博士論文答辯

1、LOGO1美味獼猴桃根保肝活性及成分的研究美味獼猴桃根保肝活性及成分的研究 白新鵬白新鵬 二二OO八年六月八年六月2獼猴桃屬植物研究概況獼猴桃屬植物研究概況簡介：獼猴桃是一種野生的簡介：獼猴桃是一種野生的大藤大藤本植物本植物。在植物分類學(xué)上。在植物分類學(xué)上屬獼猴屬獼猴桃科獼猴桃屬植物桃科獼猴桃屬植物。又名陽桃、。又名陽桃、羊桃、毛桃、藤梨、中國醋栗、羊桃、毛桃、藤梨、中國醋栗、奇異果奇異果(Kiwifruit)。獼猴桃屬在。獼猴桃屬在全世界約全世界約60余種，余種，我國是本屬植我國是本屬植物原生和分布中心物原生和分布中心，共有，共有57-58種，主要分布于長江流域各省的種，主要分布于長江流域各

2、省的山區(qū)陰濕地帶。山區(qū)陰濕地帶。 獼猴桃主要分為獼猴桃主要分為六類六類:中華中華獼獼猴桃、猴桃、美味美味獼猴桃、獼猴桃、毛花毛花獼猴桃獼猴桃、軟棗軟棗獼猴桃、獼猴桃、闊葉闊葉獼猴桃和獼猴桃和葛葛棗棗獼猴桃。獼猴桃。 美味獼猴桃是由中華美味獼猴桃是由中華獼猴桃獼猴桃改良得到改良得到的品種，的品種，已成為我國西南、西北各已成為我國西南、西北各省區(qū)獼猴桃種植基地的主栽品種。省區(qū)獼猴桃種植基地的主栽品種。緒論緒論緒論緒論3獼猴桃屬植物研究概況獼猴桃屬植物研究概況果果籽籽葉子葉子緒論緒論枝條枝條根根4三萜類化合物三萜類化合物植物甾醇化合物植物甾醇化合物黃酮類化合物黃酮類化合物糖類化合物糖類化合物揮發(fā)性化

3、合物揮發(fā)性化合物獼猴桃屬主要化學(xué)成分獼猴桃屬主要化學(xué)成分緒論緒論其它微量成分其它微量成分5抗腫瘤和防癌作用抗腫瘤和防癌作用提高免疫功能的作用提高免疫功能的作用抗脂質(zhì)過氧化作用抗脂質(zhì)過氧化作用降血脂作用降血脂作用獼猴桃屬的生理功能獼猴桃屬的生理功能緒論緒論抗突變和畸變作用抗突變和畸變作用6獼猴桃根的化學(xué)成分研究概況獼猴桃根的化學(xué)成分研究概況n 1、黃初升黃初升 等等 對對毛花毛花獼猴桃根進(jìn)行了提取、分離得到獼猴桃根進(jìn)行了提取、分離得到8種物質(zhì)：種物質(zhì)：齊墩果酸齊墩果酸、烏烏蘇酸蘇酸、2, 3-二羥基二羥基-23-氧代氧代-12-烯烯-28-烏蘇酸烏蘇酸，2，3，23-三羥基三羥基-12-烯烯-2

4、8-烏蘇酸，烏蘇酸，2，3-二羥基二羥基-12-烯烯-28-烏蘇酸，烏蘇酸，2，3，24-三羥基三羥基-12-烯烯-28-烏蘇烏蘇酸，二十四碳酸，葡萄糖等酸，二十四碳酸，葡萄糖等n 2、覃益民覃益民 等等 從從中越中越獼猴桃根中分離得到獼猴桃根中分離得到5個(gè)化合物：個(gè)化合物：2，3，24-三羥基三羥基-12-烯烯-28-烏蘇酸烏蘇酸()，2，3，23-三羥基三羥基-12-烯烯-28-烏蘇酸烏蘇酸()，24-hydroxytormentric acid () 熊果酸熊果酸()，和，和-谷甾醇谷甾醇()等等n 3、李典鵬李典鵬 等等 從從中越中越獼猴桃的根部分離得到獼猴桃的根部分離得到6個(gè)化合物個(gè)

