973標(biāo)書黃芪對腹膜透析效能及腹膜間皮細(xì)胞與腹腔免

1、百度文庫 - 讓每個人平等地提升自我登記序號：計劃類別：分類代碼：項目編號：科技項目計劃設(shè)計任務(wù)書項目名稱：黃芪對腹膜透析效能及腹膜間皮細(xì)胞與腹腔免疫功能的影響承擔(dān)單位：單位地址：郵編：項目負(fù)責(zé)人：電話：職務(wù)職稱：主管部門：南京市衛(wèi)生局填報日期： 2002 年 04 月 26 日江蘇省科學(xué)技術(shù)廳江蘇省科學(xué)技術(shù)廳二二 oooo 一年制一年制1百度文庫 - 讓每個人平等地提升自我一、立項依據(jù)：一、立項依據(jù)：1 1、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢及理論實踐依據(jù)：、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢及理論實踐依據(jù)：隨著腹膜透析（peritoneal dialysis，pd）技術(shù)的不斷提高和透析理論的日趨完善，尤其是

2、1976 年 popovich 提出的連續(xù)非臥床腹膜透析（continuousambulatory peritoneal dialysis，capd）治療方法帶來了腹膜透析的空前繁榮。近年來的流行病學(xué)資料表明接受腹膜透析治療的終末期腎功能不全（end-stagerenal disease， esrd） 患者正以每年%的比例迅速增長， 目前全球已有超過 120000的患者在接受腹膜透析治療。 腹膜透析因其相對于血液透析更高的生活質(zhì)量、 顯著的殘余腎功能保護(hù)、 優(yōu)于或等于血液透析的生存率以及較少的資金花費， 故有作者提出，腹膜透析應(yīng)該是腎臟替代療法的首選1,21,2。然而， 隨著腹膜透析患者壽命的

3、延長， 腹膜透析的遠(yuǎn)期并發(fā)癥腹膜功能衰竭已成為 esrd 患者透析技術(shù)性失敗的最重要的原因 ，并成為制約腹膜透析發(fā)展的“瓶頸” 。 資料顯示約 1/3 的腹膜透析患者 6 年后因腹膜功能衰竭而退出透析治療。 腹膜功能衰竭與長期腹膜透析后腹膜結(jié)構(gòu)和功能破壞進(jìn)而導(dǎo)致腹膜超濾失敗以及溶質(zhì)轉(zhuǎn)運功能障礙密切相關(guān) 。腹膜透析液的生物不相容性是導(dǎo)致腹膜功能衰竭的首要原因， 腹膜間皮細(xì)胞作為腹膜組成部分在這一過程中扮演著重要角色。近年來隨著人腹膜間皮細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法和腹膜透析動物模型的確立， 腹膜功能衰竭的機理得以初步闡明。 腹膜間皮細(xì)胞在長期非生理性透析液刺激下， 轉(zhuǎn)移生長因子（tgf-）mrna 過度表達(dá)

4、，tgf-作為細(xì)胞增殖與細(xì)胞外基質(zhì)合成的重要調(diào)節(jié)因子，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增加和腹膜纖維化 ，最終導(dǎo)致腹膜超濾失敗和溶質(zhì)轉(zhuǎn)運功能障礙。同時 tgf-也是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞因子，組織病理學(xué)證實腹膜功能衰竭的重要特征表現(xiàn)為腹膜間皮細(xì)胞的喪失，過多的tgf-表達(dá)將增加間皮細(xì)胞的凋亡， 導(dǎo)致間皮細(xì)胞的完整性受到破壞， 研究表明完整的間皮細(xì)胞層可以顯著延緩腹膜纖維化的進(jìn)程。 其次，腹膜透析的主要并發(fā)癥腹膜感染也是導(dǎo)致腹膜功能衰竭的重要原因,反復(fù)的炎癥刺激使腹膜局部高水平 tgf-持續(xù)存在致使腹膜發(fā)生纖維化和硬化 。 目前公認(rèn)長期腹膜透析時腹腔細(xì)胞免疫功能抑制是導(dǎo)致腹膜反復(fù)感染的主要原因,尤其是被認(rèn)為是

