DNA重組和基轉移

1、一、粘末端一、粘末端dna片段的連接片段的連接（一）具有相同粘末端（一）具有相同粘末端的的dna分子之間的連接分子之間的連接 使用堿性磷酸酶使用堿性磷酸酶處理載體處理載體dna，去掉其去掉其5末端末端的磷酸基，以防的磷酸基，以防質粒質粒dna的自身的自身環(huán)化環(huán)化 。（二）（二）具有不同粘性末端的具有不同粘性末端的dna分子之間的連接分子之間的連接 用兩種不同的限制性內切酶對載體和外源用兩種不同的限制性內切酶對載體和外源dna進行切進行切割后，在它們兩端會產生非互補的突出端，經割后，在它們兩端會產生非互補的突出端，經dna連接酶連接酶連接連接后即產生定向重組體。后即產生定向重組體。 hindii

2、iecorihindiiiecori對載體酶切hindiiiecori對基因酶切質粒載體的定向重組質粒載體的定向重組1、直接用t4連接酶連接3、銜接物連接法銜接物連接法銜接物銜接物是指用化學方法合成的一段由是指用化學方法合成的一段由1012個核苷酸組成，具個核苷酸組成，具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。4、dna接頭連接法接頭連接法 接頭的一端是齊平的，而另一端是某種內切酶的粘性末端，先接頭的一端是齊平的，而另一端是某種內切酶的粘性末端，先利用齊平末端連接方法將它與平端的外源利用齊平末端連接方法將它與平端的外源dna連

3、接起來，造成連接起來，造成人工粘性末端，即可再與之互補的粘性末端的載體人工粘性末端，即可再與之互補的粘性末端的載體dna相連接。相連接。 所謂載體與所謂載體與dna片段酶切位點不匹配，指載體與待克隆的片段酶切位點不匹配，指載體與待克隆的dna片段上的酶切位點不相同，因而用一種或兩種酶切制片段上的酶切位點不相同，因而用一種或兩種酶切制造不出可互補的粘性末端。造不出可互補的粘性末端。 1、按照平末端連接方法加上接頭。、按照平末端連接方法加上接頭。2、將凹端變?yōu)槠蕉?、將凹端變?yōu)槠蕉耍? 1）使用）使用klenowklenow酶在酶在4 4種種dntpdntp存在下，將存在下，將33凹端完全補平。凹端

4、完全補平。 （2 2）用）用s1核酸酶去除核酸酶去除3突出末端產生平端突出末端產生平端dna分子分子 3 3、使用大腸桿菌、使用大腸桿菌dna聚合酶聚合酶i klenow片段部分補平片段部分補平3凹凹端轉變成粘端。端轉變成粘端。tcgaagctgatcctag載體經載體經xhoi酶切形成：酶切形成：外源基因用外源基因用san3a酶切形成：酶切形成：用用klenow酶部分補平二者的酶部分補平二者的3 凹端，形成：凹端，形成：tcgaagctgatcctagcttcagga這樣，就可以實現(xiàn)有效重組。這樣，就可以實現(xiàn)有效重組。33335555通過依次加入、連接合成的dna接頭進行cdna克隆外源基因

5、與載體連接后轉化大腸桿菌可能的三種情況：外源基因與載體連接后轉化大腸桿菌可能的三種情況：（1）（2）（3）轉化e.coli（一）根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子（一）根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子1、抗藥性標記插入失活篩選法、抗藥性標記插入失活篩選法例：例：pbr322pbr322 如果外源基因插入到如果外源基因插入到tetr基因內部，基因內部，tetr抗性消失，表型抗性消失，表型為不抗四環(huán)素（為不抗四環(huán)素（tets）、）、而仍抗氨芐青霉素（而仍抗氨芐青霉素（ampr），），這樣的這樣的轉化細胞在含有轉化細胞在含有 amp的培養(yǎng)基仍可生長，但在含有四環(huán)素的的培養(yǎng)基仍可生長，但在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基

