GFP在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應用

1、1. GFP在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應用在活體內(nèi)檢測蛋白與蛋白相互作用，對我們理解生物學過程至關(guān)重要。研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典技術(shù)是酵母雙雜交系統(tǒng)。它是一個基于轉(zhuǎn)錄因子模塊結(jié)構(gòu)的遺傳學方法，由Fields和Song等人于1989年首次建立，隨后在蛋白相互作用研究領域廣泛應用。酵母雙雜交系統(tǒng)的實驗過程，就是將已知蛋白作為誘餌蛋白，在系統(tǒng)中捕獲與其相互作用的蛋白質(zhì)。來源于水母的GFP在此系統(tǒng)中得到了廣泛應用，人們可用它直接監(jiān)測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用?？茖W家利用兩個增強型GFP（EGFP）片段重建功能，從而開發(fā)出一種新型的報告系統(tǒng)以應用于酵母雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)在基因水平上將EGFP片段分別與誘餌蛋

2、白及要捕獲的蛋白融合，在體內(nèi)共表達，從而研究蛋白與蛋白間的相互作用。與現(xiàn)有的酵母雙雜交系統(tǒng)相比，EGFP系統(tǒng)中的誘餌、靶蛋白載體的報告基因和復制控制元件均得到了改進。在酵母中，當?shù)鞍着c蛋白發(fā)生相互作用時，分開的EGFP能夠重新結(jié)合而發(fā)出熒光(圖7)1.1 構(gòu)建分離的EGFP報告質(zhì)粒以分離的EGFP作為酵母雙雜交系統(tǒng)的報告基因有明顯的優(yōu)勢，因為它不需要外源底物及輔助因子就能發(fā)出熒光。從理論上講，該報告系統(tǒng)的基礎是酵母中蛋白與蛋白間發(fā)生相互作用后，被分開的熒光蛋白片段會再次互相結(jié)合從而發(fā)出熒光。EGFP報告質(zhì)粒包括pNEGFP和pCEGFP。構(gòu)建模式見圖8。在乙醇脫氫酶1（ADH1）啟動子控制下，

3、誘餌蛋白質(zhì)粒編碼的EGFP N-末端（NEGFP, 1-158位氨基酸）及靶蛋白質(zhì)粒編碼的EGFP C-末端（CEGFP, 159-239位氨基酸）能夠被組成型表達，其轉(zhuǎn)錄被ADH1終止子序列終止。構(gòu)建的EGFP報告質(zhì)粒pNEGFP和pCEGFP分別為色氨酸和亮氨酸選擇性，并且它們都是攜帶有低拷貝數(shù)起始位點（CEN6/ARS4起始位點）的著絲粒質(zhì)粒。這些低拷貝數(shù)的質(zhì)粒降低了蛋白表達水平，從而解決了酵母細胞中的蛋白毒性問題。為了克隆操作的方便，在質(zhì)粒的多克隆位點（MCS）還引入了BamH I、Sal I及Pst I等其它克隆位點。另外，為了評價周圍的結(jié)構(gòu)域會否會產(chǎn)生空間位阻效應，研究人員還分析了

4、由多種不同方法構(gòu)建的EGFP報告系統(tǒng)，進行構(gòu)象優(yōu)化。下文將以酵母GAL4DD與GAL11P的相互作用為例，說明該系統(tǒng)的功能。1.2 以分離的EGFP為報告系統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)為了驗證當酵母中的蛋白間發(fā)生相互作用時，被分離的EGFP會互補結(jié)合，研究人員以GAL4DD作為誘餌蛋白，GAL11P作為靶蛋白進行了實驗。在蛋白與蛋白相互作用的研究中，經(jīng)常使用這兩種蛋白作為對照。實驗中，研究人員將含有GAL11P的pCEGFP質(zhì)粒（pCEGFP:GAL11P）與包含GAL4DD的pNEGFP:GAL4DD質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)入酵母細胞，這樣酵母就會含有pCEGFP:GAL11P和pNEGFP:GAL4DD兩個質(zhì)粒，