5、化合物: 2,3,24-三羥基三羥基-12-烯烯-28-齊墩果酸齊墩果酸(), 2,3-二羥基二羥基-12-烯烯-28-烏蘇酸烏蘇酸(), 2,3,19-三羥基三羥基-12-烯烯-28-烏蘇酸烏蘇酸(), 熊果酸熊果酸(), -谷甾醇谷甾醇(),和和-胡蘿卜甙胡蘿卜甙()。n 4、金永日金永日 等，從等，從軟棗軟棗獼猴桃根中分得獼猴桃根中分得4個(gè)化合物：個(gè)化合物： -谷甾醇谷甾醇, 毛花獼猴桃酸毛花獼猴桃酸, 2,3,24-三羥基三羥基-12-烯烯-28-烏蘇酸和胡蘿卜苷。烏蘇酸和胡蘿卜苷。n 5、李平亞、李平亞 等等 從從狗棗狗棗獼猴桃根中，分離得到兩個(gè)白色單體。經(jīng)光譜分析和化獼猴桃根中，分

6、離得到兩個(gè)白色單體。經(jīng)光譜分析和化學(xué)方法鑒定為學(xué)方法鑒定為7-豆甾烯醇豆甾烯醇和具有生物活性的化合物，其結(jié)構(gòu)為和具有生物活性的化合物，其結(jié)構(gòu)為2，3-二二-O一一-D一半乳糖基一一半乳糖基一D一半乳糖，命名為一半乳糖，命名為狗棗三糖狗棗三糖緒論緒論7根的粗提物根的粗提物具有抑制腫瘤細(xì)胞作用具有抑制腫瘤細(xì)胞作用根的多糖化合物根的多糖化合物具有具有獼猴桃根的藥理活性獼猴桃根的藥理活性緒論緒論根的粗提物根的粗提物具有免疫功能調(diào)節(jié)作用具有免疫功能調(diào)節(jié)作用8國內(nèi)外研究概況小結(jié)國內(nèi)外研究概況小結(jié)緒論緒論 國內(nèi)外對獼猴桃己有許多研究，主要是關(guān)于國內(nèi)外對獼猴桃己有許多研究，主要是關(guān)于栽培栽培、采收、貯藏、采收

7、、貯藏等方面的研究。近年來，對獼猴桃等方面的研究。近年來，對獼猴桃的化學(xué)成分、藥用價(jià)值和加工利用也作了一定的的化學(xué)成分、藥用價(jià)值和加工利用也作了一定的研究，分離出一些三萜化合物等。研究，分離出一些三萜化合物等。但對美味獼猴桃特別是對其根的但對美味獼猴桃特別是對其根的保肝作用保肝作用及及活性活性物質(zhì)物質(zhì)的研究未見有文獻(xiàn)報(bào)道的研究未見有文獻(xiàn)報(bào)道從現(xiàn)有文獻(xiàn)資料可以得到以下信息：從現(xiàn)有文獻(xiàn)資料可以得到以下信息：9課題的研究背景和意義課題的研究背景和意義 緒論緒論10主要研究內(nèi)容主要研究內(nèi)容緒論緒論11保肝的活性部位確定試驗(yàn)方法保肝的活性部位確定試驗(yàn)方法 熒光試劑合成熒光試劑合成活性部位確定活性部位確定

8、n體內(nèi)模型：選用四氯化碳體內(nèi)模型：選用四氯化碳 (CCl4) 肝損傷模型作為體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)Ｐ透螕p傷模型作為體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚽體外方法：選用硫氰酸鐵體外方法：選用硫氰酸鐵 (FTC) 法進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)法進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)n檢測指標(biāo)：各提取物的抗氧化活性強(qiáng)弱檢測指標(biāo)：各提取物的抗氧化活性強(qiáng)弱 試驗(yàn)小鼠血清試驗(yàn)小鼠血清ALT、AST 肝組織脂質(zhì)過氧化水平（肝組織脂質(zhì)過氧化水平（MDA）及谷胱甘肽）及谷胱甘肽(GSH)水平水平n數(shù)據(jù)處理：釆用數(shù)據(jù)處理：釆用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)軟件，多組間方差分析多組間方差分析統(tǒng)計(jì)處理。統(tǒng)計(jì)處理。n篩選出其根中具有最強(qiáng)保肝活性的部位。篩選出其根中具有最強(qiáng)保肝活性的

9、部位。12獼猴桃根提取工藝獼猴桃根提取工藝 熒光試劑合成熒光試劑合成活性部位確定活性部位確定石油醚萃取物石油醚萃取物石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取美味獼猴桃根美味獼猴桃根600ml/L乙醇、乙醇、50微波浸提微波浸提30min浸泡液浸泡液懸浮液懸浮液浸膏浸膏50以下真空濃縮以下真空濃縮(回收溶劑回收溶劑) 三倍量的水充分?jǐn)嚢枞读康乃浞謹(jǐn)嚢枰宜嵋阴ポ腿∥镆宜嵋阴ポ腿∥?Fr.A)正丁醇萃取物正丁醇萃取物(Fr.B)剩余物剩余物浸膏浸膏浸膏浸膏浸膏浸膏浸膏浸膏 活性檢測活性檢測 活性檢測活性檢測活性檢測活性檢測活性檢測活性檢測真空濃縮真空濃縮真空濃縮真空濃縮真空濃縮真