6、上不能再生長；反之，如果培養(yǎng)基上不能再生長；反之，如果ampr基因由于外源基因插基因由于外源基因插入其內部而失活，帶有重組入其內部而失活，帶有重組dna分子的轉化細胞在含有分子的轉化細胞在含有tet的的培養(yǎng)基平板上生長，在含有培養(yǎng)基平板上生長，在含有 amp的培養(yǎng)基不能生長。的培養(yǎng)基不能生長。 插入失活法篩選重組子插入失活法篩選重組子例；例；puc質粒質粒 在在lacz的大腸桿菌中，在平板培養(yǎng)中，菌落是白色的。的大腸桿菌中，在平板培養(yǎng)中，菌落是白色的。若在該細胞中引入若在該細胞中引入puc質粒，其上有質粒，其上有l(wèi)acz，質粒和大腸桿質粒和大腸桿菌菌dna可實現(xiàn)可實現(xiàn)互補，菌落呈藍色?；パa，菌

7、落呈藍色。 如果在質粒的多克隆位點的某個酶切點上克隆了外源基如果在質粒的多克隆位點的某個酶切點上克隆了外源基因，則因，則lacz基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的成有活性的-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。 （二）（二）根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體 進入受體細胞的重組進入受體細胞的重組dna分子中的外源基因如果在宿主分子中的外源基因如果在宿主細胞中能實現(xiàn)功能表達，產生出有功能活性的基因產物，那細胞中能實現(xiàn)功能表達，產生出有功能活性的基因產物，那么鑒定此種重組體最簡便的方法就是

8、表型特征的直接選擇法。么鑒定此種重組體最簡便的方法就是表型特征的直接選擇法。 1、凝膠電泳檢測法在臨近雙鏈在臨近雙鏈dna變性溫度下和高濃度（變性溫度下和高濃度（70%）的甲酰胺溶液中，）的甲酰胺溶液中，即所謂的即所謂的r-環(huán)條件下，雙鏈的環(huán)條件下，雙鏈的dna-rna分子要比雙鏈的分子要比雙鏈的dna-dna分子更為穩(wěn)定。因此，將分子更為穩(wěn)定。因此，將rna和和dna的混合物置于這種的混合物置于這種條件下，條件下，rna便會同雙鏈便會同雙鏈dna分子中與之互補的序列退火形分子中與之互補的序列退火形成穩(wěn)定的成穩(wěn)定的 dna-rna雜交分子，而另一條雜交分子，而另一條dna鏈則成為單鏈狀鏈則成為

9、單鏈狀態(tài)。這種由單鏈態(tài)。這種由單鏈dna分支和雙鏈分支和雙鏈dna-rna分支形成的分支形成的“泡狀泡狀”體，叫做體，叫做r-環(huán)結構環(huán)結構。 例：例：原位雜交篩選重組原位雜交篩選重組體菌落體菌落(或噬菌斑或噬菌斑) 免疫化學檢測法是利用抗體與抗原結合的高度特異性來鑒別基免疫化學檢測法是利用抗體與抗原結合的高度特異性來鑒別基因的。如果某個重組克隆中的外源基因能夠表達，在這個克隆因的。如果某個重組克隆中的外源基因能夠表達，在這個克隆中就存在著這個基因的特定蛋白，即可用特異性抗體來檢測。中就存在著這個基因的特定蛋白，即可用特異性抗體來檢測。常用的有標記抗體測定法和免疫沉淀測定法兩種常用的有標記抗體測

10、定法和免疫沉淀測定法兩種 。轉化菌落轉化菌落影印平板影印平板置于含氯仿飽合氣體的容器置于含氯仿飽合氣體的容器細菌裂解，抗原釋放細菌裂解，抗原釋放覆蓋吸附有未經標記的抗體的覆蓋吸附有未經標記的抗體的nc膜膜形成抗原抗體復合物形成抗原抗體復合物將將nc膜與膜與i125標記的抗體溫育標記的抗體溫育 放射自顯影放射自顯影與母板對照，挑取所需的重組克隆與母板對照，挑取所需的重組克隆 標記抗體測定法的步驟：標記抗體測定法的步驟：用免疫化學法檢測克隆在表達載體用免疫化學法檢測克隆在表達載體puc8上的基因上的基因六、轉譯篩選法六、轉譯篩選法 原理：原理： 外源外源dna蛋白質蛋白質翻譯翻譯能與某一能與某一特

