實驗方案的格式6頁

1、實驗方案一.【實驗題目】：土壤中細菌的分離純化實驗二.【實驗設(shè)計思想】：細菌是具有很高實用價值的一類微生物, 世界各國對其研究與資源開發(fā)極為重視. 目前, 國內(nèi)有關(guān)細菌的區(qū)系調(diào)查及資源開發(fā)雖然有一些報道, 但對不同作物根際細菌的研究很少. 甘肅天水麥積山海拔1742m , 屬黃土高原潮濕區(qū), 植物生長土壤區(qū)有機質(zhì)含量豐富,本次實驗將以該地區(qū)的落葉松、馬尾松、白巖松、野豌豆等作物生長地區(qū)的土壤為材料, 分離鑒定其中的細菌, 探討不同作物根際土壤中細菌分布數(shù)量及種類的差異, 并且分析每一種菌種在植物生長過程中所起的作用，最后以此為依據(jù)來推斷麥積山大片地區(qū)內(nèi)土壤中微生物的分布豐富情況和它們對植物生長

2、作出的巨大貢獻.三.【實驗?zāi)康摹浚?.學會培養(yǎng)基最基本的制備方法。2.學會最基本的微生物滅菌、接種等基本操作過程。2.掌握最基本的分離、純化微生物的一系列操作操作。四.【試驗方法】：取天水麥積山不同植物根部的土壤作為土樣，通過對其土壤中微生物的一系列培養(yǎng)、分離、篩選最終分離出細菌得菌株，并稀釋平板菌落計數(shù)法進行數(shù)量測定四實驗原理:1.菌種來源：由于各種細菌對營養(yǎng)物質(zhì)需求不同，在不同地方采樣對選取所要的細菌含量和其它雜菌含量的多少直接有關(guān)，所以選擇微生物含量有可能豐富的土壤（天水麥積山植物根區(qū)）中采樣。2.培養(yǎng)基的選取：為了使所要的細菌能很好的生長，其它微生物生長受到一定的抑制，要用選擇培養(yǎng)基。

3、還要把細菌與其他微生物相區(qū)別，還要用鑒別培養(yǎng)基。為了達到既是選擇培養(yǎng)基又是鑒別培養(yǎng)基，選取牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。3.培養(yǎng)及分離純化：通過涂布培養(yǎng)法、平板劃線法等方法達到分離純化的目的。4.保藏：通過分離純化得到的菌種，接種與斜面培養(yǎng)基上，到一定時間后進行傳代培養(yǎng)保藏，使其不死亡、減少突變所引起的生物學性狀的改變。5.通過形態(tài)與染色鑒定：由于各種微生物有其特定的菌落形態(tài)特征和單細胞形態(tài)特征，可通過這些形態(tài)進行鑒定。還由于細胞壁組成不同可進行鑒別染色法進行鑒定，也可用產(chǎn)生不產(chǎn)生芽孢進行芽孢染色。通過以上方法可對所分離純化的菌種進行初步的鑒定。6.通過生理生化反應(yīng)進行鑒定：各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)了

4、很大的差異，如表現(xiàn)在對對大分子糖類和蛋白質(zhì)的分解能力，以及分解代謝的最終產(chǎn)物的不同，反映出他們有不同的酶系。我們在實驗室允許的條件下做了糖類發(fā)酵與氧化、是否能產(chǎn)生過氧化氫酶以及是否含有細胞色素氧化酶等生理生化試驗，進行再次鑒定。五【.實驗材料】：1.器材：玻璃燒杯、天平、搪瓷燒杯、三角瓶、量筒、漏斗、試管、培養(yǎng)皿、吸管、培養(yǎng)基分裝器、電爐、接種環(huán)、移液槍、PH試紙（PH5.49）、牛角匙、牛皮紙、棉花、紗繩、高壓蒸汽滅菌鍋等。2.牛肉膏、蛋白胨、NaCl、1mol/LNaCl、1mol/LHCl。六實驗步驟：1.配置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：(1).配方及其配量：牛肉膏0.3g，蛋白胨1gNaCl0

5、.5g,瓊脂粉1.5g水100ml注：PH7.27.4，每份如此，根據(jù)需要可改變量進行配置。（2）.稱取藥品:按培養(yǎng)及配方與配量分別稱取藥品，取少于總量的水于燒杯中，將各個培養(yǎng)及成分（瓊脂除外）逐一加入水中待溶。（3）加熱溶解：將玻璃被放在石棉網(wǎng)上（搪瓷燒杯可直接用文火加熱），用文火加熱并不斷攪拌，促使各藥品快速溶解，然后補充水分之所需培養(yǎng)基的量。（4）調(diào)節(jié)PH值：初配好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液是微酸性的，故需用1mol/LNaOH調(diào)PH至7.2-7.4。為避免調(diào)解時過堿，應(yīng)緩慢加入NaOH液，即要邊滴加NaOH邊攪勻培養(yǎng)液，然后用PH試紙側(cè)其酸堿度值。檢測培養(yǎng)基的 pH，若 pH 偏酸，可滴加

