為放射性核衰變。不穩(wěn)定的核素稱(chēng)為放射性核素

9、，穩(wěn)定的核素稱(chēng)為穩(wěn)定性核素，相對(duì)于其同位素分別稱(chēng)為放射性同位素和穩(wěn)定性同位素。 放射衰變類(lèi)型：放射衰變得類(lèi)型很多，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究中常用核素的衰變主要有五種，即衰變、衰變、衰變、衰變及電子俘獲。3.1 衰變：放射性核素放射出粒子而變成另一種核素的過(guò)程稱(chēng)為衰變。粒子實(shí)際上是氦原子核（）。由一種核素放射出的粒子的能量是單一的，但伴有射線的衰變核素常常放射出不止一種能量的粒子。粒子的能量大都在48MeV之間，最大可達(dá)10MeV。發(fā)生衰變的天然核素的原子序數(shù)一般大于82，人工放射性核素很少有發(fā)生衰變的。3.2 衰變：放射性核素的一個(gè)中子轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)質(zhì)子，同時(shí)放射出粒子的過(guò)程稱(chēng)為衰變。粒子實(shí)際上是電子，為了與

10、核外電子區(qū)別，也寫(xiě)成。衰變的生成物有三種，比母體核原子序數(shù)大1的子體核、粒子和中微子。核衰變釋放出來(lái)的能量由三者共同帶走，且能量在三者之間的分配方式不固定，因此放射出的粒子的能量在最大值（接近于衰變能）和最小值（接近于零）間形成連續(xù)的能譜。3.3 衰變：放射性核素的一個(gè)質(zhì)子變成一個(gè)中子并放射出粒子。粒子實(shí)質(zhì)上是正電子，質(zhì)量、電荷與電子相同，只是帶正電。衰變的產(chǎn)物是較母體核原子序數(shù)小1的子體核、粒子和中微子。的能量也是一個(gè)連續(xù)能譜。3.4 電子俘獲（EC）：不穩(wěn)定核素俘獲一個(gè)核外繞行電子，核內(nèi)的一個(gè)質(zhì)子轉(zhuǎn)變成中子和中微子。電子俘獲過(guò)程只產(chǎn)生一個(gè)中微子，因而具有單一的能量。許多產(chǎn)生電子俘獲的放射性

11、核素同時(shí)也產(chǎn)生衰變，如；也有一些能同時(shí)產(chǎn)生衰變，如；還有少數(shù)核素能同時(shí)產(chǎn)生電子俘獲、衰變和衰變。3.5 衰變：處于激發(fā)態(tài)的原子核通過(guò)放射出射線回到基態(tài)的衰變方式稱(chēng)為衰變。射線是一種電磁輻射，不帶電荷。衰變前后核素的原子序數(shù)和核子數(shù)不發(fā)生變化，僅能量狀態(tài)不同。原子序數(shù)和核子數(shù)相同，能量狀態(tài)不同的核素稱(chēng)為同質(zhì)異能素。射線的能量是不連續(xù)的，一個(gè)核衰變可能放射出幾種不同能量的射線。 放射性核衰變的一般規(guī)律4.1 衰變定律：設(shè)放射性原子核的初始數(shù)目為，經(jīng)過(guò)t時(shí)刻后剩余的放射性原子核數(shù)目為，則兩者之間符合以下關(guān)系： (1)設(shè)初始的放射性強(qiáng)度為，t時(shí)刻后的放射性強(qiáng)度為，兩者之間存在相同的關(guān)系，即： (2)以

12、上關(guān)系稱(chēng)為衰變定律，其中是衰變常數(shù)。4.2 半衰期、平均壽命、放射強(qiáng)度單位：半衰期（）是指放射性核素的數(shù)量減少到初始數(shù)量一半所需的時(shí)間，此時(shí)。由（1）式可以推導(dǎo)出：(3)經(jīng)過(guò)n個(gè)半衰期后，放射強(qiáng)度與初始放射強(qiáng)度的關(guān)系為： (4)平均壽命（T）是指放射性原子核在衰變前的平均存在時(shí)間，由（1）式可以推導(dǎo)出： (5)4.3 放射強(qiáng)度單位：放射強(qiáng)度是用單位時(shí)間內(nèi)衰變的次數(shù)來(lái)度量的。1971年第十四屆國(guó)際計(jì)量大會(huì)通過(guò)的放射強(qiáng)度計(jì)量單位是“貝克勒爾”，簡(jiǎn)寫(xiě)為Bq。1Bq1次衰變/秒。由于歷史的原因，習(xí)慣上還用“居里”（ci）作為放射強(qiáng)度單位。1ci是指1g鐳每秒鐘的衰變數(shù)，即次。由于居里的單位比較大，常用

13、毫居里（mci）和微居里（ci），單位大小依次遞減1000倍。另外還用衰變數(shù)/秒（dps）或衰變數(shù)/分（dpm）表示放射強(qiáng)度。放射強(qiáng)度大小顯然與放射性核素的數(shù)量和核素的衰變常數(shù)有關(guān)。因此由放射性物質(zhì)的質(zhì)量和半衰期可以計(jì)算出其放射強(qiáng)度。已知放射性物質(zhì)的質(zhì)量m和其原子量M，則放射性核素的數(shù)量N為， 為阿佛加德羅常數(shù)由（3）式，（1）式的微分方程為，而是單位時(shí)間衰變得原子核數(shù)，即放射強(qiáng)度，亦即放射強(qiáng)度，因此有： (6)在研究物質(zhì)代謝的同位素示蹤試驗(yàn)中，經(jīng)常使用比活度（specific activity, SA）的概念。其含義是樣品中作為示蹤物的放射性同位素原子與被示蹤的穩(wěn)定性同位素原子的數(shù)量比。由于