11、定特定dna序列結合序列結合作為探針與克隆群體雜交作為探針與克隆群體雜交 轉譯篩選法是通過體外轉譯的手段鑒定陽性克隆的方法，轉譯篩選法是通過體外轉譯的手段鑒定陽性克隆的方法，可分為雜交抑制轉譯和雜交選擇轉譯兩種方法?？煞譃殡s交抑制轉譯和雜交選擇轉譯兩種方法。 要求：被研究的目的基因編碼有豐富的要求：被研究的目的基因編碼有豐富的mrna 。dna蛋白質蛋白質mrna蛋白質蛋白質雜交原理：原理：步驟：步驟：轉化菌落轉化菌落提取重組提取重組dna與與mrna總雜交總雜交形成形成dna-rna雜種分子雜種分子將總將總mrna（包括包括dna-rna分子分子提取出來提取出來體外轉譯體外轉譯蛋白電泳放射自

12、顯影蛋白電泳放射自顯影 （1）總總mrna體外轉譯體外轉譯蛋白電泳放射自顯影蛋白電泳放射自顯影 （2）經對比，（經對比，（1）比（）比（2）中少了一種蛋白質中少了一種蛋白質找到一種轉譯作用找到一種轉譯作用被抑制了的被抑制了的mrna 篩選出重組菌落篩選出重組菌落（或噬菌斑）（或噬菌斑） 觀察到觀察到在這種雜交選擇的轉譯中，存在著一種特殊活躍在這種雜交選擇的轉譯中，存在著一種特殊活躍的的mrna。重組體庫重組體庫提取提取dna固定在固定在nc膜上膜上與與mrna或總或總rna雜交雜交目的基因與對應的目的基因與對應的mrna雜雜交，交，mrna固定在固定在nc膜上膜上將分離將分離mrna的的進行體

13、外轉譯進行體外轉譯凝膠電泳或生物活性檢測凝膠電泳或生物活性檢測找出單菌落重組體找出單菌落重組體一、一、重組重組dna導入大腸桿菌導入大腸桿菌 （一）（一）轉化轉化 將外源將外源dna分子導入某一宿主細菌細胞的過程都叫分子導入某一宿主細菌細胞的過程都叫轉化轉化。 為了有效地使細菌吸收外源的為了有效地使細菌吸收外源的dna分子，我們通常要對它們分子，我們通常要對它們進行一些物理或化學的處理，處理后的細胞吸收外源進行一些物理或化學的處理，處理后的細胞吸收外源dna的的能力大大提高，被稱為能力大大提高，被稱為感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞。對于大腸桿菌細胞，一般采用對于大腸桿菌細胞，一般采用50mmol/l的的

14、cacl2溶液來制備溶液來制備感受態(tài)細胞。感受態(tài)細胞。（1）吸附階段：完整的雙鏈）吸附階段：完整的雙鏈dna分子吸附于感受態(tài)細胞表面。分子吸附于感受態(tài)細胞表面。（2）轉入階段：雙鏈）轉入階段：雙鏈dna分子解鏈，以單鏈形式進入細胞，分子解鏈，以單鏈形式進入細胞，而另一鏈則被降解。而另一鏈則被降解。（3）自身穩(wěn)定階段；外源質粒在細胞內又復制成雙鏈環(huán)型）自身穩(wěn)定階段；外源質粒在細胞內又復制成雙鏈環(huán)型dna。（4）表達階段：即目的基因隨質粒的復制子一起復制，并被表達階段：即目的基因隨質粒的復制子一起復制，并被轉錄、轉譯。轉錄、轉譯。dna分子轉化的過程：分子轉化的過程：質粒質粒dna的大小及構型對轉

15、化效率的影響：的大小及構型對轉化效率的影響：（1）大小 10kb，轉化效率很低（2）構型 超螺旋環(huán)形線狀（2）噬菌體的體外包裝噬菌體的體外包裝轉染轉染(transfection)：是指感受態(tài)的受體細胞捕獲和表達以是指感受態(tài)的受體細胞捕獲和表達以噬菌體為載體的重組噬菌體為載體的重組dna分子的過程。分子的過程。 （1）轉導和轉染的區(qū)別）轉導和轉染的區(qū)別轉導轉導(transduction)：通過通過噬菌體（病毒）顆粒感染噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細胞的途徑把外源宿主細胞的途徑把外源dna轉移到受體轉移到受體細胞的過程細胞的過程。 轉染：轉染：噬菌體噬菌體dna分子直接導入受體細胞的過程。分子直接導