6、1mol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用 pH 試紙檢測，直至達到所需 pH范圍。若偏堿，則用 1mol/LHCl 進行調(diào)節(jié)。pH 的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。應(yīng)注意 pH 值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度.（5）.過濾:液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用 4 層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基此步可省略(6)分裝:披實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染。 分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的 15，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積內(nèi)一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的 1/4

7、為宜滅菌后垂直待凝。(7). 加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞，棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利透氣的作用。要使棉塞總長約 35 塞人試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的透氣，則可用 8 層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽或塑料蓋代替棉塞。(8)包扎:加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。 若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)先把試管扎成捆后，再于棉塞外包層牛皮紙。然后用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。(9)滅菌:將上述培養(yǎng)基于 121濕熱滅菌 20min。如因特殊情況沒能及

8、時滅菌，則應(yīng)放人冰箱內(nèi)暫時保存.（10）擺斜面 滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻至5060，然后制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上,并調(diào)整斜度,使斜面長度不超過試管總長的一半.（11）.無菌檢查:將滅菌的培養(yǎng)基放入37溫箱中培養(yǎng)24-48h, 無菌生長時可以使用,或放置在冰箱或清潔的櫥內(nèi),備用.2.配置無菌生理鹽水：稱0.85g NaCl至盛有100ml蒸餾水的三角瓶中，塞上棉塞，塞外包上一層牛皮紙，至加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)在121下滅菌20min即為無菌生理鹽水。3 取樣并制備土壤稀釋液：（1）.土壤前處理; 取出采集的土樣，去除其中較大的雜質(zhì)，將其攆碎、攆細待用。（2）制土液：稱出10克于帶有無菌玻

9、璃珠的250ml錐形瓶中，用已滅菌的量筒量取90ml無菌水溶解，振搖約20分鐘，使土樣與水充分混勻。點燃酒精燈在火焰附近，用無菌移液槍從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml 無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌移液槍從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1 、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 不同稀釋度的土壤溶液。4 .涂布接種：將上述 9個平板分別貼上標簽10-4、10-5、10-6各三個，然后用無菌移液槍分別由10-4、10-5、10-6 三管土壤稀釋液中各吸取0.1ml對號放入已寫好稀釋度的平板中 ，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕

10、的涂布均勻，室溫下靜置5到10分鐘，使菌液吸附進培養(yǎng)基?！咀⒁猓核械慕臃N工作必須在無菌室里面進行，在接種之前必須先進行滅菌】5培養(yǎng)。30攝氏度恒溫室中培養(yǎng)3天6 .觀察并進一步分離純化。 觀察菌落特征，并記錄。再倒兩個平板。點燃的酒精燈附近，從稀釋度合適的培養(yǎng)平板上挑取帶有溶磷圈的菌落，在新制的平板上劃線分離，30攝氏度恒溫室中培養(yǎng)3天7斜面培養(yǎng)放置斜面。挑取單個菌落接種到3個斜面上培養(yǎng)。置于2830恒溫箱中培養(yǎng)h.與此同時，用單菌落進行以下鑒定試驗革蘭氏染色1.1 涂片 常規(guī)涂片法 1.2 初染 滴加結(jié)晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)于涂片上，染色12min ，傾去染色液，細水沖洗至洗出液為無

11、色。 1.3媒染 用碘液媒染約l min ，水洗。 1.4 脫色 用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗，終止脫色，干燥。 1.5 復(fù)染 在涂片上滴加番紅液復(fù)染約23min ，水洗，然后用吸水紙吸干。1.6 鏡檢 干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。1.7 清潔顯微鏡。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯擦去鏡頭上的殘留油跡，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。芽孢染色(1）將培養(yǎng)的菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加35滴孔雀

12、綠染液于已固定的涂片上。（3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時可添加少許染液。加熱時間從染液冒蒸汽時開始計算約45分鐘。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液（約76）染10分鐘。（4）傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。（5）用番紅水溶液復(fù)染1分鐘，水洗。（6）待干燥后，置油鏡觀察，七.計數(shù)：常用的有平板菌落計數(shù)法，是根據(jù)每個活的細菌能長出一個菌落的原理設(shè)計的。取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋，然后將定量的稀釋液進行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，可算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。此法靈敏度高，是一種檢測污染活菌數(shù)的方法，也是目前國際上許多國家所采用的方法。使用該法應(yīng)注意：一般選取菌落數(shù)在30300之間的平板進行計數(shù)，過多或過少均不準確；為了防止菌落蔓延，影響計數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入O0012，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；本法限用于形成菌落的微生物另活菌計數(shù)法，其原理是每個活細菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。將待測樣品經(jīng)一系列 10 倍稀釋，然后選擇三個稀釋度的菌液，分別取 0.2ml 放入無菌平皿，再倒入適量的已熔化并冷至 45 左右的培養(yǎng)基，與菌