14、放射性同位素的放射強(qiáng)度與與放射性同位素原子數(shù)之間是線性關(guān)系，且所研究化合物中標(biāo)記原子數(shù)與分子數(shù)之間的比例是固定的，因此一般用單位質(zhì)量標(biāo)記化合物的放射強(qiáng)度表示其比活度，如dpm/mg等。表91 常用放射性核素半衰期核素符號(hào)半衰期放射 強(qiáng)度（ci）核素符號(hào)半衰期放射 強(qiáng)度（ci）氫312.4年鍶9019.9年碳1120.5分碘1318.1天碳145700年銫1342.3年鈉2415小時(shí)鋇13112天硫3587.1天鉈2044年磷3214.3天釙210138.4天鉀401.3×104年錳562.8小時(shí)鉀4212.4小時(shí)鉻5127.7天鈣45164天銅6412.7小時(shí)鐵5945.1天鋅652

15、43.8天鈷605.24年鉬9966.2小時(shí)鍶8953天釕10339.35天四. 放射性測(cè)量方法核輻射探測(cè)器的種類(lèi)繁多，從制作原理上大致分為以下幾類(lèi)： 利用射線通過(guò)物質(zhì)時(shí)產(chǎn)生的電離效應(yīng)進(jìn)行探測(cè)。包括電離室、正比計(jì)數(shù)器、G-M計(jì)數(shù)器、半導(dǎo)體探測(cè)器、熱釋光劑量?jī)x等。 利用射線通過(guò)物質(zhì)時(shí)激發(fā)熒光的效應(yīng)探測(cè)。如閃爍計(jì)數(shù)器、熒光玻璃劑量?jī)x、契倫科夫計(jì)數(shù)器等。 利用射線作用于物質(zhì)引起的化學(xué)變化探測(cè)。如X光底片、核乳膠、膠片劑量?jī)x等。 利用射線通過(guò)飽和蒸汽或過(guò)熱液體產(chǎn)生電離，蒸汽或液體在粒子路徑上凝結(jié)，顯示出粒子徑跡的方法探測(cè)。如云霧室、氣泡室等。 利用射線通過(guò)物體時(shí)產(chǎn)生的熱效應(yīng)探測(cè)。在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究中常用氣

16、體探測(cè)器和閃爍探測(cè)器。氣體探測(cè)器是利用射線經(jīng)過(guò)高壓電場(chǎng)中氣體時(shí)引起氣體電離，產(chǎn)生電流進(jìn)行測(cè)量。閃爍探測(cè)器包括固體閃爍計(jì)數(shù)器和液體閃爍計(jì)數(shù)器，均利用射線引起某些物質(zhì)發(fā)出熒光進(jìn)行測(cè)量。其中液體閃爍測(cè)量時(shí)，放射性樣品與閃爍液混合在一起，靈敏度高、樣品容量大，特別適合、等低能輻射體的測(cè)量。五. 穩(wěn)定性同位素的測(cè)量一種元素可以有幾種不同的穩(wěn)定性核素，它們的原子序數(shù)相同，中子數(shù)不同，互稱(chēng)為穩(wěn)定性同位素。一種穩(wěn)定性同位素原子數(shù)在同位素混合物種所占的比例稱(chēng)為富集度（abundance），用百分?jǐn)?shù)表示。如自然界中的富集度是99.985，表示在自然界中存在的所有氫元素中，99.985是形式的。自然界中某種元素的同

17、位素富集度稱(chēng)為自然富集度（natural abundance）。表92 常用穩(wěn)定性同位素元素穩(wěn)定性同位素自然富集度元素穩(wěn)定性同位素自然富集度氫99.985鐵5.820.01591.66碳98.892.191.110.33氮99.63鋅48.890.3727.81氧99.764.110.03718.570.2040.62硫95.0硒0.870.769.024.227.58硅92.2123.524.9049.823.099.19穩(wěn)定性同位素是根據(jù)同位素間質(zhì)量的不同來(lái)探測(cè)的，相應(yīng)的分析儀器稱(chēng)為質(zhì)譜儀。質(zhì)譜儀的種類(lèi)很多，大多不是以定量分析為目的設(shè)計(jì)的。物質(zhì)代謝的同位素示蹤研究中需要對(duì)同位素或同位素的比

18、例進(jìn)行定量測(cè)定，使用的測(cè)定儀器主要有兩種：氣相同位素比質(zhì)譜儀（gas isotope- ratio mass spectrometry, IRMS）和四極氣相色譜質(zhì)譜儀（quadrupole gas chromatograph- mass spectrometer, GCMS）。兩種儀器均是對(duì)同位素的比例進(jìn)行測(cè)定，雖然在測(cè)定技術(shù)上有明顯差別，但基本測(cè)定原理相同。樣品通過(guò)閥門(mén)以氣體形式引入真空腔（電子發(fā)射源），也有以用固體或液體形式引入的，但這種設(shè)計(jì)一般不用于同位素比例的測(cè)定。樣品在發(fā)射源中被離子化，然后進(jìn)入質(zhì)量過(guò)濾器（分析器）中。在分析器中，無(wú)論樣品以何種形式引入發(fā)射源，均為氣態(tài)。有不同形式的

19、分析器，但各種分析器均根據(jù)質(zhì)荷比（）分離各種離子。分開(kāi)的離子分別被探測(cè)器（detector）收集，在這里離子流打到金屬板上脫去電荷，形成可測(cè)電流。目前的探測(cè)器已達(dá)到很高的靈敏度，以至可以探測(cè)到單個(gè)離子。打到探測(cè)器上的離子數(shù)與產(chǎn)生信號(hào)的幅度直接相關(guān)。如質(zhì)量為44的和質(zhì)量為45的可分別形成離子流。測(cè)定輸出信號(hào)的幅度大小，可以計(jì)算出含有兩種不同C同位素的比例。同位素的富集度可由質(zhì)譜儀測(cè)定出的同位素比計(jì)算。樣品的同位素富集度通常表示為。如果測(cè)定出的樣品同位素比是，參比氣體的同位素比是，由下式計(jì)算： （7）上式的含義是：樣品中的某種同位素的比例相當(dāng)于向含有1000個(gè)該同位素的參比氣體中加入個(gè)同位素原子后