10、空濃縮真空濃縮真空濃縮13各溶劑提取物抗氧化活性各溶劑提取物抗氧化活性 熒光試劑合成熒光試劑合成活性部位確定活性部位確定14各溶劑提取物保肝活性各溶劑提取物保肝活性熒光試劑合成熒光試劑合成活性部位確定活性部位確定GroupsDose (mg/kg)Serum ALT (U/L)Serum AST (U/L)Control84.62 4.6593.75 3.76CC14/olive oil2281.52 26.04a762.13 46.35aDGL + CC146088.69 11.35b98.96 10.66bPE + CC1460243.26 13.34 a746.32 15.69 aCE

11、+ CC1460228.34 16.38a b c686.49 41.25a b cEE6 + CC1460123.68 12.65a b328.63 35.35a bME6 + CC1460136.42 14.63a b381.63 26.45a bWE + CC1460196.23 18.10a b c596.61 23.78a b 15不同劑量的不同劑量的EE6對對CCl4肝損傷的影響肝損傷的影響 熒光試劑合成熒光試劑合成活性部位確定活性部位確定GroupsDose(mg/kg)Serum ALT(U/L)Serum AST(U/L)Lipid peroxidation(MDA: nmo

12、l/g liver)Glutathione(mg/g liver)Control81.62 6.5195.35 4.0382.62 9.131.91 0.22CC14 / olive 2 278.56 25.64a752.41 64.92a185.64 15.53a1.20 0.12aDGL + CC146096.63 16.33b105.42 30.36b93.62 10.55b1.89 0.19bEE6 + CC1430241.62 24.10a b606.62 41.71a b166.53 16.85a b1.39 0.14a bEE6 + CC1460126.32 12.15a b31

13、6.62 43.71a b122.32 14.53a b1.78 0.16b cEE6 + CC1412095.63 16.52b c116.41 10.32b c88.62 11.56b c1.87 0.17b 16小鼠肝細(xì)胞的組織病理學(xué)檢查小鼠肝細(xì)胞的組織病理學(xué)檢查熒光試劑合成熒光試劑合成活性部位確定活性部位確定 對照組對照組(Control group) 攻毒組攻毒組(CCl4/olive oil) 提取物組提取物組(CCl4 + EE6)肝切片電鏡圖肝切片電鏡圖17EE6各級(jí)萃取部分的抗氧化活性各級(jí)萃取部分的抗氧化活性 熒光試劑合成熒光試劑合成活性部位確定活性部位確定18EE6各級(jí)分各

14、級(jí)分CCl4肝損傷活性肝損傷活性 熒光試劑合成熒光試劑合成活性部位確定活性部位確定TreatmentDose (mg/kg)p.o.Serum parametersALT(U/L)AST(U/L)Vehicle control80.9615.6895.358.49Vehicle+ CCl42586.2361.23a669.1633.63aDGL + CCl460.0310.12 19.82ab376.0929.90abEEAD+CCl460.0389.4325.81abcd478.99 41.24acdEEAD-Pe +CCl460.0412.6833.64abcd620.29 64.83ac

15、dEEAD-Ea+CCl460.0233.34 19.79abc305.2523.76abcEEAD-Bu+CCl460.0267.6724.84abcd315.7036.82abEEAD-Aq+CCl460.0303.3217.41abd360.29 19 小小 結(jié)結(jié) (一一)篩選篩選了了提取溶劑提取溶劑：乙醇乙醇熒光試劑合成熒光試劑合成活性部位確定活性部位確定證明了證明了保肝活性與劑量有一定的關(guān)系保肝活性與劑量有一定的關(guān)系說明了說明了活性成分主要在乙醇提取物的乙活性成分主要在乙醇提取物的乙酸乙酯和正丁醇萃取物中酸乙酯和正丁醇萃取物中提示：提示：各提取物的保肝活性與其抗氧化各提取物的保肝活性

16、與其抗氧化活性有一定相關(guān)性活性有一定相關(guān)性20三萜化合物定性反應(yīng)三萜化合物定性反應(yīng) 三萜化合物的各種三萜化合物的各種特征反應(yīng)特征反應(yīng)熒光試劑合成熒光試劑合成檢測方法建立檢測方法建立反應(yīng)名稱反應(yīng)名稱現(xiàn)現(xiàn) 象象乙酸乙酯萃取物乙酸乙酯萃取物 正丁醇萃取物正丁醇萃取物醋酐醋酐- -濃硫酸反應(yīng)濃硫酸反應(yīng)(Liebermann-(Liebermann-BurchardBurchard反應(yīng)反應(yīng)) )黃黃紅紅紫紫藍(lán)藍(lán), ,最最后褪色后褪色黃黃紅紅紫紫藍(lán)藍(lán), ,最最后褪色后褪色五氯化銻反應(yīng)五氯化銻反應(yīng)( (KahlenbergKahlenberg反應(yīng)反應(yīng)) )藍(lán)色藍(lán)色藍(lán)色藍(lán)色三氯醋酸反應(yīng)三氯醋酸反應(yīng)(Rosen

