培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項

1、培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項1. 培養(yǎng)基配方的選定同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會有某些差別。因此，除所用的是標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)嚴(yán)格按其規(guī)定進(jìn)行配制外一般均應(yīng)盡量收集有關(guān)資料加以比較核對再依據(jù)自己的使用目的加以選用，記錄其來源。2 培養(yǎng)基的制備記錄每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄，包括培養(yǎng)推各稱，配方及其來源和各種成份的牌號。最終pH 值、消毒的溫度和時間制各的日期和制備者等，記錄應(yīng)復(fù)制一份，原記錄保存?zhèn)洳?，?fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。3.培養(yǎng)基成分的稱取培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂最好一次完成，不要中斷?？蓪⑴浞街糜诎鴤?cè)，每稱完一種成分即在配方上做出記號，并將所需稱取

2、的藥品一次取齊，置于左側(cè)，每種稱取完畢后，即移放于右側(cè)。完全稱取完畢后還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。4.培養(yǎng)基各成份的混合和溶化培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細(xì)菌不易生長。最好使用不銹鋼鍋加熱溶化也可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在鍋中溶化時、可先用溫水加熱并隨時擾動，以防焦化、如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。待大部分固體成分溶化后，再用較小火力使所有成分完全溶化迄至煮沸。如為瓊脂培養(yǎng)基，應(yīng)先用一部分水將瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中，因蒸發(fā)而丟

3、失的水分，最后必須加以補(bǔ)足。5.培養(yǎng)塞pH 的初步調(diào)整培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應(yīng)進(jìn)行pH 的初步調(diào)正，因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH 會有所變化，例如，牛肉浸液約可降低pH0.2.而腸浸液pH 卻會有顯著的升高。因此，對這個步驟，操作者應(yīng)隨時注意探索經(jīng)驗、以期能掌握培養(yǎng)基的最終pH ，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。pH 調(diào)正后，還應(yīng)將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。6培養(yǎng)基的過濾澄清液體培養(yǎng)基必須絕對澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透明無顯著沉淀，因此，須要采用過濾或其它澄清方法以達(dá)到此項要求。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法，濾紙應(yīng)拆疊成折扇成漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色

4、薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復(fù)過濾。如過濾法不能達(dá)到澄清要求、則須用蛋清澄清法。即將冷卻至55-60 的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶內(nèi)，裝入量不得超過燒瓶容量的1/ 2 ，每1000ml 培養(yǎng)基加入1-2個雞蛋的蛋白強(qiáng)力振搖3-5 分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過濾即可。若能自行沉淀者，亦可靜置冰箱中1-2日、吸取其上清液即可。7.培養(yǎng)基的分裝培養(yǎng)基的分裝，應(yīng)按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi)。分裝量不得超過容器裝盛量的2/ 3 。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其

5、外還雙用防水紙包扎（現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者）。分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝瓊脂抖面培養(yǎng)基時，分裝量應(yīng)以能形成2 / 3 底層和1/ 3 斜面的量為恰當(dāng)。分裝容器應(yīng)予先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝20ml 培養(yǎng)基于一小玻瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時滅菌，以為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用。8.培養(yǎng)基的滅菌一般培養(yǎng)基可采用121 高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。某些畏熱成分，如糖類，應(yīng)另行配成20% 如或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度

6、滅菌。血液、體液和抗生素等則應(yīng)從無菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50 左右的培養(yǎng)基中。瓊脂斜面培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后立即取出、待冷至55-60時，擺置成適當(dāng)斜面、待其自然凝固。9. 培養(yǎng)基的質(zhì)量測試每批培養(yǎng)基制備好以后應(yīng)仔細(xì)檢查一遍：如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測定其最終pH。將全部培養(yǎng)基放入36±1 恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去。用有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種1-2 管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)24- 48 小時，如無菌生長或生長不好。應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去，不能使用。10.培養(yǎng)基的保存培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處，最好能放于普

7、通冰箱內(nèi)。放置時間不宜超過一周，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制各記錄副頁或明顯標(biāo)簽。培養(yǎng)基的常規(guī)配制程序一、目的要求了解培養(yǎng)基的配制原理。了解培養(yǎng)基常規(guī)配制程序。了解培養(yǎng)基配制過程各環(huán)節(jié)的要求和注意事項。二、基本原理 正確掌握培養(yǎng)基基的配制方法是從事微生物學(xué)實驗工作的重要基礎(chǔ)，由于微生物種類及代謝類型的多樣性，因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異。但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同，例如器皿的準(zhǔn)備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無菌檢查等基本環(huán)節(jié)大致相向。三、實驗材科(一)藥品待配各種培養(yǎng)