20、達(dá)到的比例。用于代謝動(dòng)力學(xué)研究不方便，常用的富集度表示方法是原子百分超 （atom percent atom excess，APE）。APE的定義如下： (8)上式的含義是：向元素的同位素混合物中加入一定量的某種同位素，加入的同位素原子數(shù)占加入同位素原子數(shù)與原同位素混合物中非該同位素的其它同位素原子數(shù)之和的百分比。和APE的含義均與放射性同位素示蹤中使用的術(shù)語(yǔ)比活度（specific activity, SA）不同。SA的含義是放射性標(biāo)記的示蹤分子與被示蹤分子的比例，穩(wěn)定性同位素示蹤的富集度與之含義相同的表達(dá)是加入示蹤物后樣品的同位素比與加入示蹤物前樣品同位素比之差：標(biāo)記物/被示蹤物（trac

21、er/tracee，R） （9）第二節(jié) 物質(zhì)代謝動(dòng)力學(xué)分析在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究中，出于不同的研究目的，有時(shí)需要測(cè)定某種代謝物產(chǎn)生和（或）消失的速度，以及轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌a(chǎn)物的比例。如測(cè)定瘤胃中VFA的產(chǎn)生與消失速度、體內(nèi)氨基酸在合成蛋白質(zhì)與分解之間的分配等。這類(lèi)問(wèn)題需要對(duì)代謝的動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行觀察，通稱(chēng)為物質(zhì)代謝動(dòng)力學(xué)研究。根據(jù)研究對(duì)象的不同，首先建立問(wèn)題的房室模型。根據(jù)房室的數(shù)量，模型可分為單室模型和多室模型；根據(jù)物質(zhì)代謝是否處于恒態(tài)（產(chǎn)生與消失速度相等，濃度不變），又分為恒態(tài)和非恒態(tài)模型。最簡(jiǎn)單的模型是恒態(tài)單室模型。如在連續(xù)飼喂條件下測(cè)定瘤胃中某種VFA的產(chǎn)生、消失速度，測(cè)定血液葡萄糖的合成、分解速度等均

22、可采用恒態(tài)單室模型。一單室模型分析 連續(xù)注入（constant infusion）示蹤物時(shí)的恒態(tài)單室模型以測(cè)定恒態(tài)代謝下瘤胃乙酸的產(chǎn)生速度為例說(shuō)明連續(xù)注入示蹤物時(shí)恒態(tài)單室模型的有關(guān)計(jì)算問(wèn)題。為了測(cè)定瘤胃乙酸的產(chǎn)量，建立以下模型： 圖91 測(cè)定瘤胃乙酸合成速度的恒態(tài)單室模型為瘤胃液中乙酸分子總量；是瘤胃液體積；、分別是乙酸合成和消失的速度，單位是個(gè)分子/min.。定義速度常數(shù)。恒態(tài)代謝條件下，、可認(rèn)為不變，此時(shí)、用質(zhì)量/時(shí)間單位（如mg/min.、摩爾數(shù)/min.），用質(zhì)量單位（如mg）表示不改變值。而用濃度單位（如mg/ml）時(shí)速度常數(shù)變?yōu)?。向瘤胃液中以穩(wěn)定的速度注入放射性標(biāo)記的乙酸，如14C

23、乙酸。相對(duì)于乙酸的產(chǎn)生速度，注入14C乙酸很小，一般不致影響和值，可以認(rèn)為這兩個(gè)參數(shù)未因注入標(biāo)記物而改變。經(jīng)過(guò)t時(shí)刻的14C乙酸注入后，瘤胃液中14C乙酸的分子數(shù)量為，14C乙酸從瘤胃液中消失的速度為。14C乙酸與瘤胃中合成乙酸的化學(xué)性質(zhì)、吸收性質(zhì)相同，具有相同的值。則與之間存在以下關(guān)系： (10)剛開(kāi)始注入標(biāo)記乙酸，隨注入的持續(xù)進(jìn)行而增加，則隨的增加而增加，直至，即標(biāo)記乙酸的消失速度與注入速度相等，達(dá)到穩(wěn)定，此時(shí)稱(chēng)為同位素平衡（isotopic equilibrium）。以、表示同位素平衡后瘤胃液中標(biāo)記乙酸的分子數(shù)和消失速度，對(duì)于瘤胃液中注入的標(biāo)記乙酸和合成的乙酸，分別存在以下關(guān)系：對(duì)于注入

24、的標(biāo)記乙酸 (11)對(duì)于合成的乙酸 (12)(11)與(12)式兩端分別相除，得：(13)是同位素平衡后瘤胃液中注入的標(biāo)記乙酸與合成乙酸的比例，即比活度。由(13)式，乙酸的合成速度由下式計(jì)算： (14)試驗(yàn)中，標(biāo)記乙酸的注入速度通常以dpm/min.為單位，達(dá)到同位素平衡后取數(shù)個(gè)瘤胃液樣品，測(cè)定樣品的比活度樣，試驗(yàn)前取瘤胃液樣品測(cè)定背景的比活度背景，（14）式中的由樣背景得出。樣品比活度的測(cè)定一般是測(cè)定待測(cè)樣品中乙酸的濃度和一定數(shù)量樣品的放射強(qiáng)度，計(jì)算出每毫克乙酸的放射強(qiáng)度（dpm/mg）。由此得出的比活度與的定義有差別，放射強(qiáng)度與14C乙酸分子數(shù)的數(shù)量關(guān)系是固定的，因此dpm可視為14C乙

