豬源乳酸桿菌的分離鑒定及其發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

1、豬源乳酸桿菌的分離鑒定及其發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化摘要微生態(tài)制劑是發(fā)展綠色養(yǎng)豬業(yè)的關(guān)鍵，乳酸桿菌是 目前應(yīng)用的微生態(tài)制劑中最重要的有益菌組成成分之一。分 離、鑒定并篩選出1株耐酸和耐膽鹽能力較強的乳酸桿菌， 命名為乳酸桿菌l5株。采用單因素法和正交試驗設(shè)計法對 其發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，發(fā)酵培養(yǎng)菌落總數(shù)可達& 25 x108 cfu/ml關(guān)鍵詞豬源乳酸桿菌；分離鑒定；發(fā)酵條件；優(yōu)化中圖分類號s852. 6文獻標識碼a文章編號1007-5739 (2011) 11-0332-02isolationandidentificationofloctobacillusfromswinea ndoptim

2、izationofcultureconditionshan ya-chaowang ming-yue(fuyang vocational-technical college, fuyang anhui 236031)abstractprobiotics is the key to developing greenpig industry. lactobacillus is one of the most important beneficial bactedium components in the current application probiotics one lactobacillu

3、s st rain which had st rong acid and bile salts resis tance was isolated, and it was identified and named lactobacillus strain l5. the fermentation conditions in liquid culture were studied by single factor test and orthogonal test. under optimal conditions, the living bacteria concentration reached

4、 8. 25x 108 cfu/ml in the fermentation liquid.key wordslactobaci1lus from swine； isolation and identification； fermentation condition； optimization 由于長期大量使用抗生素和化學藥物的弊端日益明顯， 使得微生態(tài)制劑在畜牧養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用成為必然。微生態(tài)制劑 進入腸道可以通過與腸道有害菌群的競爭占位、奪氧等競爭 性抑制或分泌抗性物質(zhì)、酶和有機酸等作用使得腸道內(nèi)有益 菌群成為優(yōu)勢種群，進而調(diào)整腸道微生態(tài)平衡，達到有利于 消化、健康的作用。因此，在仔豬飼料中添

5、加微生態(tài)制劑， 可明顯降低仔豬腸道疾病的發(fā)病率、提高仔豬成活率和生長 率1我國是養(yǎng)豬大國，微生態(tài)制劑的應(yīng)用是發(fā)展綠色養(yǎng)豬業(yè) 的關(guān)鍵。目前微生態(tài)制劑應(yīng)用較多的主要有乳酸菌類制劑、 芽砲桿菌類制劑、雙歧桿菌類制劑、光合細菌類制劑和真菌 類制劑等。其中，乳酸桿菌(lactobac訂lus)在腸道中生 長繁殖，抑制有害菌生長，是動物機體內(nèi)正常的生理菌群之 一。乳酸桿菌能夠合成共輒亞油酸(conjugated linoleicacid, cla),產(chǎn)生乙酸和乳酸，降低腸道ph值, 從而提高動物的免疫力和生產(chǎn)性能2；此外，乳酸桿菌一 方面可刺激腸道局部的免疫反應(yīng)，另一方面通過粘附于腸道 黏膜細胞上，而對腸

6、道黏膜產(chǎn)生占位性保護作用。筆者從健 康仔豬的腸道中分離有益的乳酸桿菌，并進行了其發(fā)酵培養(yǎng) 基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究，為進一步研制豬用微生態(tài)制劑奠 定基礎(chǔ)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報告如下1材料與方法1. 1試驗材料供試材料：取健康的15日齡長白豬仔豬小腸黏膜。供 試培養(yǎng)基：供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基，即乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基，按 照陳天壽3的方法進行配制；生化培養(yǎng)基按照趙斌等4的 方法配制。試驗試劑：試驗所使用的各種試劑均按照趙斌等 4的方法配制1. 2試驗方法1.2.1乳酸桿菌分離。將健康的15日齡仔豬麻醉處死, 通過無菌操作刮取1 g小腸黏膜，經(jīng)適當稀釋后涂布在mrs 瓊脂平板上，于37 £厭氧條件下培養(yǎng)4

