蛋白純化層析技術(shù)和工藝放大

1、蛋白質(zhì)層析技術(shù)和工蛋白質(zhì)層析技術(shù)和工藝放大藝放大 曹杰 2013.05.11一、離子交換層析技術(shù)一、離子交換層析技術(shù)二、親和層析技術(shù)二、親和層析技術(shù)三、切向流過濾技術(shù)三、切向流過濾技術(shù)四、工藝放大四、工藝放大一、 陰離子交換陰離子交換 陽離子交換陽離子交換分辨率分辨率:1 選擇性: 填料的性質(zhì)及所帶功能基團(tuán)的數(shù)目、pH值、離子強度、洗脫條件2 柱效： 填料顆粒大小、層析柱裝填效果3 樣品： 能應(yīng)用的樣品量即樣品各成分性質(zhì)二、二、親和層析原理親和層析原理親和層析的策略親和層析的策略n配基與目標(biāo)蛋白的特異性n盡可能簡單n設(shè)計洗脫方案抗體純化抗體純化 基于基于G蛋白蛋白/A蛋白的蛋白的IgG的純化的

2、純化1. LMW Markers2. Mouse cell culture, nonredued,diluted 1:103. Pool,unbound material,nonredued,diluted 1:104. Pool,purified mouseIgG1, nonredued,diluted 1:10如何除去特定的污染物如何除去特定的污染物三、三、切向流過濾技術(shù)切向流過濾技術(shù)膜過濾原理膜過濾原理n膜過濾技術(shù)，又稱膜分離技術(shù)，是使用一定孔徑的過濾介質(zhì)將不同物質(zhì)按照大小和形狀進(jìn)行選擇性分級分離的物理分離方法。膜過濾技術(shù)的優(yōu)點膜過濾技術(shù)的優(yōu)點（1）快速高效、低能耗、硬件設(shè)備簡單易于維護(hù)

3、；（2）易于實現(xiàn)全自動化操作和線性放大（3）膜分離操作條件溫和、不涉及相變，有利于保持生物活性分子的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。過濾技術(shù)的分類過濾技術(shù)的分類n按照濾膜孔徑范圍可以分為常規(guī)過濾、微濾、超濾和反滲透等過濾技術(shù)的分類過濾技術(shù)的分類按照過濾操作方式分：n死端過濾( Normal Flow Filtration , NFF ) n切向流過濾( Cross -flow Filtration, CFF)切向流過濾n切向流過濾又稱錯流過濾，過濾過程中平行于膜的切向流不斷清洗沖刷膜表面，有效的緩解膜表面濾餅層和濃差極化層的形成，避免過濾阻力的快速增加，有利于保持穩(wěn)定的過濾流速和壓力，從而實現(xiàn)更高的膜過濾處理量

4、，延長濾膜壽命n根據(jù)濾膜流道結(jié)構(gòu)形式又可分為中空纖維柱和平板膜包過濾技術(shù)的選擇過濾技術(shù)的選擇n膜孔徑選擇n過濾操作方式選擇n切向流過濾技術(shù)選擇 膜孔徑選擇 (1)如希望目標(biāo)物質(zhì)透過膜孔，一般選擇膜孔徑大小為目標(biāo)物質(zhì)直徑5 - 10倍以上以降低過濾阻力，提高通透性：例如重組抗體純化中，CHO 細(xì)胞培養(yǎng)液的柱前澄清，建議使用0.2 或0.45 m 中空纖維微濾膜，可以保持單抗分子( 150 kDa ) 良好的膜通透性，實現(xiàn)高收率。膜孔徑選擇 (2) 如希望目標(biāo)物質(zhì)充分截留，一般需選擇膜孔徑小于目標(biāo)物質(zhì)直徑1/3 1/5 ：例如抗體150k的濃縮和緩沖液置換，一般選擇30k或50k超濾膜實現(xiàn)充分截留

5、. (3) 超濾膜用于細(xì)胞收集速度更快，操作更簡單：例如中空纖維750k超濾膜用于大腸桿菌或昆蟲細(xì)胞快速收集，取代離心機。 （4）微濾膜用于蛋白澄清去除細(xì)胞碎片具有更好的目標(biāo)蛋白收率：例如中空纖維0.1m濾膜用于較難過濾的大腸桿菌裂解液澄清，保護(hù)層析柱。過濾操作方式選擇過濾常見的操作方式包括NFF死端過濾和CFF切向流過濾切向流過濾技術(shù)的選擇中空纖維柱和平板膜包的優(yōu)缺點：切向流過濾技術(shù)的選擇n中空纖維濾膜具有開放式流道(Open Channel ) ，剪切力低且容塵量高，適合病毒和蛋白等生物大分子低剪切力的溫和超濾濃縮、可直接處理高固含量高黏度的復(fù)雜料液，如細(xì)胞菌體收集、裂解液澄清和硫酸銨沉淀

6、收集等應(yīng)用。n平板膜包的篩網(wǎng)流道結(jié)構(gòu)( Screen Channel ) ，適合無固體顆粒的低黏度低濃度樣品的濃縮，如層析柱之間的緩沖液交換和濃縮等。切向流過濾技術(shù)的選擇n中空纖維濾膜可以用于微濾或超濾，用于蛋白/ 病毒等濃縮洗濾或直接處理高固含量料液；n而平板膜包常用于澄清料液的超濾濃縮，對于高固含量高黏度樣品的澄清過濾存在較大局限性，易于堵塞流道。四、四、 Process Scale up 工藝放大工藝放大 菌種的特性，相關(guān)論文、專利，藥典，試劑等菌種的特性，相關(guān)論文、專利，藥典，試劑等親和層析、離子層析、疏水層析、分子篩、超濾，層析介質(zhì)粒徑大小，純化步驟等載體構(gòu)建優(yōu)化、發(fā)酵工藝優(yōu)化、純化

7、工藝優(yōu)化、檢測方法選擇等發(fā)酵工藝是否能夠放大、純化工藝是否能放大等，工藝穩(wěn)定性環(huán)境安全性：廢氣廢液排放，菌種的處理，選擇有關(guān)試劑的替代品知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)，專利什么時候到期？Regulatory requirements了解相關(guān)法律、法規(guī)、驗證計劃、QA和QC等如何保證質(zhì)量？確定分析方法、檢測方法、如何保證工藝穩(wěn)定性。工藝放大工藝放大（以蛋白純化為例）n要考慮的問題要考慮的問題： （1）樣品、試劑：樣品來源（原核或真核、胞內(nèi)或胞外等），目標(biāo)蛋白的性質(zhì)（等電點、分子量、穩(wěn)定性等），緩沖液（pH、溶質(zhì)類型、鹽離子濃度等）（2）介質(zhì)的選擇（離子、疏水、親和填料，介質(zhì)的化學(xué)耐受性、強度，載量，不同批次介質(zhì)的穩(wěn)定性）（3）質(zhì)量