25、酸分子數(shù)的單位，但由濃度與體積成績(jī)得出的測(cè)定樣品中乙酸的含量包括了14C乙酸，因此實(shí)際得出的應(yīng)是14C乙酸與樣品中乙酸分子總數(shù)的比例P，在14C乙酸的比例很小的情況下與比活度值的差別可忽略。從以下的推導(dǎo)可以看出，用注入前后樣品的P之差計(jì)算的較之用比活度差計(jì)算更接近真實(shí)的。對(duì)于某一樣品，其值與比活度的關(guān)系如下： (15)設(shè):注入14C乙酸之前瘤胃液中乙酸的比活度為，14C乙酸在乙酸中的分子數(shù)比為；達(dá)到同位素平衡后瘤胃液中乙酸的比活度和14C乙酸的比例分別為和；注入瘤胃的乙酸的比活度和14C乙酸的比例分別為和；如注入的乙酸中只有14C乙酸，則為，為1。用于分析的樣品中含有m個(gè)乙酸分子，其中來(lái)自注入

26、和瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸分子數(shù)分別為和?？梢越⒁韵路匠蹋?解以上聯(lián)立方程，求出和： 中14C乙酸的分子數(shù)為：按照（13）中的含義，即： 注入乙酸中主要是14C乙酸，大大高于，因此： （16）按（15）式，將換為： 將分母中、忽略后才有。因此使用（16）式更為準(zhǔn)確。下面給出描述開(kāi)始注入14C乙酸后，瘤胃液中乙酸比活度隨時(shí)間變化的數(shù)學(xué)公式。 , ,圖92 推導(dǎo)乙酸比活度隨時(shí)間變化的模型其中：、為瘤胃中乙酸的合成速度，為速度常數(shù)，為瘤胃液中合成的乙酸量，為瘤胃液中乙酸的濃度，為瘤胃液的表觀體積，為時(shí)刻t瘤胃液中注入的14C乙酸量瘤胃液中14C乙酸的數(shù)量隨時(shí)間變化的微分方程為：，屬一階非齊線性方程，通式

27、為，通解為。微分方程的解為： 當(dāng)t=0時(shí)，0，帶入上式得。因此： (17)由定義：，且，代入（17）式得： (18)；其中。 一次注入（bolus injection）示蹤物時(shí)的恒態(tài)單室模型仍以瘤胃乙酸產(chǎn)生速度的測(cè)定為例，向瘤胃中一次性注入一定量的14C乙酸，瘤胃液中注入14C乙酸的存留量隨時(shí)間t而減少兩者之間的關(guān)系為：，該微分方程的解為：，當(dāng)t0時(shí)，等于注入的14C乙酸量，因此有：ln*Mtln*M0kt，變形得： (19)，SAt與時(shí)間t的關(guān)系為：SAtSA0 e-kt (20)，SA0為零時(shí)刻乙酸的比活度，等于。一次注入總量為的14C乙酸后，時(shí)刻t的14C乙酸從瘤胃中消失的速度v為： (

28、21)14C乙酸瞬間消失的數(shù)量為： (22)經(jīng)過(guò)0的時(shí)間后，注入的14C乙酸全部從瘤胃中消失，即： (23)瘤胃中乙酸產(chǎn)生的速度，代入（23）式并變形得： (24)由上述推導(dǎo)，一次注入14C乙酸時(shí)瘤胃乙酸合成速度Ra的測(cè)定方法是：在注入后的不同時(shí)刻點(diǎn)采集瘤胃液樣品，測(cè)定乙酸的比活度SAt并記錄準(zhǔn)確的采樣時(shí)刻t，得到的兩組數(shù)據(jù)按（20）式進(jìn)行數(shù)據(jù)擬和，求出方程中的系數(shù)項(xiàng)，按（24）式求出Ra。一次注入方法的采樣次數(shù)較連續(xù)注入多，且需要記錄采樣時(shí)間，Ra的計(jì)算方法也較為復(fù)雜。但該方法可以得出更多的信息。連續(xù)注入方法只能計(jì)算出Ra，一次注入方法可以同時(shí)計(jì)算出V和k。擬和出的（20）式的常數(shù)項(xiàng)即是SA

29、0，而，已知，因而可求出CV，測(cè)定瘤胃液乙酸濃度C，得到瘤胃液的表觀體積V。k值是（20）式中e-kt項(xiàng)的常數(shù)，可直接由擬和結(jié)果得出。在代謝動(dòng)力學(xué)研究中，觀測(cè)示蹤物的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程較之在同位素達(dá)到平衡后觀測(cè)可以得到更多關(guān)于系統(tǒng)特性的信息，相應(yīng)的測(cè)定方法也較復(fù)雜，這在后面系統(tǒng)辨識(shí)方法的討論中可以更清楚地了解到。 非恒態(tài)單室模型1959年Steele用連續(xù)注入示蹤物的方法測(cè)定了注射胰島素對(duì)葡萄糖合成的影響，這是測(cè)定非恒態(tài)代謝合成速度的第一個(gè)試驗(yàn)。Steele按單室模型推導(dǎo)了有關(guān)計(jì)算公式，并且假定室中葡萄糖是均勻分布的，注入的標(biāo)記葡萄糖能即刻與室中的葡萄糖混勻，從室中消失的葡萄糖（或標(biāo)記原子）不再回到