16、入受體細胞的過程。 體外包裝：是指在體外模擬體外包裝：是指在體外模擬噬菌體噬菌體dna在受體細胞內的一在受體細胞內的一系列特殊的包裝反應過程，將重組系列特殊的包裝反應過程，將重組噬菌體噬菌體dna分子包裝成分子包裝成為成熟的具有感染能力的為成熟的具有感染能力的噬菌體顆粒的技術。噬菌體顆粒的技術。根據(jù)噬菌體噬菌體dna的體內包裝途徑，分別獲得缺失的體內包裝途徑，分別獲得缺失d包裝包裝蛋白的蛋白的噬菌體突變株和缺失噬菌體突變株和缺失e包裝蛋白的包裝蛋白的噬菌體突變噬菌體突變株。由于不具備完整的包裝蛋白，這兩種突變株均不能株。由于不具備完整的包裝蛋白，這兩種突變株均不能單獨包裝單獨包裝噬菌體噬菌體d

17、na，但將兩種突變株分別感染大腸但將兩種突變株分別感染大腸桿菌，從中提取缺失蛋白桿菌，從中提取缺失蛋白d的包裝物（含的包裝物（含e蛋白）和缺失蛋白）和缺失e蛋白的包裝物（含蛋白的包裝物（含d蛋白），兩者混合后就能包裝蛋白），兩者混合后就能包裝噬噬菌體菌體dna。（一）載體介導的轉化方法（一）載體介導的轉化方法 1、共培養(yǎng)法共培養(yǎng)法(cocultivation) 該方法是該方法是marton等等1979年以原生質體為受體建立起來的，隨后年以原生質體為受體建立起來的，隨后經過一系列的改進，現(xiàn)在是植物基因工程中最常用的一種轉化經過一系列的改進，現(xiàn)在是植物基因工程中最常用的一種轉化方法。該方法的主要原

18、理是將受體與供體在一起培養(yǎng)，通過接方法。該方法的主要原理是將受體與供體在一起培養(yǎng)，通過接觸感染而發(fā)生轉移，供體常用農桿菌、病毒載體等形式。觸感染而發(fā)生轉移，供體常用農桿菌、病毒載體等形式。 （1）原生質體）原生質體共培養(yǎng)法共培養(yǎng)法 取含重組取含重組ti質粒的農桿菌同剛剛長出細胞壁的原生質質粒的農桿菌同剛剛長出細胞壁的原生質體作短暫的共培養(yǎng)，促使農桿菌和植物細胞之間發(fā)生遺傳體作短暫的共培養(yǎng)，促使農桿菌和植物細胞之間發(fā)生遺傳物質的轉化。物質的轉化。從煙草無菌苗中分離原生質體，并預培養(yǎng)從煙草無菌苗中分離原生質體，并預培養(yǎng)24小時。小時。原生質體與農桿菌混合培養(yǎng)，原生質體濃度原生質體與農桿菌混合培養(yǎng)，

19、原生質體濃度l05ml、農桿農桿菌菌l07ml，20下保溫下保溫32小時。小時。沖洗去游離的細菌，將原生質體培養(yǎng)在有抗生素沖洗去游離的細菌，將原生質體培養(yǎng)在有抗生素(250mgl萬古霉素，萬古霉素，200mgl羧芐青霉素，羧芐青霉素，200mgl鏈霉素鏈霉素)的培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，這些抗生素抑制細菌生長，而對原生質體無毒害?；?，這些抗生素抑制細菌生長，而對原生質體無毒害。3周后，離心收集細胞團，再培養(yǎng)在無激素培養(yǎng)基上，周后，離心收集細胞團，再培養(yǎng)在無激素培養(yǎng)基上，2周內，周內，轉化的細胞團是激素非依賴性生長細胞團，在該培養(yǎng)基中可快轉化的細胞團是激素非依賴性生長細胞團，在該培養(yǎng)基中可快速生長，而非