5、這兩個質(zhì)粒均可用于研究熒光重建。另外，由于EGFP片段（NEGFP和CEGFP）的空間位阻效應可能會影響到熒光發(fā)色基團的形成，為了確定合適的融合蛋白空間結(jié)構(gòu)，研究人員構(gòu)建了不同組合的EGFP報告質(zhì)粒，它們能夠表達不同的EGFP片段組合（圖9）。將NEGFP和CEGFP融合載體轉(zhuǎn)入YM4217酵母中（該酵母是ura3-52、his3-200、leu2-3和trp1-901突變株），同時添加Ura、His、Leu和Trp。為了確定酵母細胞是否含有相應的質(zhì)粒，采用表1中NEGFP和CEGFP融合蛋白特異引物進行PCR擴增。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離后，分別得到594bp（1N-5N）、47

6、4bp（6N）、513bp（1C-4C, 6C）、243bp（5C）的擴增產(chǎn)物。如圖10a所示，相應的594bp（1N-5N）、474bp（6N）、513bp（1C-4C, 6C）、243bp（5C）PCR產(chǎn)物只存在于轉(zhuǎn)入后的酵母中，不存在于用作對照的YM4217酵母中，這說明在酵母雙雜交系統(tǒng)中可以使用不同的選擇標記。為了確定酵母雙雜交系統(tǒng)能否產(chǎn)生熒光，研究人員在共聚焦顯微鏡下觀察表達NEGFP和CEGFP融合蛋白的YM4271酵母。計數(shù)發(fā)出熒光的酵母細胞后，他們發(fā)現(xiàn)在不同的NEGFP和CEGFP構(gòu)建方式下，熒光重建效率不同，說明空間效應會影響熒光蛋白的互補結(jié)合。如圖10b所示，以全長EGFP

7、作為陽性對照，熒光重建率（R/E）為67%；而陰性對照，即未轉(zhuǎn)染的酵母細胞根本不發(fā)出熒光。表2總結(jié)了相關(guān)的熒光重建率百分比。設定酵母細胞轉(zhuǎn)染效率為100%，另外還評估了分離的EGFP相對于陽性對照的重建率百分比，數(shù)據(jù)為三個獨立樣品的平均值。如圖10b和表2所示，以pNEGFP和pCEGFP兩個空載體轉(zhuǎn)染作為空白對照，EGFP重建率為14.9%。NEGFP:GAL4DD與CEGFP:GAL11P發(fā)生相互作用（圖9組合1），與EGFP陽性對照相比，EGFP重建率達到40.1%。與此形成鮮明對比的是，NEGFP:GAL4DD與GAL11P:CEGFP融合蛋白的重建率只有19.4%（圖9組合2）。正如

8、預料一樣，NEGFP:GAL4DD與pCEGFP空載體（圖9組合5）不會發(fā)生相互作用，作為非特異性對照，其與空白對照（空載體，NEGFP+CEGFP）重建效率相當。pNEGFP空載體與pCEGFP:GAL11P質(zhì)粒（圖9組合6）共轉(zhuǎn)染的重建效率也相當?shù)?，只?7.9%，并且不會發(fā)出熒光。此外，GAL4DD: NEGFP融合蛋白無論與CEGFP:GAL11P還是GAL11P: CEGFP（圖9組合3、4）的重建效率都很低，分別為19.4%和13.4%，都不會發(fā)出熒光。這些發(fā)現(xiàn)表明，分子結(jié)構(gòu)造成的空間位阻效應使得熒光沉積失敗。研究證明，如果NEGFP和CEGFP分別在誘餌蛋白和靶蛋白的N-末端就不會產(chǎn)生嚴重的空間位阻，從而形成熒光團發(fā)出熒光?？傊?，在以EGFP為報告基因的酵母雙雜交系統(tǒng)中，當誘餌蛋白與靶蛋白相互作用