30、代謝室中。前面關(guān)于恒態(tài)代謝時(shí)計(jì)算公式的推導(dǎo)實(shí)際上也假定了同樣的條件，因此Steele推導(dǎo)的公式適合于可用單室模型描述的所有底物代謝動(dòng)力學(xué)的研究。圖93是理想單室模型及使用符號(hào)的含義。其中Gb是室中注入的標(biāo)記葡萄糖量、Gt是室中的葡萄糖總量、E是室中標(biāo)記葡萄糖與非標(biāo)記葡萄糖的比例。容積濃度標(biāo)記葡萄糖量合成葡萄糖量 Ra(葡萄糖合成速度) （消失速度） I (標(biāo)記葡萄糖注入速度)圖93 理想單室模型由定義，GbE×Gt，微分該式即得到室中標(biāo)記葡萄糖量隨時(shí)間變化的微分方程：dGb/dtEt dGt/dtGt dEt/dt (27)室中合成葡萄糖量的增減決定于葡萄糖的合成和消失速度： dGt

31、/dtRaRd (28)室中標(biāo)記葡萄糖的增減決定于標(biāo)記葡萄糖的注入速度和消失速度，其消失速度為Rd×E： dGb/dtIRdEt(29)將（28）、（29）式代入（27）式： IRdEtEt (RaRd)Gt dEt/dt IRaEtGt dEt/dt RaEtIGt dEt/dt Ra(IGt dEt/dt)/ Et(30) RdRadGt/dt (31)用（30）、（31）式估測(cè)Ra、Rd時(shí)，在不同的時(shí)刻點(diǎn)采樣測(cè)定Et、葡萄糖濃度Ct，葡萄糖的總量Gt是濃度Ct與分布體積V的成績(jī)。Steele在研究過(guò)程中認(rèn)識(shí)到體液中的葡萄糖不是均勻分布的，引入了因子p校正體積V，使用下式建立方程

32、：RaFpV（C2C1）/2（E2E1）/(t2t1)/（E2E1）/2 (32)RdRapV(C2C1)/ (t2t1) (33)其中C2、C1，E2、E1、t2、t1分別是在時(shí)刻t2、t1采得樣品的葡萄糖濃度和標(biāo)記葡萄糖與葡萄糖總量的比。用單室模型是否能客觀地描述真實(shí)的代謝情況主要決定于代謝物的分布是否符合理想單室模型的假設(shè)。體內(nèi)水的代謝最接近理想單室模型。僅存在于血清中的底物，如游離脂肪酸（FFA）的代謝也接近理想情況，但研究表明，即使FFA的代謝，由于采樣位點(diǎn)和示蹤物注入位點(diǎn)的不同，樣品富集度也有2030的差異。葡萄糖是研究最多的代謝物，多年來(lái)一直認(rèn)為葡萄糖是適宜于用單室模型描述的代謝

33、物。一次注入標(biāo)記葡萄糖的研究表明，用2或3室模型方程擬和得到的富集度-時(shí)間曲線優(yōu)于用一室模型方程擬和。這表明體液中的葡萄糖是在多個(gè)容易混勻的代謝室中分布的。已經(jīng)證實(shí)，血清和組織液中葡萄糖的代謝動(dòng)態(tài)特性不同，應(yīng)將其區(qū)別為兩個(gè)不同的代謝室。對(duì)于存在于血清和組織液中的代謝物至少應(yīng)視為存在于兩個(gè)不同的代謝室中，而對(duì)于能由多種組織產(chǎn)生的代謝物，其情況可能更復(fù)雜。二. 多室模型分析 房室個(gè)數(shù)的確定：由于單室模型的局限性，對(duì)于一些代謝過(guò)程需要采用多室模型來(lái)描述。室的個(gè)數(shù)和室與室之間的關(guān)系可根據(jù)示蹤試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬和結(jié)果和對(duì)代謝過(guò)程的分析確定。一般情況下室的個(gè)數(shù)與推導(dǎo)出的富集度-時(shí)間函數(shù)中的冪函數(shù)個(gè)數(shù)相同，因此用

34、含有不同個(gè)冪函數(shù)的方程擬和示蹤試驗(yàn)數(shù)據(jù)有助于確定室的個(gè)數(shù)。由代謝過(guò)程考慮室的個(gè)數(shù)主要考慮兩個(gè)方面，一是室與室之間存在物理間隔，比如血清和組織液被毛細(xì)血管壁所分隔，兩種體液中的代謝物可以發(fā)生交換，但交換的速度與代謝物的性質(zhì)有關(guān)。二是代謝物之間發(fā)生相互轉(zhuǎn)變，如研究丙酮酸的代謝時(shí)，標(biāo)記的丙酮酸能很快地轉(zhuǎn)變?yōu)闃?biāo)記乳酸，經(jīng)過(guò)不同途徑代謝，需要將丙酮酸和乳酸作為不同的代謝室對(duì)待。室與室之間根據(jù)代謝物的流動(dòng)方向連接，兩個(gè)室之間有相互的代謝物流動(dòng)時(shí)用一對(duì)逆向的箭頭連接，在某個(gè)室中有代謝物的不回流消失時(shí)用向外的箭頭表示。箭頭上的kij表示代謝物流動(dòng)的速度常數(shù)，其中i是代謝物流入的室，j是代謝物流出的室，代謝物不

35、回流消失的方向用0表示。圖94是兩個(gè)房室模型舉例。 k12 k31312 k21 k13k41 k144 k04 k21 k32 k424321 k21 k23 k34 k01 k04圖94 房室模型舉例上圖的模型稱(chēng)為分支模型，外周的三個(gè)室均與中央室連接，相互之間不連接。下圖的模型稱(chēng)為鏈接模型，各室之間依次連接 描述房室模型同位素富集度變化的函數(shù)房室模型確定后，描述注入示蹤物后代謝物同位素富集度-時(shí)間變化曲線的函數(shù)關(guān)系隨之確定，按函數(shù)關(guān)系擬和測(cè)定出的富集度-時(shí)間值，可以計(jì)算出所需的代謝物的動(dòng)態(tài)代謝參數(shù)。推導(dǎo)函數(shù)關(guān)系的一般步驟是：列出富集度隨時(shí)間變化的微分方程；拉普拉斯變換微分方程為線性代數(shù)方程