20、轉化的細胞團則生長很慢，最后變褐死亡。速生長，而非轉化的細胞團則生長很慢，最后變褐死亡。 煙草原生質體與煙草原生質體與ti質粒轉移的共培養(yǎng)法程序為質粒轉移的共培養(yǎng)法程序為：圖該方法最早由該方法最早由horsch(1985)首創(chuàng)，首創(chuàng)，用于煙草轉化用于煙草轉化 。優(yōu)點：適用性廣，對于那些能優(yōu)點：適用性廣，對于那些能被農桿菌感染的、并能從葉子被農桿菌感染的、并能從葉子再生植株的各種植物均適用。再生植株的各種植物均適用。（4）活體接種）活體接種(inoculation in vivo) 原則上，該種共培養(yǎng)與原生質體共培養(yǎng)的方法和步驟是相原則上，該種共培養(yǎng)與原生質體共培養(yǎng)的方法和步驟是相同的，在供體上

21、，則必須是有侵染和感染能力的載體系統(tǒng)，同的，在供體上，則必須是有侵染和感染能力的載體系統(tǒng)，如帶有如帶有ti質粒的根癌農桿菌。質粒的根癌農桿菌。 所謂整體植株接種轉化法，是指人為地在整體植株上造成所謂整體植株接種轉化法，是指人為地在整體植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把農桿菌接種在創(chuàng)傷表面，或用針頭把農創(chuàng)傷部位，然后把農桿菌接種在創(chuàng)傷表面，或用針頭把農桿菌注射到植物體內，使農桿菌按照天然的感染過桿菌注射到植物體內，使農桿菌按照天然的感染過 程在植程在植物體內進行侵染，獲得轉化的植物愈傷組織或轉基因植株。物體內進行侵染，獲得轉化的植物愈傷組織或轉基因植株。接種后接種后2-3周，切下接種處部分組織培養(yǎng)周，切

22、下接種處部分組織培養(yǎng)4周，可產生愈傷周，可產生愈傷組織，進一步通過分化培養(yǎng)可獲得轉基因植株。組織，進一步通過分化培養(yǎng)可獲得轉基因植株。（1）雙鏈）雙鏈dna病毒轉化載體病毒轉化載體 這類病毒是以雙鏈這類病毒是以雙鏈dna作為遺傳物質，在這類病毒中，目作為遺傳物質，在這類病毒中，目前研究的最多的是花椰菜花葉病毒（簡稱前研究的最多的是花椰菜花葉病毒（簡稱camv, caullinus mozic virus）。）。 （2）單鏈）單鏈dna病毒轉化載體病毒轉化載體 genv顧名思義，可翻譯成顧名思義，可翻譯成“雙聯(lián)體病毒雙聯(lián)體病毒”或或“孿生病毒孿生病毒”。genv的感染范圍較廣，包括單子葉和雙子葉

23、植物，它們的的感染范圍較廣，包括單子葉和雙子葉植物，它們的傳播媒介是昆蟲。傳播媒介是昆蟲。 （3）單鏈）單鏈rna病毒轉化載體病毒轉化載體 迄今為止，還沒有建立起一個完善的以植物迄今為止，還沒有建立起一個完善的以植物rna病毒為基病毒為基因載體的基因轉化體系，但是因載體的基因轉化體系，但是rna病毒仍是一個很有希望病毒仍是一個很有希望作為基因工程載體的植物作為基因工程載體的植物病毒。 1、物理方法、物理方法 （1）基因槍法）基因槍法 80年代末期，由康奈爾大學的年代末期，由康奈爾大學的sanford最先提出，主要最先提出，主要是為了克服以往各種基因轉化技術的局限。是為了克服以往各種基因轉化技術

24、的局限。該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒加速沖擊細胞，把細胞擊孔，使目的基因進入受體。加速沖擊細胞，把細胞擊孔，使目的基因進入受體。 首先將鎢、金微粒首先將鎢、金微粒(直徑約直徑約0.4m，重量約重量約0.05mg)與供體與供體dna溶液溶液(12ll)混合并保溫，使混合并保溫，使dna吸附在金屬微粒的表面，然吸附在金屬微粒的表面，然后將該溶液置于所謂的后將該溶液置于所謂的“基因槍基因槍”儀器中，儀器高壓放電將金儀器中，儀器高壓放電將金屬微粒加速，直接噴射受體原生質或細胞，細胞擊穿成孔后，屬微粒加速，直接噴射受體原生質或細胞，細胞