7、8 h。挑取顏色、大 小、形狀、邊緣、分布位置各異的單菌落，在mrs瓊脂培養(yǎng) 基上劃線得到純培養(yǎng)。通過革蘭氏染色鏡檢，挑選染色結(jié)果 為革蘭氏陽性、不產(chǎn)芽胞的桿狀菌株，以備后續(xù)試驗用1.2.2乳酸桿菌鑒定。將挑選出來的菌種依次從形態(tài)、 理化特性、代謝產(chǎn)酸等方面按伯杰氏細菌鑒定手冊（第8 版）進行鑒定51. 2. 3乳酸桿菌耐酸性試驗。菌液接種于mrs培養(yǎng)液中, 其ph值分別為2.0、3.0、4.0、6.8 （對照），并在37 °c條 件下分別處理1、2、3 h,通過保溫前后活菌計數(shù)結(jié)果計算 細菌存活率1. 2. 4乳酸桿菌膽鹽耐受性試驗。菌液接種于膽鹽濃度 分別為 0 （對照）、0.0

8、5%、0.10%、0.20%、0.30%、0. 40%的 mrs培養(yǎng)液中，在37 °c條件下處理3 h后，平板菌落計數(shù), 篩選出對酸和膽鹽耐受能力均較強的菌株進行后續(xù)的試驗1.2.5乳酸桿菌生長曲線測定。將保存的菌種用mrs液 體培養(yǎng)基活化。將活化的菌種以5% （v/v）的接種量接入mrs 液體培養(yǎng)基，37 °c培養(yǎng)48 h,其中每隔2 h取樣1次測定 菌液的od值（600 nm）和ph值，用未接種的培養(yǎng)液作空白 對照1.2.6發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的確定。在mrs液體培養(yǎng)基 的基礎(chǔ)上，分別添加2%葡萄糖、紅糖、蔗糖作為不同的碳源; 分別加入1%胰蛋白豚、大豆蛋白豚和魚肉蛋白豚

9、作為不同的 氮源;分別加入0. 5% k2hp04和kh2p04、b-磷酸甘油二鈉 以及na2hp04和nah2p04作為不同的磷源；分別加入0. 5% 牛肉膏、酵母膏和10% (v/v)玉米漿作為增菌因子，其他組 分不變。菌種以5% (v/v)接種量，初始ph值為6.0,在 37工下培養(yǎng)24 ho采用平板菌落法計數(shù)，每個處理3次重 復(fù)，取平均值，以確定乳桿菌l5株發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的 種類1.2.7發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化。選擇溫度分別為33、38、43 °c,初始ph值分別為5.0、6.0、7.0,發(fā)酵時間分別為 18、22、26 h,設(shè)計正交試驗(l934)用于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條 件1.

10、2.8培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的優(yōu)化。按照1.2.7的試驗結(jié)果 安排培養(yǎng)條件，改變碳源、氮源、增菌因子、磷源的含量， 設(shè)計正交試驗(l934)用于優(yōu)化培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分2結(jié)果與分析2. 1乳酸桿菌分離和菌落形態(tài)經(jīng)厭氧培養(yǎng)48 h后，從mrs平板上分離得到菌株62株, 經(jīng)染色鏡檢，從中篩選出無芽胞桿菌、革蘭氏陽性12株， 分別編號為lrl12o其菌落特征為直徑0.52. 0 mm,菌體 桿狀、圓形、乳白色、表面光滑凸起、邊緣整齊，多排列成 長短不一的鏈狀，也有單個分散排列2. 2乳酸桿菌的生理生化鑒定結(jié)果乳酸桿菌的鑒定結(jié)果如下：菌株l1l12的運動性、接 觸酶、硝酸鹽還原、明膠液化、產(chǎn)生呵垛、硫化氫、v-p