36、；逆拉普拉斯變換得出微分方程的原函數(shù)。如對(duì)圖95的二室模型，原函數(shù)的推導(dǎo)過(guò)程如下：k21M2C2V2M1C1V1 f10 k02k12圖95 二室模型、分別代表室中代謝物的數(shù)量、濃度和分布體積，標(biāo)記物的數(shù)量用表示，富集度用表示，且。是描述標(biāo)記物注入的函數(shù)，當(dāng)一次注入Z0劑量的標(biāo)記物時(shí)，用沖量函數(shù)描述標(biāo)記物的注入，即f10Z0（t），且t0時(shí)，（t），t0時(shí)（t）0，并有；連續(xù)注入標(biāo)記物時(shí)，f10用單位階躍函數(shù)描述，即f10Z0u(t)u(tT)/T，且當(dāng)t<0時(shí)，u(t)0，當(dāng)t0時(shí)，u(t)1，其中T是連續(xù)注入的持續(xù)時(shí)間。沖量函數(shù)的拉普拉斯變換為Z0；單位階躍函數(shù)的拉普拉斯變換為.注入

37、示蹤物后，各室內(nèi)標(biāo)記物數(shù)量Mi(t)隨時(shí)間變化的微分方程為：一次注入標(biāo)記物時(shí)以上方程組的拉普拉斯變換形式為：移項(xiàng)后得：將、視為未知數(shù)，其它為常數(shù)，用線性代數(shù)的方法解以上方程組得： (34) (35)用待定系數(shù)法，令(sk21)(sk12k02)k21k12(s)(s),則有：k21k12k02 (36)k21k12 (37)令： (38) (39)則有：A1Z0(k12k02)/( -) (40)B1Z0(k12k02)/( -) (41)A2Z0k21/( -) (42)B2Z0k21/(-)(43)形如a/(s)的逆拉普拉斯變換為，因此各室中標(biāo)記物數(shù)量隨時(shí)間變化的原函數(shù)為： (44) (4

38、5)定義室中代謝物的富集度為，而，則各室代謝物富集度隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系為 (46)(47)連續(xù)注入示蹤物時(shí)，f10用單位階躍函數(shù)描述，此時(shí)（34）、（35）式中的Z0變?yōu)閆0（1eTs）/Ts，其中T為注入持續(xù)的時(shí)間。（38）、（39）式相應(yīng)變?yōu)椋?變形得： (48) (49)1/s的逆拉普拉斯變換為1；1/ (sa)的逆拉普拉斯變換為；eTs /s的逆拉普拉斯變換為u(tT)；eTs / (sa)的逆拉普拉斯變換為，當(dāng)t<T時(shí)u(tT)0，當(dāng)tT時(shí)u(tT)1。（46）式第一項(xiàng)的逆拉普拉斯變換為：(A1/ T)( 1eTs)1/s1/ (s)(A1/ T)（1/s1/ (s)eTs

39、/seTs / (sa) 當(dāng)t>T時(shí)：當(dāng)tT時(shí)，令：(46)、(47)式的其它各項(xiàng)形式相同，因此連續(xù)注入示蹤物時(shí)，各室代謝物富集度隨時(shí)間變化的函數(shù)為：當(dāng)t<T時(shí)： (50) (51)當(dāng)tT，亦即停止注入示蹤物后：(52)(53)在以上二室模型中，如果室一可測(cè)而室二不可測(cè)，即可以從室一取得樣品測(cè)定代謝物富集度隨時(shí)間變化的曲線但不能從室二取得樣品。由對(duì)室一的測(cè)定結(jié)果可以估計(jì)模型中的各個(gè)參數(shù)。一次注入示蹤物時(shí)的估計(jì)方法如下：首先，在注入示蹤物后的不同時(shí)刻點(diǎn)采樣，測(cè)定室一的代謝物富集度-時(shí)間曲線，對(duì)測(cè)定結(jié)果按（46）式進(jìn)行數(shù)據(jù)擬和，由擬和結(jié)果估計(jì)出A1、B1、。由（36）、（37）、（40

40、）、（41）式可估計(jì)出各。將（46）式外推至t0，此時(shí)，即。C2V2只有當(dāng)室二可測(cè)，并向室二注入標(biāo)記物時(shí)才可估計(jì)。連續(xù)注入示蹤物時(shí)，一般在注入示蹤物的同時(shí)采樣，按（52）式擬和測(cè)定結(jié)果，由擬和結(jié)果估計(jì)。C1V1在將擬和出的A1、B1、代入（46）式后按一次注入標(biāo)記物的方法估計(jì)。一般地，不同模型代謝物富集度-時(shí)間函數(shù)的形式與以上二室模型相同，冪函數(shù)的個(gè)數(shù)與模型中室的個(gè)數(shù)相同，函數(shù)式中的系數(shù)項(xiàng)是各速度常數(shù)、室容量、注入劑量、注入持續(xù)時(shí)間的代數(shù)表達(dá)式。參數(shù)是否可以估計(jì)與模型及模型中各室的可測(cè)情況有關(guān)。這種通過(guò)測(cè)定富集度-時(shí)間曲線，按推導(dǎo)出的函數(shù)關(guān)系擬和測(cè)定數(shù)據(jù)估計(jì)參數(shù)的方法稱(chēng)為系統(tǒng)辨識(shí)。三. 啟動(dòng)注

