細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)PPT課件

1、第1頁/共96頁玻璃器皿、膠塞、塑料制品玻璃器皿、膠塞、塑料制品第2頁/共96頁第3頁/共96頁 清洗：自來水洗，烘干 泡酸 自來水洗 去離子水洗 三蒸水洗 烘干 新瓶子均按該程序清洗，培養(yǎng)材料染菌的瓶子經(jīng)高壓滅菌后也按該程序清洗。 酸液（洗液）：濃硫酸+重鉻酸鉀第4頁/共96頁第5頁/共96頁第6頁/共96頁第7頁/共96頁第8頁/共96頁第9頁/共96頁第10頁/共96頁第11頁/共96頁第12頁/共96頁二、包裝：二、包裝：目的：以便消毒及儲(chǔ)存，防止落人灰塵及消毒后再次被污染。 包裝紙（盒）表面用油性記號(hào)筆標(biāo)明物品名稱、消毒日期等！ 第13頁/共96頁各種用品的包裝器皿的包裝分為半包裝和

2、全包裝器皿的包裝分為半包裝和全包裝 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶 兩個(gè)一組全包，包裝前蓋上螺旋蓋子。兩個(gè)一組全包，包裝前蓋上螺旋蓋子。 吸管吸管 在與膠頭相接端塞上棉花裝入吸管筒。在與膠頭相接端塞上棉花裝入吸管筒。 青霉素小瓶青霉素小瓶 倒扣在飯盒中，全包。倒扣在飯盒中，全包。 濾器濾器 上下口半包裝再用報(bào)紙包，最后用布包上下口半包裝再用報(bào)紙包，最后用布包好。好。 大的容器大的容器 如錐形瓶，加上棉塞后半包裝。如錐形瓶，加上棉塞后半包裝。 槍頭、槍頭、EPEP管管 裝在相應(yīng)的盒子中，全包。裝在相應(yīng)的盒子中，全包。 手術(shù)器械手術(shù)器械 放在飯盒中，全包。放在飯盒中，全包。 離心管離心管 加蓋子后全包加蓋子后全包第

3、14頁/共96頁三、消毒、滅菌三、消毒、滅菌 防止培養(yǎng)物污染可通過消毒滅菌（將已存在的微生物去除）滅菌sterilization：應(yīng)用理化方法殺死所有病原微生物、非病原微生物和芽胞。 消毒disinfection：應(yīng)用理化方法殺死微生物，只要求達(dá)到無傳染性的目的，不要求全部殺死。第15頁/共96頁無菌germ free：沒有活菌。防腐antisepsis：應(yīng)用理化方法防止和抑制微生物生長(zhǎng)繁殖。抑菌（bacteriostasis）：抑制體內(nèi)或體外細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。常用的抑菌劑為抗生素 第16頁/共96頁1 1、消毒滅菌的方法 物理方法: : 濕熱（高壓蒸汽）、干熱、紫外線。射線、過濾、離心沉淀等方法

4、殺滅或去除微生物。 化學(xué)方法: :使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等殺滅微生物。 第17頁/共96頁2、消毒滅菌的注意事項(xiàng) 干熱消毒：一般在烤箱中進(jìn)行，需加溫到 160，保持90120 min方能殺死芽孢。注意！消毒完畢后不可馬上將烤箱門打開，以免冷空氣突然進(jìn)人，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外事故。第18頁/共96頁濕熱消毒：一般使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行消毒。 注意：1、不能裝太滿，保持消毒器內(nèi)氣體流通。 2、在加熱升壓之前，打開排氣閥門，使加熱后消毒器內(nèi)的殘留冷空氣排出！ 關(guān)閉排氣閥門，開始升壓，待達(dá)到所需要的壓力時(shí)，開始記錄時(shí)間，并控制壓力恒定。第19頁/共96頁3、一般物品：布類、金屬器械、玻