11、試 驗鑒定結(jié)果均為陰性，代謝產(chǎn)酸為a.l(l型乳酸)。根據(jù)伯 杰細菌鑒定手冊，判定所選的12株菌株為乳酸桿菌(lactobacillus)2. 3乳酸桿菌的耐酸及耐膽鹽篩選試驗結(jié)果乳酸桿菌的耐酸篩選試驗結(jié)果見表1。根據(jù)表1的統(tǒng)計 結(jié)果，挑選在ph值為2.0、耐受23h條件下，耐酸性較強 的菌株li、l2、l5、l6、l11進行了耐膽鹽篩選試驗。乳酸 桿菌的耐膽鹽試驗結(jié)果見表2。由表2可知，膽鹽明顯抑制 乳酸桿菌的生長，并且隨著膽鹽濃度升高，各乳酸桿菌存活 數(shù)均明顯下降。綜合各菌株對酸和膽鹽的耐受情況，選擇l5 菌株進行后續(xù)試驗2. 4乳酸桿菌生長曲線的測定乳酸桿菌l5培養(yǎng)過程中的生長趨勢和培養(yǎng)

12、基ph值的變 化見圖1。由圖1可知，在乳酸桿菌l5接種后0d值逐漸上 升，10 h后上升速度較快，進入對數(shù)增長期；在接種1820 h后，0d值上升速度開始減慢，即菌體進入穩(wěn)定生長期。培 養(yǎng)基的ph值在最初68 h內(nèi)變化較小，10 h后迅速下降，1820 h后達到最低，說明菌株產(chǎn)酸能力與其生長期基本保 持一致2. 5液體發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的確定通過試驗，確定乳桿菌l5株液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源 是紅糖，最佳氮源是胰蛋白豚，最佳磷源是b-磷酸甘油二 鈉，最佳增菌因子是酵母膏2. 6發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表3o 由表3可知，3個因素對乳酸桿菌l5株增殖的影響順序為

13、： 溫度時間初始ph值。優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫 度為38 °c,培養(yǎng)時間為26 h,初始ph值為5.02. 7發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分含量的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分含量的優(yōu)化設(shè)計方案及結(jié)果見表4o由表4可知，各營養(yǎng)因素對乳酸桿菌l5菌株液體發(fā)酵培 （上接第333頁）養(yǎng)效果的影響順序是：紅糖胰蛋白淼酵母膏b- 磷酸甘油二鈉。這幾種營養(yǎng)因素的最佳組合應(yīng)是2%紅糖、 1.5%胰蛋白月東、0.4%酵母膏和0.5% b-磷酸甘油二鈉3結(jié)論與討論本研究直接從健康的仔豬腸道中進行乳酸桿菌的分離， 因為益生菌的菌株具有較強的針對性和特異性，在其被制作 成活菌制劑后也有一定的專一性6。由于乳酸桿菌對環(huán)境

14、 的抗性較差，不產(chǎn)芽葩，不易通過膽汁和胃酸環(huán)境，因此模 擬了宿主體內(nèi)低ph值、高膽鹽濃度的環(huán)境，進行乳酸桿菌 的篩選，從而篩選出了具有較強抗逆性的菌株l5?；罹?決定了微生態(tài)制劑是否有效以及作用效力的大小。系統(tǒng)地研 究了獲得最大活菌數(shù)的條件，對乳酸桿菌l5株的培養(yǎng)基和 培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，其最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基組 成為2%紅糖、0.4%酵母膏、1.5%胰蛋白月東和0.5% b-磷酸 甘油二鈉、0. 2%檸檬酸鐵、0. 5%乙酸鈉、0. 1% l-cys鹽酸鹽、 0. 1%吐溫-80、0. 02%mns04、0. 05% mgs04,在初始 ph 值 5. 0、 38 °c下培養(yǎng)26 h,菌落總數(shù)可達8. 25x 108 cfu/ml4參考文獻1 何明清，倪學勤我國動物微生態(tài)制劑研究、開發(fā) 和應(yīng)用動態(tài)j飼料廣角,2002 (21)： 1-7.2 julia be, johnww, hugo d, et al. bioproduction of conjugated linoleic acid by probioticbacteria occurs in vitro and in vivo in miceja-merican society for nutrition j nutr, 1996 (136)： 1483-1487.3 陳