41、入(priming the pool）劑量的確定相對(duì)于示蹤物連續(xù)注入的速度，如果代謝室中底物的數(shù)量很大，往往需要持續(xù)數(shù)小時(shí)甚至更長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到同位素平衡。時(shí)間越長(zhǎng)，維持動(dòng)物安靜和生理狀態(tài)不發(fā)生變化的難度越大。因此一般希望能盡快達(dá)到同位素的平衡。1954年，Searle首先采用了啟動(dòng)注入與連續(xù)注入相結(jié)合的方法，即首先向動(dòng)物體內(nèi)一次注入一定量的示蹤物，使代謝室的SA接近平衡時(shí)的SA，接著進(jìn)行連續(xù)注入，縮短了達(dá)到同位素平衡所需的時(shí)間。之后用這一方法研究了包括乳酸、甘油、脂肪酸、氨基酸、尿素在內(nèi)的多種物質(zhì)的代謝，證實(shí)啟動(dòng)注入不影響最終同位素平衡的SA。啟動(dòng)注入的示蹤物劑量為，連續(xù)注入的速度為，開(kāi)始注

42、入后時(shí)刻t代謝物的比活度為SAt，由（18）和（20）式： (25)，其中，；當(dāng)t時(shí)，b，即啟動(dòng)注入結(jié)合以速度連續(xù)注入達(dá)到同位素平衡后的SA與單純以速度連續(xù)注入達(dá)到同位素平衡后的SA相同。理想的啟動(dòng)注入劑量是即刻達(dá)到同位素平衡，亦即將t0代入（25）式得到SAtb。t0時(shí)，e-kt1，代入（25）式：bb×（11）SA0 ×1SA0，由b和SA0的含義：，變形： （26）上式說(shuō)明理想的啟動(dòng)注入劑量應(yīng)是：?jiǎn)?dòng)注入劑量與連續(xù)注入速度的比是代謝物消失速度常數(shù)的倒數(shù)。注入啟動(dòng)劑量的示蹤物后，代謝物的即刻SA是連續(xù)注入達(dá)到同位素平衡后的SA。啟動(dòng)注入劑量高于或低于理想劑量均能延長(zhǎng)到達(dá)

43、同位素平衡的時(shí)間，一般注入的啟動(dòng)劑量越接近理想劑量、速度常數(shù)k越小，啟動(dòng)注入的效果越好。估計(jì)理想啟動(dòng)劑量的方法有兩種，一是估計(jì)代謝物的總量（CV）和消失速度，由估計(jì)k值；二是通過(guò)預(yù)試估計(jì)。第一種方法雖然不需要試驗(yàn)，但有可能產(chǎn)生較大的誤差。原因是在以上的推導(dǎo)中由一次注入的示蹤物可以與代謝室中的代謝物即使混勻的假設(shè)，這只是理想的情況，實(shí)際是不存在的。圖96是啟動(dòng)注入劑量等于、低于、高于理想劑量時(shí)SA隨時(shí)間變化情況。啟動(dòng)劑量等于理想劑量啟動(dòng)劑量低于理想劑量啟動(dòng)劑量高于理想劑量 圖96不同啟動(dòng)注入情況下的SA曲線第三節(jié) 同位素示蹤技術(shù)應(yīng)用舉例本節(jié)重點(diǎn)介紹了同位素示蹤技術(shù)在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究中幾個(gè)方面的應(yīng)

44、用方法。一. 蛋白質(zhì)代謝測(cè)定蛋白質(zhì)合成、分解速度的同位素示蹤方法可分為三種。終端產(chǎn)物法是在同位素平衡后測(cè)定氨基酸室的周轉(zhuǎn)速度，通過(guò)測(cè)定氨基酸分解代謝的某種終產(chǎn)物的產(chǎn)生速度確定氨基酸合成到蛋白質(zhì)中的速度和蛋白質(zhì)的分解速度，一般用于機(jī)體水平蛋白質(zhì)代謝速度的測(cè)定。前體底物法通過(guò)測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)標(biāo)記氨基酸合成到組織蛋白中引起的富集度變化測(cè)定組織蛋白的合成速度，此時(shí)得到的合成速度一般用每天合成的蛋白質(zhì)量占該組織蛋白總量的百分比表示（ %/天），稱(chēng)為蛋白質(zhì)合成比速度（fractional protein synthesis rate, FSR）。動(dòng)靜脈差法適用于有獨(dú)立的回流靜脈，并可做插管的組織，通過(guò)流入和

45、流出組織的標(biāo)記氨基酸數(shù)量差別測(cè)定蛋白質(zhì)的合成速度。3甲基組胺酸法是利用肌肉蛋白分解代謝產(chǎn)生的3甲基組胺酸測(cè)定肌肉蛋白的分解速度，該方法是一種非同位素示蹤方法。 終端產(chǎn)物法 根據(jù)示蹤氨基酸的性質(zhì)，終端產(chǎn)物法分為非必需氨基酸示蹤法和必需氨基酸示蹤法。非必需氨基酸示蹤法是向體內(nèi)注入某種15N標(biāo)記的非必需氨基酸，通常用15N甘氨酸。由于轉(zhuǎn)氨基作用，由此引入體內(nèi)的15N對(duì)其它氨基酸進(jìn)行了標(biāo)記，從而對(duì)體液氨基酸的代謝進(jìn)行示蹤，以由尿排除的尿素或氨N作為測(cè)定氨基酸分解速度的終產(chǎn)物。必需氨基酸示蹤法是向體內(nèi)引入某種標(biāo)記的必需氨基酸，標(biāo)記原子可以是C或N，但必需能夠反映該必需氨基酸的代謝情況，用于測(cè)定氨基酸分解