8、的組成成分，瓊脂，1mol/L NaOH溶液，1mol/l (升，統(tǒng)一用大寫)HCl溶液。(二)儀器天平或臺秤，高壓蒸汽滅菌鍋。(三)玻璃器皿移液管、試管、燒杯、量筒、錐形瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。(四)其他物品藥匙、稱量紙、pH試紙、記號筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙、報紙等。四、實驗內(nèi)容(一)玻璃器皿的洗滌和包裝1玻璃器皿的洗滌 玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將錐形瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中，用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡。再用自來水及蒸餾水沖洗，洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。 2滅菌前玻璃器皿的包裝 (1)培養(yǎng)皿的包

9、裝 培養(yǎng)皿由一蓋底組成一套。可用報紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌。包裝后的培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用。 (2)移液管的包裝 在移液管的上端塞入小段棉花(勿用脫脂棉)。它的作用是避免外界及口中雜菌吹入管內(nèi)，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應(yīng)距管口約0.5cm左有。棉花自身長度約1-15cm。塞棉花時，可用一外圈拉直的曲別針，將少許棉花塞入管口內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜，吹時以能通氣而又不使棉花滑下為準(zhǔn)。先將報紙裁成寬約5cm左右的長紙條，然后將已塞好棉花的移液管尖端放在長條報紙的一端，約成45度角，折疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身，右手將移液管壓緊

10、，在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌(見圖511)。(二)液體及固體培養(yǎng)基的配制過程 1液體培養(yǎng)基配制 (1)稱量一般可用1/100粗天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品。先按培養(yǎng)基配方計算各成分的用量，然后進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。 (2)溶化 將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水(根據(jù)實驗需要可用自來水或蒸餾水)，用玻棒攪動，加熱溶解。 (3)定容 待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時，可預(yù)先配成較濃溶液，然后按比例吸取一定體積溶液，加入至培養(yǎng)基中。 (4)調(diào)pH 一般用pH試紙測定培養(yǎng)基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此

11、段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時，可用1mol/l NaOH或1mol/l HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH時，應(yīng)逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時用pH試紙測試，直至達(dá)到所需pH為止。 (5)過濾 用濾紙或多層紗布過濾培養(yǎng)基。一般無特殊要求時，此步可省去。 2固體培養(yǎng)基的配制配制固體培養(yǎng)基時，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(15-2)加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，最后補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去水分。(三) 培養(yǎng)基的分裝 根據(jù)不同需要，可將己配好培養(yǎng)基分裝入試管或錐形瓶內(nèi)，分

12、裝時注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。 1試管的分裝取一個玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾住玻璃管嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)(圖512)。裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150 mm時，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度14左右為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時，在瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝

13、于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高15(約34m1)；半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的13為宜。 2錐形瓶的分裝 用于振蕩培養(yǎng)微生物用時，可在250 m1錐形瓶中加入50 ml的液體培養(yǎng)基，若用于制作平板培養(yǎng)基用時，可在250 m1錐形瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉(按2計算)，滅菌時瓶中瓊脂粉同時被融化。(四)棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎 為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時為防止雜菌污染，則必須對通入試管或錐形瓶內(nèi)空氣預(yù)先進(jìn)行過濾除菌。通常方法是在試管及錐形瓶口加上棉花塞等。 1試管棉塞的制作制棉塞時，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和

14、食指扣成的圓孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團(tuán)孔中制成棉塞，然后直接壓入試管或錐形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞(圖513)。制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入。棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的23在試管內(nèi)，13在試管外(圖514)。目前也有采用金屬或塑料試管帽代替棉塞。直接蓋在試管口上。滅菌待用。將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或蓋好管帽的試管擁成一捆，外面包上一層牛皮紙。用鉛筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期，滅菌待用。 2錐形瓶棉塞制作 通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時為了進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包

15、在瓶口上。目前也有采用無菌培養(yǎng)容器封口膜直接蓋在瓶口，既保證良好通氣，過濾除菌又操作簡便，故極受歡迎。 在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包上八層紗布或蓋好培養(yǎng)容器封口膜的錐形瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好，滅菌待用。(五)培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基經(jīng)分裝包扎之后，應(yīng)立即進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，100Pa滅菌20min（滅菌條件根據(jù)培養(yǎng)基不同有所差異，含糖培養(yǎng)基105，30min）。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)暫存于冰箱中。(六)斜面和平板的制作 1斜面的制作 將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒上，使成適當(dāng)斜度，凝固后即成斜面(圖515)。斜面長度不超過試管長度12為宜。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時，滅菌后則應(yīng)垂直放置至冷凝。 2平板的制作 將裝在錐形瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，待冷至50左右傾入無菌培養(yǎng)皿中。溫度過高時，皿蓋上的冷凝水太多，溫度低于50，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。 平板的制作應(yīng)采用無菌操作，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿錐形瓶的底部或試管，左于同時用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，月左手大拇指將培養(yǎng)皿