5、腹腔細(xì)胞免疫功能最重要組成部分和腹膜抵抗細(xì)菌感染第一道屏障的巨噬細(xì)胞功能的明顯抑制。 研究表明， 腹膜在長期非生理性透析液的刺激下， 巨噬細(xì)胞功能受到抑制，當(dāng)腹膜發(fā)生感染時透析患者腹腔巨噬細(xì)胞功能指標(biāo)包括吞噬指數(shù)、 白細(xì)胞介素 1（il-1）和腫瘤壞死因子（ tnf-）水平顯著降低，如果改用更符合生理條件的透析液則可以使腹腔巨噬細(xì)胞功能得到明顯增強， 從而增強腹膜對感染的抵抗能力，減少腹膜炎的發(fā)生 。最近，腹膜血管在腹膜功能衰竭中的作用也得到重視，充足的血流除了能有效增強腹膜的抵抗力減少腹膜炎的發(fā)生外 ，也是維持長期腹膜透析患者腹膜轉(zhuǎn)運功能的重要因素。 腹膜血管血流量減少時腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運和腹膜超

6、濾率均顯著下降 ，研究顯示長期腹膜透析患者腹膜血管內(nèi)皮細(xì)胞依賴的血管舒張因子顯著減少， 從而影響腹膜透析的效能， 而如在腹膜透析液中添加擴血管物質(zhì)硝普納則能有效提高腹膜透析患者的透析效果。299887766554433百度文庫 - 讓每個人平等地提升自我基于上述研究結(jié)果，近年來臨床醫(yī)師一直致力于兩方面的研究。一是研究更符合生理條件以及不影響腹膜免疫功能的全新的腹膜透析液。 雖然已有諸如含多聚糖、含氨基酸、含碳酸氫根等多種透析液的體外實驗的報道， 但事實上所有這些透析液并不能完全替代葡萄糖作為滲透性物質(zhì)的作用， 其臨床應(yīng)用前景尚不明確。另一方面， 腎臟病醫(yī)師通過在現(xiàn)有的透析液中添加一些物質(zhì)來達(dá)到

7、保護(hù)和改善腹膜功能的目的。 有研究表明在透析液中加入雙嘧莫達(dá)能顯著降低小鼠腹透液中 tgf-的含量，而加入透明質(zhì)酸可以在保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞方面起到一定的效果。中藥黃芪是一種含有多糖、甙、黃酮和微量元素等多種成分的物質(zhì)，其具有多重藥理作用1010。黃芪能顯著抑制炎癥因子 tgf-的表達(dá)，從而延緩肝臟、腎1111臟等多種臟器疾病時發(fā)生纖維化的進(jìn)程； 能明顯減緩人胚二倍體細(xì)胞自然衰老過程延長細(xì)胞壽命約 1/3 左右； 能有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能， 通過向小鼠腹腔注射黃芪可以發(fā)現(xiàn)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能得到增強， 從而增強腹膜抗菌能力； 黃芪還具有擴血管的作用， 研究顯示其能顯著抑制血管收縮物質(zhì)內(nèi)皮素的釋放，

8、 從而可能起到擴張血管增加血流量的作用1212。根據(jù)黃芪的上述作用，可以推測，在腹膜透析液中加入黃芪可以起到延長腹膜間皮細(xì)胞的壽命、抑制間皮細(xì)胞 tgf-的分泌、提高腹腔巨噬細(xì)胞功能、改善局部微循環(huán)，從而阻止/延緩腹膜纖維化和防止腹膜感染的發(fā)生，達(dá)到阻止/延緩腹膜功能衰竭的目的。然而關(guān)于黃芪在腹膜透析中的應(yīng)用尚無相關(guān)報道。主要參考文獻(xiàn)：主要參考文獻(xiàn)：1. thodis e, passadakis p, vargemezis v, oreopoulos dialysis: better than, equalto, or worse than hemodialysis? data worth k

9、nowing before choosing a dialysis modality.perit dial int ,2001; 21:25-35.2. van biesen w, vanholder r, lameire role of peritoneal dialysis as the first-linerenal replacement dial int , 2000;20: 375 - 3833. an s. de vriese, siska mortier, norbert h,et happens to the peritoneal membranein long-term p

10、eritoneal dialysis? perit dial int, 2001;vol. 21 ;:s9-284devuyst o,topley n,williams and functional changes in the dialysed peritonealcavity:impact of more biocompatible dial transplant,2002;17(3):12-5 gc,schiemann wp,lodish role of transforeing growth factor beta in human engl jmed ,2000;342:1350-8