25、擊穿成孔后，在鎢粒上的在鎢粒上的dna以及溶液中的以及溶液中的dna都可以進入受體細胞。都可以進入受體細胞。 操作技術程序為：操作技術程序為：基因槍示意圖基因槍所用材料：基因槍所用材料：（1）鎢粉使用起來經濟實惠，也可以得到較好的轉化效果；）鎢粉使用起來經濟實惠，也可以得到較好的轉化效果；但容易被氧化，顆粒易聚集，并且對植物細胞的毒害也比但容易被氧化，顆粒易聚集，并且對植物細胞的毒害也比金粉大。金粉大。（2）將）將dna包被到微載體上所用的試劑有亞精胺、包被到微載體上所用的試劑有亞精胺、cacl2、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等，但多用前兩種。乙醇、聚乙二醇、異丙醇等，但多用前兩種。（3）所用動力系

26、統(tǒng)：一類以火藥爆炸力作為動力加速微）所用動力系統(tǒng)：一類以火藥爆炸力作為動力加速微彈；另一類以電弧放電蒸發(fā)液滴作為動力；第三類以高壓彈；另一類以電弧放電蒸發(fā)液滴作為動力；第三類以高壓蒸汽作為動力。蒸汽作為動力。基因槍法的特點：基因槍法的特點：（1）轉化效率高。）轉化效率高。（2）受體廣泛。）受體廣泛。（3）操作簡單。）操作簡單。電激法是利用高壓電脈沖的作用對原生質體或細胞擊出電激法是利用高壓電脈沖的作用對原生質體或細胞擊出微孔而使基因轉移的一種新方法。微孔而使基因轉移的一種新方法。 原理：原理：細胞生物學研究證明，細胞膜的磷脂雙分子層可視為細胞生物學研究證明，細胞膜的磷脂雙分子層可視為一種電容，

27、其靜膜電位（一種電容，其靜膜電位（vm）約為約為l00mv，導電性很差。導電性很差。當把細胞置于外加電場中時，會使膜電位升高，雙分子層兩當把細胞置于外加電場中時，會使膜電位升高，雙分子層兩端電壓形成差勢，隨著外加電場電壓升高，細胞膜被壓縮變端電壓形成差勢，隨著外加電場電壓升高，細胞膜被壓縮變薄，當膜電壓升到一定數(shù)值時，膜被擊穿。薄，當膜電壓升到一定數(shù)值時，膜被擊穿。 可逆擊穿：擊穿小孔可在一定時間內復原?？赡鎿舸簱舸┬】卓稍谝欢〞r間內復原。不可逆擊穿：擊穿小孔不可修復，處理細胞成活率低。不可逆擊穿：擊穿小孔不可修復，處理細胞成活率低。操作程序：操作程序：將盛有細胞和將盛有細胞和dna混合物的

28、特制混合物的特制小容器置于電脈沖儀的正負極之間，小容器置于電脈沖儀的正負極之間，在在0度度下加高壓（下加高壓（2 4kv），），電電脈沖脈沖10分鐘后，將待處理的細胞轉分鐘后，將待處理的細胞轉移到新鮮培養(yǎng)基中生長移到新鮮培養(yǎng)基中生長2天，再進天，再進行篩選。存活細胞的回收率約為行篩選。存活細胞的回收率約為60% 80%。微量注射：用注射針或微針在受體細胞或組織穿刺成孔，微量注射：用注射針或微針在受體細胞或組織穿刺成孔，dna隨穿刺孔進入細胞或隨穿刺針頭隨穿刺孔進入細胞或隨穿刺針頭道進入。道進入。 真正的顯微注射：利用顯微注射儀，通過機械方法把外真正的顯微注射：利用顯微注射儀，通過機械方法把外源