17、-(Rosen-HeimerHeimer反應(yīng)反應(yīng)) )紅紅紫紫紅紅紫紫氯仿氯仿- -濃硫酸反應(yīng)濃硫酸反應(yīng)( (SalkowskiSalkowski反應(yīng)反應(yīng)) )氯仿層呈紅色氯仿層呈紅色, ,有綠有綠色瑩光色瑩光氯仿層呈藍(lán)色氯仿層呈藍(lán)色, ,有綠有綠色瑩光色瑩光冰醋酸冰醋酸- -乙酰氯反應(yīng)乙酰氯反應(yīng)( (TschugacffTschugacff反應(yīng)反應(yīng)) )淡紅色淡紅色紫紅色紫紅色21TLC分離條件的選擇分離條件的選擇 n最佳展開劑：氯仿最佳展開劑：氯仿+甲醇甲醇+水水(70+30+1)n最佳顯色劑：最佳顯色劑：熒光試劑合成熒光試劑合成檢測方法建立檢測方法建立22TLC最佳條件的展開效果最佳條件

18、的展開效果 熒光試劑合成熒光試劑合成檢測方法建立檢測方法建立23分光光度法測定總?cè)品止夤舛确y定總?cè)?熒光試劑合成熒光試劑合成檢測方法建立檢測方法建立24分光光度法測定總?cè)品止夤舛确y定總?cè)茻晒庠噭┖铣蔁晒庠噭┖铣蓹z測方法建立檢測方法建立25分光光度法測定總?cè)品止夤舛确y定總?cè)茻晒庠噭┖铣蔁晒庠噭┖铣蓹z測方法建立檢測方法建立26分光光度法測定總?cè)品止夤舛确y定總?cè)茻晒庠噭┖铣蔁晒庠噭┖铣蓹z測方法建立檢測方法建立27HPLC測定測定oleanolic acid n色譜柱：色譜柱：250mm4.6mm i.d， 5m Luna C18n流動(dòng)相流動(dòng)相: 乙腈乙腈+甲酸甲酸+水水(60

19、+0.08+39.92) n進(jìn)樣量：進(jìn)樣量：10L; 流速：流速：1.0mL/minn柱溫：柱溫：25n紫外檢測器紫外檢測器n檢測波長：檢測波長：206 nm 熒光試劑合成熒光試劑合成檢測方法建立檢測方法建立28HPLC測定測定oleanolic acid熒光試劑合成熒光試劑合成檢測方法建立檢測方法建立29HPLC測定測定oleanolic acid檢測方法建立檢測方法建立30實(shí)際樣品總?cè)坪蛯?shí)際樣品總?cè)坪蚾leanolic acid含量測定含量測定 熒光試劑合成熒光試劑合成檢測方法建立檢測方法建立提取物提取物總?cè)频暮靠側(cè)频暮?mg/g ) oleanolic acid(mg/g )

20、石油醚提取物石油醚提取物 (PE)120.22.4三氯甲烷提取物三氯甲烷提取物 (CE) 187.23.660%乙醇提取物乙醇提取物 (EE6)251.84.460%甲醇提取物甲醇提取物(ME6)126.83.8水提取物水提取物 (WE)31實(shí)際樣品總?cè)坪蛯?shí)際樣品總?cè)坪蚾leanolic acid含量測定含量測定 熒光試劑合成熒光試劑合成檢測方法建立檢測方法建立提取物提取物總?cè)频暮靠側(cè)频暮?mg/g )oleanolic acid(mg/g )乙醇粗提取物乙醇粗提取物 (EEAD)256.44.8石油醚萃取物石油醚萃取物 (EEAD-Pe) 43.61.1乙酸乙酯萃取物乙酸乙酯萃取