46、速度的終產(chǎn)物是標(biāo)記CO2或尿素（氨N）。1.1 15N甘氨酸連續(xù)注入方法（終端產(chǎn)物法）：該方法由Picou和Taylor Roberts于1969年提出，測(cè)定條件是同位素平衡和恒態(tài)代謝，測(cè)定指標(biāo)是氨基酸的吸收速度和尿中排除尿素（或氨N）的速度及富集度（15N/N）。（1）原理：該方法的原理見(jiàn)圖97。消化道吸收I C由尿排出的氨基酸N體液氨基酸N體蛋白 E S15N甘氨酸F圖97 連續(xù)注入15N甘氨酸活體測(cè)定蛋白質(zhì)的合成與分解速度原理圖中C為蛋白質(zhì)的合成速度(mgN/h)；S為蛋白質(zhì)的合成速度(mgN/h)；E為由尿排出氨基酸N的速度(mgN/h)，由測(cè)定平均每天由尿排出的尿素及氨N數(shù)量除24小

47、時(shí)得出；I為由消化道吸收氨基酸N的速度(mgN/h)，由每天平均吸收量除24小時(shí)得出；F為15N甘氨酸N的注入速度(mgN/h)，為已知量。試驗(yàn)條件是恒態(tài)代謝，即測(cè)定過(guò)程中圖中的各速度不變，一般可通過(guò)連續(xù)飼喂和減少環(huán)境刺激使動(dòng)物接近恒態(tài)代謝。恒態(tài)代謝時(shí)，體液氨基酸N的室容量不變，即有：CISEQ (1)其中Q為蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)速度。連續(xù)注入15N甘氨酸達(dá)到同位素平衡后，體液氨基酸N的15N/N比與由尿排出氨基酸N的15N/N比相等，因此可以通過(guò)測(cè)定尿中尿素或氨N的15N/N比得出體液氨基酸N的15N/N。令R15N/N，達(dá)到同位素平衡后，15N的注入量等于排出量，即有：F(SE)R，即：QSECI

48、 =F/R，室中E、F、R、I均為已知或可測(cè)量，因此蛋白質(zhì)的合成和分解速度可由下式求出：SF/RE (2)CF/RI (3)上式的單位為mgN/h，若要轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)的mg數(shù)，將上式計(jì)算結(jié)果乘以6.25即可。（2）方法的假設(shè)：在以上推導(dǎo)過(guò)程中，暗含以下假設(shè)，這些假設(shè)與實(shí)際情況不完全相符，影響了測(cè)定的準(zhǔn)確性。a、 嚴(yán)格的恒態(tài)代謝，測(cè)定過(guò)程中體液氨基酸N的室容量不變；b、 合成到體蛋白的15N不再分解成氨基酸重新回到體液氨基酸室中；c、 同位素的化學(xué)性質(zhì)完全相同；d、 吸收的氨基酸與蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨基酸在代謝上沒(méi)有差別；e、 15N甘氨酸是有效的示蹤物。試驗(yàn)持續(xù)的時(shí)間越長(zhǎng)，維持恒態(tài)代謝的難度越大，

49、室容量有可能發(fā)生較大變化。同時(shí)隨連續(xù)注入的延長(zhǎng)，再循環(huán)15N對(duì)結(jié)果的影響增加。注入15N甘氨酸，達(dá)到同位素平衡約需3040小時(shí)，縮短平衡時(shí)間需要對(duì)體液氨基酸和尿素室進(jìn)行啟動(dòng)注入。15N甘氨酸的注入速度為0.2mol/kg/min.時(shí)，啟動(dòng)注入12mol/kg的15N甘氨酸可使體液氨基酸室達(dá)到平衡。目前生產(chǎn)的15N標(biāo)記尿素的兩個(gè)N原子均被標(biāo)記，而注入15N甘氨酸后體內(nèi)合成的標(biāo)記尿素只有一個(gè)N原子被標(biāo)記，因此缺少直接啟動(dòng)注入尿素室的標(biāo)記物。替代的方法是用15N甘氨酸進(jìn)行間接啟動(dòng)注入，此時(shí)15N甘氨酸的啟動(dòng)計(jì)量需達(dá)到720mol/kg，雖可有效地縮短尿素室達(dá)到同位素平衡需要的時(shí)間，但使用劑量大大超出

50、示蹤劑量，注入的15N甘氨酸可能影響體液氨基酸的恒態(tài)代謝。另外的方法是測(cè)定由尿排除氨N的15N/N比，由于氨N的室容量小且周轉(zhuǎn)速度快，達(dá)到同位素平衡所需時(shí)間少，不需要啟動(dòng)注入。但尿中的氨N主要來(lái)自谷氨酰胺的酰胺N，作為反映體液氨基酸N同位素富集度的終端產(chǎn)物不理想。1.2 標(biāo)記必需氨基酸連續(xù)注入方法：可利用的標(biāo)記氨基酸有多種。一些氨基酸在分解代謝過(guò)程中產(chǎn)生唯一來(lái)源的酮酸，可通過(guò)測(cè)定這些酮酸的富集度反映細(xì)胞內(nèi)（直接用于蛋白質(zhì)合成）該氨基酸的富集度，這類(lèi)必需氨基酸有亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等。另一些必需氨基酸不產(chǎn)生唯一來(lái)源的酮酸，只能由血漿中該氨基酸的富集度反映細(xì)胞內(nèi)該氨基酸的富集度。與非必需氨基酸不同的是，必需氨基酸的標(biāo)記原子必須不能轉(zhuǎn)移到其它氨基酸分子上，具有唯一性。符合這一條件的C、N原子均可。對(duì)C原子進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，測(cè)定的終產(chǎn)物是CO2，對(duì)N原子標(biāo)記時(shí)，測(cè)定的終產(chǎn)物是尿素或氨N。(1) 13C亮氨酸連續(xù)注入：該方法的測(cè)定原理見(jiàn)圖98。細(xì)胞內(nèi) 血漿蛋白質(zhì) C S13C亮氨酸 E*異己酮酸（*KIC） 13CO2異戊酰輔酶A I13C亮氨酸 F 圖98 連續(xù)