29、源dnadna直接注入細胞質或細胞核的基因轉化方法。直接注入細胞質或細胞核的基因轉化方法。 顯微注射技術的關鍵是原生質體或具壁細胞或細胞團的固定。顯微注射技術的關鍵是原生質體或具壁細胞或細胞團的固定。對于植物細胞而言，首先必須建立固定細胞技術，然后才能對于植物細胞而言，首先必須建立固定細胞技術，然后才能進行定位顯微注射操作。常用的細胞固定方法有進行定位顯微注射操作。常用的細胞固定方法有3種：種：一、瓊脂糖包埋法一、瓊脂糖包埋法二、多聚賴氨酸粘連法二、多聚賴氨酸粘連法三、吸管支持法三、吸管支持法（5）超聲波法）超聲波法 此方法是利用直徑很小、能量很高的激光微束引起細胞膜可此方法是利用直徑很小、能

30、量很高的激光微束引起細胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細胞，然后用逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細胞，然后用激光光源代替熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜激光光源代替熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔，處于細胞周圍的外源穿孔，處于細胞周圍的外源dna分子隨之進入細胞。分子隨之進入細胞?；驹恚菏抢玫吐晱娒}沖超聲波的物理作用，擊穿細胞膜基本原理：是利用低聲強脈沖超聲波的物理作用，擊穿細胞膜造成通道，使外源造成通道，使外源dna進入細胞。進入細胞。 利用利用超聲波處理可避免脈沖高壓對細胞的損傷作用，有利于超聲波處理可避免脈沖高壓對細胞的損傷作用，有利于原

31、生質體的存活，是一種有潛力的轉化途徑。原生質體的存活，是一種有潛力的轉化途徑。（6）離子束法）離子束法 離了束作用在生物表面后可引起電子濺射，離子束的濺射好象離了束作用在生物表面后可引起電子濺射，離子束的濺射好象一把手術刀，對生物體進行微細加工，使生物體表面層層剝離，一把手術刀，對生物體進行微細加工，使生物體表面層層剝離，原來不連通的通道在一定距離內連通，后來的離子就可穿行較原來不連通的通道在一定距離內連通，后來的離子就可穿行較長的距離，落在預定的位置上。長的距離，落在預定的位置上。 （1）peg法法 是細胞融合劑，它可以使細胞膜之間或是細胞融合劑，它可以使細胞膜之間或dna與膜之間形與膜之間

32、形成分子橋，促使相互之間的接觸和粘連；還可以引起膜表成分子橋，促使相互之間的接觸和粘連；還可以引起膜表面電荷的紊亂，干擾細胞間的識別，從而有利于細胞膜之面電荷的紊亂，干擾細胞間的識別，從而有利于細胞膜之間的融合和外源間的融合和外源dna進入原生質體。進入原生質體。(2)脂質體法脂質體法脂質體是由人工構建的磷脂雙分子層組成的膜結構，可將脂質體是由人工構建的磷脂雙分子層組成的膜結構，可將dna包在其內，并通過脂質體與原生質體的融合或由于包在其內，并通過脂質體與原生質體的融合或由于原生質體的吞噬過程，把外源原生質體的吞噬過程，把外源dna轉運到細胞內。轉運到細胞內。早期：絲氨酸磷酸早期：絲氨酸磷酸+

33、膽固醇膽固醇第二代：二油酰乙醇胺磷脂第二代：二油酰乙醇胺磷脂+膽固醇膽固醇+軟脂酸軟脂酸 （1）花粉管通道法（）花粉管通道法（pollen-tube pathway） 在顯花植物中利用花粉在柱頭上萌發(fā)進入胚囊所留下的在顯花植物中利用花粉在柱頭上萌發(fā)進入胚囊所留下的通道，將外源基因滲入到胚囊中的基因直接轉移方法。通道，將外源基因滲入到胚囊中的基因直接轉移方法。（1）受體是整株水平，無須離體培養(yǎng)，突破了宿主范受體是整株水平，無須離體培養(yǎng)，突破了宿主范圍的限制，可應用于任何開花植物。圍的限制，可應用于任何開花植物。（2 2）轉化可用于重組）轉化可用于重組dnadna，甚至是總甚至是總dnadna。（3 3）操作技術條件寬容。操作技術條件寬容。（4 4）轉化率高。）轉化率高。 優(yōu)點：優(yōu)點：該法是用外源該法是用外源dna溶液直接來浸種、浸苗、浸穗等手段溶液直接來浸種、