11、6lin cy,chen wp,yang ly,et transforming growth factor-betal 1 expression mayptedictperitonealfibrosisincapdpatientswithfrequentperitonitisjnephrol,1998;18:513-9 s,holmes cj,mackenzie rk, dialysis with bicarbonate/lactate-buffered peritonealdialysis fluids in a long-term improvement in ex vivo perito

12、neal macrophage a socnephrol,2002;13:s97-1038park increasing severnity of peritonitis in long-term peritoneal dialysis renreplace ther，1998；5：185-933百度文庫 - 讓每個人平等地提升自我 c,brendolan a,crepaldi c,et and clearence studies in human isolated pertonealvascular purif,1994;12:233-4210.耿長山。黃芪的免疫藥理研究進(jìn)展。中西醫(yī)結(jié)合雜志

13、，1986；6：62-6411孟慶云。中國中醫(yī)藥發(fā)展 50 年。p28012伍敦裕，林海玲。黃芪注射液治療慢性腎功能不全患者血漿內(nèi)皮素變化及其意義。實用醫(yī)學(xué)雜志，1998；14：6112 2、研究目的與意義：、研究目的與意義：研究目的：研究目的：通過體外人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)觀察中藥黃芪在抑制由高糖引起的 tgf-過度表達(dá)中的作用， 通過動物實驗從組織病理學(xué)角度觀察黃芪對腹膜間皮細(xì)胞完整性的維護(hù)和腹膜纖維化的抑制以及巨噬細(xì)胞功能調(diào)節(jié)等方面的作用， 通過臨床觀察了解黃芪對腹膜轉(zhuǎn)運功能和免疫功能的影響，從不同層面了解黃芪在阻止/延緩腹膜功能衰竭中的作用及其機制， 為臨床上改善長期腹膜透析患者透析療效提

14、供一種新的治療方法。研究意義：研究意義：隨著臨床腹膜透析的廣泛應(yīng)用以及腹膜透析患者壽命的延長， 臨床上因長期腹膜透析導(dǎo)致腹膜功能衰竭進(jìn)而透析失敗的患者越來越多。 中藥黃芪在我國分布廣泛且有 2000 多年的應(yīng)用歷史。目前臨床上已有黃芪注射液制劑，并且由于黃芪可以直接注入腹腔，因此通過從不同層面了解黃芪在阻止/延緩腹膜功能衰竭中的作用及其機制的研究，在臨床上推廣使用黃芪來阻止/延緩腹膜功能衰竭從而延長 esrd 患者腹膜透析時間、提高透析質(zhì)量、減少透析失敗率，提高腹膜透析遠(yuǎn)期療效具有廣泛的應(yīng)用前景。3 3、技術(shù)查新：、技術(shù)查新：參見附頁。參見附頁。4百度文庫 - 讓每個人平等地提升自我二、研究內(nèi)

15、容：二、研究內(nèi)容：研究內(nèi)容：研究內(nèi)容：本課題采用體外細(xì)胞培養(yǎng)、 動物實驗、 組織病理學(xué)與臨床相結(jié)合的系統(tǒng)研究方法，從多個方面研究中藥黃芪在防止/延緩腹膜功能衰竭中的作用，并從不同層面和角度解釋其作用機理。 通過體外人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)了解黃芪在抑制間皮細(xì)胞 tgf-表達(dá)方面的作用；通過動物實驗從組織病理學(xué)的角度直觀了解黃芪在間皮細(xì)胞保護(hù)以及在阻止/延緩腹膜纖維化中的作用；通過臨床應(yīng)用，了解黃芪對腹膜轉(zhuǎn)運功能以及免疫功能方面的影響。關(guān)鍵技術(shù)和技術(shù)難點：關(guān)鍵技術(shù)和技術(shù)難點：（1）體外人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)方法的建立；（2）動物腹膜透析模型及干預(yù)方法的建立；（3）tgf-、tnf-免疫組化檢測；（4