5、璃器皿等消毒的要求是 15磅 20 min； 常規(guī)使用液體：消毒 15磅 15 min 。4、橡膠和塑料用品 ： 如濾器、EPEP管、離心管等高壓1010磅15 min15 min。 第20頁/共96頁紫外線消毒：主要用于實(shí)驗(yàn)室房間里的空氣、操作臺(tái)表面及桌椅等消毒。時(shí)間為3030分鐘2 2小時(shí)左右。過濾除菌消毒：適用于組織細(xì)胞培養(yǎng)使用的液體如血清、合成培養(yǎng)液、酶及含有蛋白質(zhì)具有生物活性的液體等。第21頁/共96頁3、常用設(shè)施的消毒及滅菌 培養(yǎng)室：紫外線照射、乳酸熏蒸 臺(tái)面：紫外線照射、 70%乙醇擦拭 培養(yǎng)箱：新潔爾滅擦拭 培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等：用報(bào)紙包好高壓蒸汽滅菌 滴管、槍頭等：裝載相應(yīng)的容器

6、中用報(bào)紙包好高 壓蒸汽滅菌 培養(yǎng)板：紫外線照射12小時(shí)以上。 培養(yǎng)基：過濾除菌、 第22頁/共96頁第二節(jié) 培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求 防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。由于體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的無菌。一、培養(yǎng)前準(zhǔn)備1、制定出分門別類的操作卡片。 如“分裝血清”、“組織塊貼壁初代培養(yǎng)”、“傳代培養(yǎng)”、等等。各卡片上記有需用器材和物品名稱、要求及數(shù)量等，好處是實(shí)驗(yàn)者可按卡片收集所用物品，清點(diǎn)無誤后，把用品放置于操作場(chǎng)地，然后進(jìn)行消毒。第23頁/共96頁2、操作野消毒：現(xiàn)多用紫外線燈滅菌，效果很好。用30 瓦紫外線管燈，操作箱消毒20 一30 分鐘即可；操

7、作室空間大，需消毒3050 分鐘。 在用紫外線燈照射期間，在操作臺(tái)面上勿置培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液等物，以免受射線影響(必要時(shí)可用紙張覆蓋)。 紫外線只有直接殺菌作用，工作野用品過多或重疊放置，物品相互遮擋射線，會(huì)降低消毒效果第24頁/共96頁3、洗手和著裝：原則上和外科手術(shù)相同。在利用無菌箱工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，洗刷時(shí)一定要清洗到肘部。75酒精，進(jìn)行擦洗消毒；必要時(shí)亦可用0.2的新潔爾滅洗滌消毒。 進(jìn)行培養(yǎng)工作時(shí)，如利用凈化臺(tái)，僅戴口罩和工作帽，著一般工作服即可。在無菌室內(nèi)工作需著消毒衣帽。第25頁/共96頁二、火焰消毒： 在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌操作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈或煤氣燈。以

8、后操作，如安裝吸管帽、啟開或封閉瓶口等，都需經(jīng)過火焰燒灼進(jìn)行。 已吸取過營(yíng)養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼！因吸管頭中殘留營(yíng)養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時(shí)會(huì)把有害物帶入培養(yǎng)液中。 消毒火焰要求無色或微藍(lán)色，而紅黃色或發(fā)黑的火苗，表示燃燒不完全或含有雜質(zhì)，有害物能混入培養(yǎng)液內(nèi)。因此酒精燈需用96的不含雜質(zhì)的酒精，絕不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精。第26頁/共96頁三、培養(yǎng)操作注意事項(xiàng)1、進(jìn)行培養(yǎng)操作時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。2、不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒觸及部，如不便消毒時(shí)，應(yīng)取備品更換。3、布局： 原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在

9、左側(cè)，酒精燈置于中央(圖4-1)。工作由始至終要保持一定順序性。第27頁/共96頁第28頁/共96頁4、組織或細(xì)胞在末做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在使用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口。5、培養(yǎng)用瓶開瓶以后，皆應(yīng)保持45 度斜位或平放， 吸取營(yíng)養(yǎng)液BSS、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。6、工作中不能面向操作野講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。第29頁/共96頁第三節(jié) 基本培養(yǎng)操作技術(shù)第30頁/共96頁一、傳代培養(yǎng)法 當(dāng)初代培養(yǎng)成功，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖形成單層細(xì)胞后，進(jìn)而擴(kuò)展匯合，占滿