21、物 (EEAD-Ea)516.28.6正丁醇萃取物正丁醇萃取物(EEAD-Bu)276.34.1水萃取物水萃取物(EEAD-Aq)32 小小 結(jié)結(jié)(二二)驗(yàn)證了驗(yàn)證了活性部分含有三萜化合物?；钚圆糠趾腥苹衔铩４_定了確定了TLC分離條件。分離條件。建立了建立了TLC-HPLC法測定法測定oleanolic acid含量的含量的方法。方法。熒光試劑合成熒光試劑合成檢測方法建立檢測方法建立33微波輔助提取設(shè)備微波輔助提取設(shè)備 熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝34微波輔助提取方法微波輔助提取方法 稱取稱取10.0 g獼猴桃根粉獼猴桃根粉樣品樣品，置于特制的，置于特制的500 ml

22、兩口燒瓶中，根據(jù)兩口燒瓶中，根據(jù)試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求的工藝條件設(shè)計(jì)要求的工藝條件，加入所需的提取溶劑乙醇，并確保溶劑完全淹沒樣品，加入所需的提取溶劑乙醇，并確保溶劑完全淹沒樣品，把裝有樣品的燒瓶放入上述的微波萃取系統(tǒng)中，裝上攪拌器及回流裝置，設(shè)把裝有樣品的燒瓶放入上述的微波萃取系統(tǒng)中，裝上攪拌器及回流裝置，設(shè)定加熱功率、溫度、時(shí)間，定加熱功率、溫度、時(shí)間，進(jìn)行微波萃取進(jìn)行微波萃取。處理結(jié)束后，取出燒瓶，將萃取。處理結(jié)束后，取出燒瓶，將萃取液液過濾過濾，濾液經(jīng)真空，濾液經(jīng)真空濃縮濃縮（T 50 oC）至一定體積后取出一定量的濃縮液，）至一定體積后取出一定量的濃縮液，定容到一定的體積，進(jìn)行定容到一定的

23、體積，進(jìn)行三萜含量分析三萜含量分析，同時(shí)取出一量的濃縮液，在旋轉(zhuǎn)蒸，同時(shí)取出一量的濃縮液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸至一定程度，放入干燥器內(nèi)，至到恒重，測定重量，發(fā)儀上蒸至一定程度，放入干燥器內(nèi)，至到恒重，測定重量，推算出浸膏的推算出浸膏的收率及純度收率及純度。提取率定義：提取率定義：熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝35提取過程優(yōu)化方法提取過程優(yōu)化方法 熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝n單因素試驗(yàn)單因素試驗(yàn)：找出各因素對浸取效能的影響，確定各因：找出各因素對浸取效能的影響，確定各因素的取值范圍。素的取值范圍。n析因試驗(yàn)析因試驗(yàn)(FFD): 確定影響提取效果的主要因素。快速

24、確定影響提取效果的主要因素?？焖偕仙囼?yàn)確定顯著影響因素的最佳中心點(diǎn)，上升試驗(yàn)確定顯著影響因素的最佳中心點(diǎn)，n中心組合試驗(yàn)中心組合試驗(yàn)(CCD)：對主要因素進(jìn)行優(yōu)化組合，擬：對主要因素進(jìn)行優(yōu)化組合，擬合穩(wěn)定點(diǎn)附近的響應(yīng)模型，并優(yōu)化得出最佳工藝條件和最大提合穩(wěn)定點(diǎn)附近的響應(yīng)模型，并優(yōu)化得出最佳工藝條件和最大提取率。取率。n驗(yàn)證試驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn)：證明該方法的可靠性：證明該方法的可靠性。整個(gè)試驗(yàn)分整個(gè)試驗(yàn)分3個(gè)階段進(jìn)行個(gè)階段進(jìn)行36單因素影響實(shí)驗(yàn)單因素影響實(shí)驗(yàn) n 微波微波功率功率對提取率的影響對提取率的影響n 微波輻射微波輻射時(shí)間時(shí)間對提取率的影響對提取率的影響n 微波萃取微波萃取溫度溫度對提取率的影

25、響對提取率的影響n 溶劑溶劑濃度濃度對提取率的影響對提取率的影響n 料液比料液比對提取率的影響對提取率的影響n 預(yù)預(yù)浸泡時(shí)間浸泡時(shí)間對提取率的影響對提取率的影響熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝37單因素影響實(shí)驗(yàn)單因素影響實(shí)驗(yàn)(1) (2)熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝38單因素影響實(shí)驗(yàn)單因素影響實(shí)驗(yàn)(3) (4)熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝39單因素影響實(shí)驗(yàn)單因素影響實(shí)驗(yàn)(5) (6)熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝40輻射溫度輻射溫度微波功率微波功率料液比料液比乙醇體積分?jǐn)?shù)乙醇體積分?jǐn)?shù)輻射時(shí)間輻射時(shí)間預(yù)浸泡時(shí)間預(yù)浸泡時(shí)間熒