16、）巨噬細(xì)胞吞噬功能的誘導(dǎo)及檢測；（5）標(biāo)準(zhǔn)腹膜透析腹膜轉(zhuǎn)運功能改變的研究。課題的特色和創(chuàng)新之處：課題的特色和創(chuàng)新之處：（1）腹膜功能衰竭是一多因素參與的病理過程，由于西藥作用較為單一，因此在如何有效阻止/延緩腹膜功能衰竭的研究中顯得較為局限，而中藥黃芪具有多重藥理作用，在阻止/延緩腹膜功能衰竭的研究中具有較大的優(yōu)勢。（2）由于部分藥物無法進(jìn)行腹腔內(nèi)應(yīng)用，因此以往的研究大多停留在體外試驗的水平，而黃芪可以安全地應(yīng)用于腹腔內(nèi)注射， 本課題的研究成果能夠直接應(yīng)用于臨床。（3）通過從體外細(xì)胞培養(yǎng)、動物實驗、組織病理學(xué)以及臨床全面地對黃芪在阻止/延緩腹膜功能衰竭中的作用及機制進(jìn)行研究，至今尚未見類似的研

17、究報道。主要技術(shù)指標(biāo)：主要技術(shù)指標(biāo)：（1）黃芪抑制間皮細(xì)胞tgf-分泌的指標(biāo)；（2）反映巨噬細(xì)胞免疫功能的tnf-分泌水平以及吞噬功能的指標(biāo)；（3）黃芪對腹膜間皮細(xì)胞的維護(hù)和抑制纖維化的指標(biāo)；（3）黃芪對腹膜轉(zhuǎn)運功能的影響。5百度文庫 - 讓每個人平等地提升自我三、研究方法及技術(shù)路線：三、研究方法及技術(shù)路線：研究工作總體思路：研究工作總體思路：本研究首先通過人腹膜間皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法在培養(yǎng)基中添加黃芪觀察其抑制由高糖引起的間皮細(xì)胞 tgf-過度表達(dá)中的作用，了解黃芪與腹膜間皮細(xì)胞 tgf-表達(dá)之間的關(guān)系。然后通過腹膜透析動物模型從組織病理學(xué)角度直觀了解黃芪對腹膜間皮細(xì)胞損傷的保護(hù)以及抑制腹膜

18、纖維化方面的作用。 最后通過在臨床上的應(yīng)用了解黃芪對腹膜轉(zhuǎn)運功能以及腹膜免疫功能的影響， 并探討其作用機制。從而為臨床上阻止/延緩長期腹膜透析患者因腹膜纖維化、腹膜反復(fù)感染導(dǎo)致的腹膜功能衰竭提供新的治療方法。技術(shù)路線：技術(shù)路線：（1）體外細(xì)胞培養(yǎng)部分： 從擇期手術(shù)小網(wǎng)膜切除的標(biāo)本獲得人網(wǎng)膜組織， 按照文獻(xiàn)方法培養(yǎng)間皮細(xì)胞，通過調(diào)整原代（1-9 代）人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，在%、%葡萄糖條件下觀察添加與不添加黃芪對腹膜間皮細(xì)胞 tgf-表達(dá)的影響，tgf-用免疫組化方法檢測。（2）動物模型部分： 按照標(biāo)準(zhǔn)腹膜透析小鼠動物模型建立方法建立小鼠腹膜透析模型， 分別采用添加和不添加黃芪的葡萄

19、糖濃度為%、 %的透析液進(jìn)行腹膜透析，8 周后取小鼠腹膜組織，10%甲醛溶液固定、脫水、 石蠟包埋后 he、pas、pasm染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。（3）臨床部分： 在臨床上選擇長期腹膜透析患者， 采用自身對照的方法觀察添加黃芪前后患者腹膜轉(zhuǎn)運功能和患者透析液中 tnf-濃度以及巨噬細(xì)胞吞噬功能的變化。（4）總結(jié)資料，分析結(jié)果。研究方法：研究方法：（1）組織細(xì)胞培養(yǎng)方法。（2）動物實驗學(xué)研究方法。（3）組織病理學(xué)方法。（4）生化分析方法。6百度文庫 - 讓每個人平等地提升自我四、現(xiàn)有研究條件和工作基礎(chǔ)：四、現(xiàn)有研究條件和工作基礎(chǔ)：1 1、現(xiàn)有工作基礎(chǔ)：、現(xiàn)有工作基礎(chǔ)： -臨床上