10、一切空間，此時(shí)需要進(jìn)行分離培養(yǎng)。這一操作稱傳代或再培養(yǎng)。80% 匯合或剛匯合細(xì)胞是理想傳代階段。為什么要進(jìn)行傳代？第31頁/共96頁1、貼壁細(xì)胞傳代第32頁/共96頁貼壁細(xì)胞第33頁/共96頁貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板、96孔板第34頁/共96頁+ + + + + + + + + + +細(xì)胞的貼附過程貼附物質(zhì)帶正電荷細(xì)胞帶負(fù)電荷第35頁/共96頁成纖維細(xì)胞：梭形、三角形、2-3個(gè)突起上皮細(xì)胞：扁平、多角形、園核可連成單層第36頁/共96頁 材料和試劑 Hela細(xì)胞 RPMI1640生長(zhǎng)液、碳酸氫鈉、雙抗 EDTA消化液（0.02%） 培養(yǎng)瓶、無菌吸液管（5ml、1ml）

11、、彎頭毛細(xì)滴管、廢液缸第37頁/共96頁圖5-6 消化法傳代培養(yǎng)步驟第38頁/共96頁 【程序】(1)吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液；(2)向瓶?jī)?nèi)加入EDTA 混合液少許，以能覆滿瓶底為限；(3)置溫箱中25 分鐘(或在室溫中，把培養(yǎng)瓶放在倒立顯微鏡臺(tái)上鏡下觀察)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化；(4)吸除消化液第39頁/共96頁(5)用吸管吸取營(yíng)養(yǎng)液（已經(jīng)加入雙抗并調(diào)好pH值）加入培養(yǎng)瓶，輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液；吹打勿用力過猛，以免傷害細(xì)胞；(6)計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后(如非實(shí)驗(yàn)用，不計(jì)數(shù)亦可)，把細(xì)胞懸液分成等份分裝入數(shù)個(gè)培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。第40頁/共96頁2

12、、懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)第41頁/共96頁懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞第42頁/共96頁第43頁/共96頁 材料和試劑 HL-60細(xì)胞 RPMI1640生長(zhǎng)液、碳酸氫鈉、雙抗 培養(yǎng)瓶、無菌吸液管（5ml、1ml）、彎頭毛細(xì)滴管、廢液缸第44頁/共96頁二、操作步驟l、 選生長(zhǎng)良好的HL-60細(xì)胞一瓶 輕輕加入等量的生長(zhǎng)液。2 、用無菌吸液管輕輕吹打，使HL-60細(xì)胞均勻懸浮 然后吸出一半的細(xì)胞懸液加人另一個(gè)培養(yǎng)瓶中。3、如果細(xì)胞比較濃，可按1:3分配傳代培養(yǎng)。第45頁/共96頁二、初代培養(yǎng)法 意義： 初代培養(yǎng)或原代培養(yǎng)，是從供體獲取組織后的首次培養(yǎng)。其最大優(yōu)點(diǎn)是：組織和細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大的變化，

13、具有二倍體遺傳性狀，在供體來源充分、生物條件穩(wěn)定的情況下(年齡、性別)，在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)。 初代培養(yǎng)細(xì)胞是研究基因表達(dá)的理想系統(tǒng)。采用初代培養(yǎng)細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)，如藥物測(cè)試等效果也很好； 初代培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系(株)必須經(jīng)過的階段。第46頁/共96頁1、原則： 幼體組織尤其是胚胎組織比年老個(gè)體的組織容易培養(yǎng)； 分化程度低的組織比分化程度高的容易生長(zhǎng)； 腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。 一般在無特定要求時(shí)，取易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)，成功率高。（一）取材第47頁/共96頁 注意事項(xiàng)： 取材之后，最好立即培養(yǎng)，如因故不能培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)把組織切成1 立方厘米左右的小塊，置于培養(yǎng)液中，4貯存；存放時(shí)間不宜超