26、光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)最佳條件單因素實(shí)驗(yàn)最佳條件41析因試驗(yàn)析因試驗(yàn)析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子及編碼值析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子及編碼值熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝水平水平(X)乙醇濃度乙醇濃度1 / %液料比液料比2 / (v/ w)提取時(shí)間提取時(shí)間3 /min提取溫度提取溫度4 / -130101040050153050+42析因試驗(yàn)析因試驗(yàn) 熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝NoX1X2X3X4三萜提取率三萜提取率 Y1/ %1-1-1-1-138.8221-1-1-170.013-11-1-140.98411-1-182.945-1-11

27、-135.3561-11-185.337-111-145.518111-185.739-1-1-1140.97101-1-1170.9911-11-1142.481211-1166.8913-1-11137.73141-11165.1615-43析因試驗(yàn)析因試驗(yàn)熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝TermEstimateStd ErrtPr|t|X133.323752.46124113.539410.0001X24.556252.4612411.85120.123358X32.126252.4612410.8638930.427136X4-5.521252.461241-2.243

28、280.074906結(jié)果的回歸分析結(jié)果的回歸分析44最速上升試驗(yàn)最速上升試驗(yàn)熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝試驗(yàn)編號(hào)試驗(yàn)編號(hào)12345乙醇濃度乙醇濃度1 /%5060708090提取溫度提取溫度4 /5045403530三萜提取率三萜提取率Y1 /%78.1283.9676.3553.1045.20試驗(yàn)方案及結(jié)果試驗(yàn)方案及結(jié)果45Box-Behnken中心組合試驗(yàn)中心組合試驗(yàn)試驗(yàn)因素與水平的編碼表試驗(yàn)因素與水平的編碼表(=1.414)熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝因素因素水水 平平-10+1+1 乙醇濃度乙醇濃度 / %45.8650607074.144 提取

29、溫度提取溫度 / 46Box-Behnken中心組合試驗(yàn)中心組合試驗(yàn)試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝No.X1X4三萜提取率三萜提取率/ %1-1-169.862-1168.2831-173.2141175.165-1.414063.1261.414078.0270-47Box-Behnken中心組合試驗(yàn)中心組合試驗(yàn)熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝48Box-Behnken中心組合試驗(yàn)中心組合試驗(yàn)熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝結(jié)果的直觀圖結(jié)果的直觀圖49提取溫度提取溫度乙醇體積分?jǐn)?shù)乙醇體積分?jǐn)?shù)料液比料液比1:

30、15提取時(shí)間提取時(shí)間30 min熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝50最佳實(shí)驗(yàn)條件驗(yàn)證最佳實(shí)驗(yàn)條件驗(yàn)證 最佳條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果最佳條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝實(shí)驗(yàn)條件實(shí)驗(yàn)條件實(shí)驗(yàn)次數(shù)實(shí)驗(yàn)次數(shù)平均提取率平均提取率(%)123最佳條件最佳條件85.2384.9585.3685.136號(hào)條件號(hào)條件84.1583.8984.3284.128號(hào)條件號(hào)條件51 小小 結(jié)結(jié) (三三)微波輔助提取微波輔助提取獼猴桃根中三萜類生物活性物質(zhì)獼猴桃根中三萜類生物活性物質(zhì)是一是一行之有效的方法行之有效的方法RSM 法法可以用于微波提取獼猴桃根三萜化合可以用于微波提取獼猴

31、桃根三萜化合物的工藝條件物的工藝條件優(yōu)化處理過程優(yōu)化處理過程熒光試劑合成熒光試劑合成微波提取工藝微波提取工藝52樹脂純化三萜所用材料樹脂純化三萜所用材料 熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝樹脂樹脂極性極性外觀外觀比表面比表面(m2/g) 平均孔徑平均孔徑S-8極性極性乳白色不透明球狀顆粒乳白色不透明球狀顆粒100-120280-300NAK-9極性極性紅棕色不透明球狀顆粒紅棕色不透明球狀顆粒160-200145-155AB-8弱極性弱極性乳白色不透明球狀顆粒乳白色不透明球狀顆粒480-520130-140HPD700中極性中極性乳白色不透明球狀顆粒乳白色不透明球狀顆粒650-70

32、085-90D-101非極性非極性乳白色不透明球狀顆粒乳白色不透明球狀顆粒500-55080-53樹脂純化實(shí)驗(yàn)內(nèi)容樹脂純化實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 n 總?cè)莆饺萘康臏y定總?cè)莆饺萘康臏y定n 總?cè)平馕实臏y定總?cè)平馕实臏y定n 靜態(tài)吸附等溫線實(shí)驗(yàn)靜態(tài)吸附等溫線實(shí)驗(yàn)n 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性的測定靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性的測定熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝n 總?cè)苿?dòng)態(tài)吸附量的測定總?cè)苿?dòng)態(tài)吸附量的測定n 總?cè)葡疵摋l件的測定總?cè)葡疵摋l件的測定n 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)54靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 分別準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的干樹脂分別準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的干樹脂2 g裝入裝入150 ml的錐形瓶中，的錐形瓶