20、有大量的長期腹膜透析的隨訪病人。 研究者已成功掌握了人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)方法和腹膜透析小鼠動物模型建立方法， 具備了 tgf-、 tnf-的檢測能力， 以及本研究所需的組織病理學(xué)檢查條件。 同時在預(yù)實驗中已經(jīng)得出黃芪能有效抑制體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞 tgf-的表達(dá)。因此，本研究具有很強的可行性和較高的成功率。2 2、項目負(fù)責(zé)人近年來研究成績簡介、項目負(fù)責(zé)人近年來研究成績簡介近年發(fā)表相關(guān)論文：近年發(fā)表相關(guān)論文：近年研究成果：近年研究成果：3 3、研究隊伍：、研究隊伍：4 4、支撐條件：、支撐條件：五、計劃進(jìn)度：五、計劃進(jìn)度：1 1、總進(jìn)度和年度進(jìn)度：、總進(jìn)度和年度進(jìn)度：課題準(zhǔn)備，訂購動物與試劑。細(xì)

21、胞培養(yǎng)研究部分。動物實驗部分。臨床部分?？偨Y(jié)資料，分析結(jié)果，科研鑒定。2 2、項目完成形式：、項目完成形式：（1）項目完成可通過論文形式考察，預(yù)計可在核心期刊發(fā)表論文4-6 篇。（2）細(xì)胞培養(yǎng)研究部分通過對 tgf-表達(dá)的檢測可以了解高糖在腹膜間皮細(xì)胞tgf-表達(dá)中作用，了解黃芪在拮抗tgf-過度表達(dá)中的作用。（3）動物實驗部分通過腹膜組織病理學(xué)檢查了解黃芪對腹膜間皮細(xì)胞損傷的保護(hù)以及抑制腹膜纖維化方面的作用，可通過病理切片形式表達(dá)。7百度文庫 - 讓每個人平等地提升自我（4）臨床研究部分可通過治療前后患者tgf-、tnf-水平以及巨噬細(xì)胞吞噬功能了解腹膜功能的改變，用差異性來表示。（5）通過

22、成果考核。（6）成果可達(dá)到國際先進(jìn)水平。六、項目研究預(yù)期成果及效益：六、項目研究預(yù)期成果及效益：預(yù)期達(dá)到的主要技術(shù)指標(biāo)：預(yù)期達(dá)到的主要技術(shù)指標(biāo)：（1）黃芪有效抑制體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞的tgf-的分泌。（2）應(yīng)用黃芪后在腹膜透析動物模型腹膜組織病理檢查中發(fā)現(xiàn)黃芪能維護(hù)腹膜間皮細(xì)胞的完整性和抑制腹膜纖維化的發(fā)生。（3）黃芪能改善腹膜透析病人的腹膜轉(zhuǎn)運功能和增強巨噬細(xì)胞的免疫功能。（4）該研究成果預(yù)期達(dá)到國際領(lǐng)先水平， 為臨床上阻止/延緩腹膜功能衰竭提供新的治療方法。經(jīng)濟效益和社會效益：經(jīng)濟效益和社會效益：通過本課題的系列研究，預(yù)期可以明確黃芪有效阻止/延緩長期腹膜透析病人腹膜功能衰竭的進(jìn)程，從而

23、延長腹膜透析時間、提高腹膜透析質(zhì)量。從經(jīng)濟效益來講，腹膜透析是一種價格低廉的腎臟替代療法， 長期的腹膜透析必將大大減輕社會及其個人的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。從社會效益來講，腹膜透析具有較高的生活質(zhì)量，可以使 esrd 病人重返社會并參加力所能及的工作， 產(chǎn)生積極的社會效應(yīng)。 并且，通過此療法的成功也可以提升中藥治療在國際上的影響。8百度文庫 - 讓每個人平等地提升自我七、承擔(dān)項目單位及分工七、承擔(dān)項目單位及分工八、經(jīng)費概算及來源：八、經(jīng)費概算及來源：科科目目業(yè)業(yè) 務(wù)務(wù) 費費經(jīng)經(jīng)費費預(yù)預(yù)算算總總額額及及實驗材料實驗材料分分類類名名稱稱文獻(xiàn)檢索論文發(fā)表科研鑒定胰蛋白水解酶小牛血清rmpi1640 培養(yǎng)基ham-12 培養(yǎng)基抗細(xì)胞角蛋白抗體抗波形蛋白抗體抗因子抗原抗體抗 cd45 抗體tgf-單克隆抗體tnf-單克隆抗