14、過24 小時(shí)。 從體內(nèi)取材時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格保持無菌，取腫瘤和其它病理組織時(shí)容易帶菌，為減少污染，可用含500 1000 單位毫升的青、鏈霉素BSS 液，漂洗5 10 分鐘后再做培養(yǎng)處理。第48頁/共96頁1、鼠組織取材各種組織取材第49頁/共96頁2取皮膚： 人皮膚是常用的培養(yǎng)材料，對(duì)供體無特定要求時(shí)，可利用手術(shù)時(shí)取材：請(qǐng)術(shù)者手術(shù)時(shí)切取l 2cm2 皮膚，即滿足培養(yǎng)要求。 取皮膚時(shí)可在上臂和大腿內(nèi)側(cè)等處，先用肥皂洗凈取材部位皮膚，用75酒精擦拭消毒2 3 次(勿用碘酒)。 取材方法可按如下兩種方法：一是用注射器針尖輕輕斜刺入表皮內(nèi)2 毫米左右，向上挑起一個(gè)小的皮丘，然后用手術(shù)刀緊貼針尖下方，切下直徑

15、2 3 毫米小片，深度以創(chuàng)面微見血跡為度；二是用拇指和食指把取皮部皮膚緊捏起，在繃起的皮膚表面，用手術(shù)刀輕輕片取一小片表皮，大小和深度同前。第50頁/共96頁3取體液： 血液白細(xì)胞是常用的培養(yǎng)材料，一般多用靜脈取血法。亦可從耳垂或指尖取血。從無名指肚取血很好，血多，消毒和取血都方便，刺口恢復(fù)很快不易感染。從手指取2 3 滴血即夠一次培養(yǎng)，血用量多時(shí)需從靜脈采取。為防止凝血，常用肝素等抗凝劑；吸出血后拔掉針，立即把血注入無菌容器中備用。 取骨髓組織、羊水、胸水和腹水可委托臨床有關(guān)科室，按不同手術(shù)規(guī)程取材。第51頁/共96頁（二）組織的分離 目的：為獲取多量生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，必須把組織細(xì)胞分散開，使

16、細(xì)胞解離出來；能達(dá)到單細(xì)胞水平更好，同時(shí)并不使細(xì)胞受傷害，細(xì)胞能很好生長(zhǎng)。 分散組織的方法有離心法、機(jī)械法和化學(xué)法三種；第52頁/共96頁1離心分離法 培養(yǎng)物為血液、羊水、腹水和胸水等細(xì)胞懸液時(shí)，可采用離心法分離。一般用低速500 1000 轉(zhuǎn)分速度，離心5 10 分鐘即可。如懸液量大，離心時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，但如離心速度過大和時(shí)間太長(zhǎng)，易壓擠細(xì)胞使之受損或死亡。第53頁/共96頁淋巴細(xì)胞分離法 原理：淋巴細(xì)胞分層液(Lyphocyte Separation Medium) 效果很好。分層液是根據(jù)細(xì)胞比重不同，使各類細(xì)胞相互分開的。紅細(xì)胞比重1.092，淋巴細(xì)胞和大單核等白細(xì)胞比重為1.070；分

17、層液適用于分離血中淋巴細(xì)胞。(1)取抗凝血若干毫升；(2)按1:1 加入無菌分層液(濾過除菌)后，800 1000 轉(zhuǎn)離心；(3)無菌分離出白細(xì)胞(白細(xì)胞位于紅細(xì)胞上層，呈微白色)；(4)BSS 漂洗1 2 次，可用于培養(yǎng)或其它實(shí)驗(yàn)。 注意：如用動(dòng)物血(如小鼠)，白細(xì)胞的比重與人不同；小鼠白細(xì)胞比重為l.080 左右，需用相應(yīng)比重的分層液。第54頁/共96頁2機(jī)械分散法： 切割分離法：在進(jìn)行組織塊培養(yǎng)時(shí)，可采用剪切法，一般多剪切成1 mm3 大小的塊。具體操作如下：第55頁/共96頁 無菌切取1 cm3 組織一塊，置入青霉素瓶或小燒杯中，左手斜持容器，右手持眼科尖剪或彎剪(剪柄較長(zhǎng)為好)伸入容