33、中，再加再加50 ml 濃度為濃度為4.976 mg/ml總?cè)埔掖既芤?，靜態(tài)吸附至總?cè)埔掖既芤海o態(tài)吸附至24 h后，充分吸附后，過濾，測定溶液中總?cè)苹衔锏臐舛群?，充分吸附后，過濾，測定溶液中總?cè)苹衔锏臐舛戎亓课搅亢臀铰识x：重量吸附量和吸附率定義：熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝%100)(0WVCeCQ %100%00CCeCE 55靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝56靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝57靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝58

34、靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝1eeemLmCCQQK Q Ln Q e= ln Kf +n ln C59靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝 60靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)樹脂種類樹脂種類回歸方程回歸方程Qm KLR2NAK-9Ce/Qe=0.0143Ce+0.045769.930.31290.9808HPD700Ce/Qe=0.0076Ce+0.0388131.580.19590.9607D101Ce/Qe=0.0068Ce+0.0332147.060.20480.9244熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純

35、化工藝 樹脂種類樹脂種類回歸方程回歸方程Kf nR2NAK-9lnQe=0.7869lnCe+2.75415.710.78690.9878HPD700lnQe=0.8527lnCe+3.02720.640.85270.9940D101lnQe=0.8567lnCe+61靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝 62動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝 63動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝 64動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝 65上樣濃度上樣

36、濃度上樣量：上樣量：14 倍樹脂體積倍樹脂體積流速：流速：5 ml/min熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝樹脂類型樹脂類型66最佳條件純化產(chǎn)品結(jié)果最佳條件純化產(chǎn)品結(jié)果 熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)上樣提取物上樣提取物(g)純化產(chǎn)品重量純化產(chǎn)品重量(g)純化后總?cè)坪考兓罂側(cè)坪?mg/g)產(chǎn)品收率產(chǎn)品收率(%)三萜回收率三萜回收率(%)15.632.81514.249.9188.0125.652.83521.350.0989.5435.672.82518.349.7488.40平均平均67最佳條件純化產(chǎn)品結(jié)果最佳條件純化產(chǎn)品結(jié)果 熒光試劑合成

37、熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝 68 小小 結(jié)結(jié) (四四)lnQe=0.8567lnCe+3.171熒光試劑合成熒光試劑合成樹脂純化工藝樹脂純化工藝69單體活性物質(zhì)的純化工藝單體活性物質(zhì)的純化工藝 熒光試劑合成熒光試劑合成活性單體純化活性單體純化樹脂純化總?cè)茦渲兓側(cè)?硅膠柱層析硅膠柱層析 氯仿氯仿-甲醇甲醇 梯度洗脫梯度洗脫 TLC合并相同點(diǎn)合并相同點(diǎn) Fr (2) Fr (3)Fr (4)Fr (5)Fr (1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)Sephadex LH-20 ABCD各部分反復(fù)各部分反復(fù)ODS柱層析柱層析 IIII

38、IIIV70柱層析分離條件柱層析分離條件熒光試劑合成熒光試劑合成活性單體純化活性單體純化n 上樣量：上樣量：4克克n 洗脫劑：氯仿洗脫劑：氯仿-甲醇甲醇(100+00+100)梯度洗脫梯度洗脫n 洗脫速度：洗脫速度：1-2 ml/minn 柱子類型：柱子類型：20 mm200 mmn 洗脫劑：水洗脫劑：水+甲醇甲醇(100+00+100)梯度洗脫梯度洗脫n 洗脫速度：洗脫速度：1-2 ml/71硅膠柱層析分離結(jié)果硅膠柱層析分離結(jié)果熒光試劑合成熒光試劑合成活性單體純化活性單體純化組號(hào)組號(hào)洗脫液比例洗脫液比例氯仿氯仿+甲醇甲醇收集瓶序號(hào)收集瓶序號(hào)收集液顏色收集液顏色收率收率%三萜含量三萜含量(mg

39、/g)Fr (0)純氯仿純氯仿1-10蒸干后棕紅色油狀蒸干后棕紅色油狀Fr (1)9+1- 8+211-54紅色紅色8.4115.24Fr (2)8+2- 7+355-88淡紅色淡紅色12.97340.23Fr (3)7+3- 6+489-129灰白色灰白色30.06780.36Fr (4)6+4- 5+5129-150淡綠淡綠15.43346.91Fr (5)5+5- 4+6150-189灰白色灰白色6.3434.25Fr (6)純甲醇純甲醇189-210灰白色灰白色72硅膠柱層析分離結(jié)果硅膠柱層析分離結(jié)果熒光試劑合成熒光試劑合成活性單體純化活性單體純化73硅膠柱層析分離結(jié)果硅膠柱層析分離結(jié)