18、器中，反復(fù)剪切組織至1mm3 大小為止(成糊狀)。然后用吸管吸取Hanks 液把附著在剪刀上的組織小塊沖下，并再補(bǔ)加3 5 毫升Hanks 液后，用吸管反復(fù)輕輕吸吹沖打片刻，低速離心、去上清、余下組織塊即可用于培養(yǎng)。剪刀剪切法可能對(duì)組織有一定損傷，但操作比較方便。第56頁/共96頁壓擠法第57頁/共96頁第58頁/共96頁3消化分離法： 組織消化法是在把組織剪切成較小體積的基礎(chǔ)上，應(yīng)用生化和化學(xué)手段進(jìn)一步分散組織的方法。最后成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，然后加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)容器中后，細(xì)胞容易生長(zhǎng)增殖。各種消化劑的作用機(jī)制各不相同，根據(jù)組織的不同，可選用特定的消化手段。第59頁/共96頁

19、1消化培養(yǎng)法(單細(xì)胞培養(yǎng)）(三)原代細(xì)胞培養(yǎng)類型第60頁/共96頁(1)準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺(tái)面，紫外線消毒20 分鐘；注意：組織塊、胰蛋白酶、培養(yǎng)液等易受紫外線傷害的物品，最好在培養(yǎng)時(shí)再攜入操作野；如預(yù)先置入，需用紙張覆蓋，以免受射線影響； (2)處理組織：把組織塊置入燒杯中，用Hanks 液漂洗23 次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中3060 分鐘；(3)剪切：用眼科剪把組織塊切成23 毫米大小的塊(用手術(shù)刀切割亦可)，以便于消化；第61頁/共96頁(4)消化：加入比組織塊總量多3050 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠

20、塞；或用恒溫水浴，或置) 37溫箱消化均可，消化中每隔20 分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次，消化時(shí)間依組織塊的大小和組織的硬度而定。第62頁/共96頁(5)分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時(shí)，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊(必要時(shí)可繼續(xù)進(jìn)行消化)；低速(5001000 轉(zhuǎn)分)離心消化液5 分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液(如用其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks 液洗脫一兩次后，再加入培養(yǎng)液)；第63頁/共96頁(7)計(jì)數(shù)：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中；對(duì)大

21、多數(shù)細(xì)胞來說，pH 要求在7.27.4 范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整；(8)培養(yǎng)：置入36.5度 溫箱培養(yǎng)；如用CO2 溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時(shí)需更換新塞。第64頁/共96頁第65頁/共96頁2、組織塊培養(yǎng)法:第66頁/共96頁第67頁/共96頁 【程序】(1)剪切：把組織小塊(1cm3)置入小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks 液漂洗23 次以去掉表面血污，吸凈Hanks 液，用眼科剪反復(fù)剪切成lmm3 塊為止；(2)擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置入培養(yǎng)瓶中；用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底上，小塊相

22、互距離為0.5cm 為宜，每一25ml 培養(yǎng)瓶底可擺布2030 塊；(3)輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，令瓶底向上；注意翻瓶時(shí)勿令組織小塊流動(dòng)，塞好瓶塞，置36.5溫箱2 小時(shí)左右(勿超過4 小時(shí))，使小塊微干涸；第68頁/共96頁(4)培養(yǎng)：從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46 度斜持培養(yǎng)瓶(瓶底仍向上)，向瓶底角部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶底上的組織小塊(組織小塊附著尚不牢，注意不要把組織塊沖走)；置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量增多后，再補(bǔ)加培養(yǎng)液。第69頁/共96頁三、三、 細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù) 一、原理一、原理 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果以細(xì)胞數(shù)/ /毫升表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)

23、的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力。 用臺(tái)酚蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力。第70頁/共96頁二、儀器、用品與試劑二、儀器、用品與試劑1 1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、試管、吸管 2 2、試劑：0.40.4臺(tái)酚蘭( (臺(tái)酚蘭 0.40.4克 加雙蒸水至100ml)100ml)3 3、材料：細(xì)胞懸液( (細(xì)胞懸液的制備：用毛吸管吸5 5滴細(xì)胞懸液到一小試管中，加入1 1滴臺(tái)盼藍(lán)染液（0.40.4）或苯胺黑，

24、混勻，靜置2 23min,3min,活細(xì)胞不會(huì)被染色，而死細(xì)胞著藍(lán)色，這樣加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。) )第71頁/共96頁三、操作步驟三、操作步驟 1 1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。 2 2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。 3 3、靜置3 3分鐘。 4 4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml/ml （ 四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)/4)稀釋倍數(shù)10104 4 /ml /ml第72頁/共96頁說明： 公式中除以4 4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4 4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)

25、。 公式中乘以2 2于染液是1 1：1 1稀釋。 公式中乘以10104 4因?yàn)橛?jì)數(shù)板每一個(gè)大格的體積為： 1.0mm1.0mm（長(zhǎng)）1.0mm1.0mm（寬）0.1mm0.1mm（高）0.10.1mmmm3 3 而 1ml1ml10001000mmmm3 3 。四、細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)四、細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)1.1.要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于10104 4個(gè)/ml/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；2.2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。 第73頁/共96頁 3.3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確； 4. 4. 數(shù)細(xì)胞

26、的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。 5. 5. 操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。 第74頁/共96頁五五、初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：、初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤： 1. 1. 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。 2. 2. 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。 3. 3. 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁 邊的槽中。第75頁/共96頁細(xì)胞計(jì)數(shù)原理第76頁/共96頁第77頁/共96頁四、 細(xì)胞凍存1原理：在不附加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中的水會(huì)結(jié)成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一系列變

27、化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。但如向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑甘油或二甲基亞礬(DMSO)，可使冰點(diǎn)降低，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，可避免上述現(xiàn)象的發(fā)生。 當(dāng)前最常用的保護(hù)劑仍為甘油和DMSO，它們對(duì)細(xì)胞無毒、分子量小、溶解度大、易穿透細(xì)胞，使用范圍在5 15之間，常用10。第78頁/共96頁2要點(diǎn): 為保持細(xì)胞最大存活率， 一般都采用慢凍快融的方法。第79頁/共96頁各種細(xì)胞對(duì)凍存速度的要求也不一樣；上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞耐受性可能大些，另外用什么防護(hù)劑合適和用量多大，要依細(xì)胞而定，初代培養(yǎng)細(xì)胞用DMSO 較好，一般細(xì)胞可用甘油；用量以較小為好。有人認(rèn)為人皮膚上皮細(xì)胞貯存在20

28、 30甘油中很好。原則上細(xì)胞在液氮中可貯存多年，但為妥善起見，凍存一年后，應(yīng)再復(fù)蘇培養(yǎng)一次，然后再繼續(xù)凍存。第80頁/共96頁第81頁/共96頁 程序(1) 細(xì)胞處理：選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；收集細(xì)胞24 小時(shí)前換液一次；(2)凍存液：先用培養(yǎng)液9 分+ DMSO 1 分(或甘油)配成10的DMSO 凍存液；按按常規(guī)法把細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)、令細(xì)胞密度達(dá)107ml (一般用4瓶細(xì)胞)， (4) 分裝：分裝入無菌凍存管中，每管加1.5 毫升細(xì)胞懸液；(5) 封口：擰緊凍存管蓋，仔細(xì)檢查，定要封嚴(yán)，必要時(shí)可浸入藍(lán)色液中觀察；第82頁/共96頁（6）入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時(shí)因受熱發(fā)生爆炸傷人

29、；紗袋一端系以線繩，末端扎有小牌， 注明：細(xì)胞名稱，凍存日期，以便日后查找；(7) 凍存：當(dāng)前已有專用細(xì)胞凍存器；在無凍存器的情況下，可用手工辦法：4 1h、-20 2h、85 1h、從把凍存物懸在液氮罐口開始算起，按-1 -12分鐘速度，在30 40 分鐘內(nèi)，下降到液氮面，再停30 分鐘后，直投入液氮中。 注意： 操作時(shí)應(yīng)帶保護(hù)眼鏡和手套，以免液氮傷人；細(xì)胞注入安瓶中后一定封嚴(yán)，最好使用塑料制螺口安額，但一定要擰緊螺帽。第83頁/共96頁五、冷凍細(xì)胞復(fù)蘇方法第84頁/共96頁 程序(1) 從液氮罐中取出凍存管；有時(shí)凍存管因末封嚴(yán)，浸入了液氮，取出后因安額內(nèi)液氮迅速氣化而發(fā)生爆炸(力量有限)，

30、因此應(yīng)帶防護(hù)眼鏡和手套；(2) 迅速放入盛有36 37水的搪瓷罐中，扣上蓋并不時(shí)搖動(dòng)，盡快解凍，要在一分鐘內(nèi)溶解；(3) 用70酒精擦試消毒后，凈化臺(tái)上打開蓋，用吸管吸出細(xì)胞懸液，裝入離心管中，再補(bǔ)加10ml 培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞懸?。坏?5頁/共96頁(4) 低速離心(500 1000 轉(zhuǎn)分) 5 分鐘。(5) 去上清，加入培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，再移裝入培養(yǎng)瓶中，置溫箱培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。 注意：凍存細(xì)胞數(shù)量要充分，在融解后能允許做1：10 倍或1：20 倍的稀釋(細(xì)胞數(shù)毫升)；一般每瓶細(xì)胞接種濃度為5105m1，因此凍存密度應(yīng)達(dá)到107ml，在稀釋20 倍時(shí)，仍能保持5105m

31、l 數(shù)量。第86頁/共96頁六、細(xì)胞運(yùn)送 一是用液氮或干冰保存，效果較好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸發(fā)均較快，適于空運(yùn)，比較麻煩；第87頁/共96頁二為充液法：(1) 選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，待達(dá)80或90匯合時(shí)，去掉舊培養(yǎng)液換入新培養(yǎng)液，量要達(dá)到培養(yǎng)瓶的頸部(過滿易污染)，保留少許空間，塞緊瓶塞；空氣過多運(yùn)輸中氣泡運(yùn)動(dòng)易使細(xì)胞脫落；(2) 妥善包裝和運(yùn)送；一般在不超過四五天到達(dá)目的地的情況下，對(duì)細(xì)胞活力無嚴(yán)重影響；(3) 到達(dá)后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留正常量，置37培養(yǎng)，次日傳代。第88頁/共96頁七、收到細(xì)胞的處理方式1. 收到細(xì)胞株包裹時(shí)， 請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情

32、形， 若有請(qǐng)立即通知。細(xì)胞株請(qǐng)盡速開始培養(yǎng)， 或立即冷凍保存(置于70 C， 隔夜后， 移到液氮)。 2. 冷凍細(xì)胞解凍程序: 1）依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。2）FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對(duì)細(xì)胞而言差異極大，請(qǐng)務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。 第89頁/共96頁3） 將培養(yǎng)基置于37 C 水槽中回溫，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化后，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之， 移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。 4） 依據(jù)細(xì)胞種類和濃度，于無菌操作臺(tái)內(nèi)取10 ml 培養(yǎng)基加至T25 或T75 flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內(nèi)之培養(yǎng)基， 混合均勻，放入 37 ，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 第90頁/共96頁5）對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1