40、果熒光試劑合成熒光試劑合成活性單體純化活性單體純化TreatmentDose(mg/kg)ALT(U/L)AST(U/L)Lipid peroxidation(nmol/g liver)Glutathione(mole/g liver)Vehicle control 120.86 11.20124.68 12.5959.32 2.156.13 0.22Vehicle+CCl41120.68 57.19a1042.69 39.56a119.12 3.59a2.27 0.12aDGL + CCl460.0578.2 41.50ab599.41 34.99ab88.07 3.64ab4.59 0.3

41、8abFr (1)+ CCl460.0860.45 8.42abcd784.8 56.53abcd99.51 6.32abcd3.06 0.15abcdFr (2)+ CCl460.0633.64 8.48abcd562.91 43.28abd88.98 2.03abd3.60 0.19abcdFr (3)+ CCl460.0421.33 37.35abc430.96 36.92abc76.61 4.49abc5.22 0.27abcFr (4)+ CCl460.0598.22 40.19abd590.42 47.36abd87.08 2.46abd4.47 0.24abdFr (5)+ CC

42、l460.0597.27 45.74abd699.21 8.83abcd82.39 3.48abcd4.38 74單體活性物質(zhì)的純化結(jié)果單體活性物質(zhì)的純化結(jié)果 熒光試劑合成熒光試劑合成活性單體純化活性單體純化75單體化合物的結(jié)構(gòu)表征單體化合物的結(jié)構(gòu)表征 n 熔點(diǎn)熔點(diǎn) n 紫外光譜紫外光譜n 紅外吸收光譜紅外吸收光譜n 高效液相譜高效液相譜 n 液液-質(zhì)色譜質(zhì)色譜 n 核磁共振譜核磁共振譜 (1H-NMR、 13C-NMR、DEPT譜譜 )熒光試劑合成熒光試劑合成結(jié)構(gòu)表征結(jié)構(gòu)表征76四個(gè)單體化合物的四個(gè)單體化合物的熔點(diǎn)熔點(diǎn)n化合物化合物I ：291-292 n化合物化合物II ：283-287

43、n化合物化合物III ：308-310 n化合物化合物IV ：312-315 結(jié)構(gòu)表征結(jié)構(gòu)表征77 四個(gè)單體化合物的四個(gè)單體化合物的紫外光譜紫外光譜熒光試劑合成熒光試劑合成結(jié)構(gòu)表征結(jié)構(gòu)表征n化合物化合物I ：n化合物化合物II ：n化合物化合物III ：n化合物化合物IV ：78四個(gè)單體化合物的四個(gè)單體化合物的熒光試劑合成熒光試劑合成結(jié)構(gòu)表征結(jié)構(gòu)表征669.40997.191029.831091.011252.681274.471386.431454.691572.781691.772851.472923.353420.17 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

44、 120 130 140%T 500 1000 1500 2000 2000 3000 W avenumbers (cm-1)79四個(gè)單體化合物的四個(gè)單體化合物的 熒光試劑合成熒光試劑合成結(jié)構(gòu)表征結(jié)構(gòu)表征80四個(gè)單體化合物的四個(gè)單體化合物的1H-NMR譜譜熒光試劑合成熒光試劑合成結(jié)構(gòu)表征結(jié)構(gòu)表征81四個(gè)單體化合物的四個(gè)單體化合物的熒光試劑合成熒光試劑合成結(jié)構(gòu)表征結(jié)構(gòu)表征82化合物的化合物的 熒光試劑合成熒光試劑合成結(jié)構(gòu)表征結(jié)構(gòu)表征8313C-NMR譜化學(xué)位移數(shù)據(jù)譜化學(xué)位移數(shù)據(jù) 熒光試劑合成熒光試劑合成結(jié)構(gòu)表征結(jié)構(gòu)表征84化合物的結(jié)構(gòu)表征化合物的結(jié)構(gòu)表征HCOOHHH13568101112151

45、718202223242526272930HO13456791011121315171819202122CH2OH2324OH2526272930COOH28OH熒光試劑合成熒光試劑合成結(jié)構(gòu)表征結(jié)構(gòu)表征HCOOHHH13568101112151718202223242526272930HO13456791011121315171819202122CH2OH2324OH2526272930COOH28OHOHOleanolic acidUrsolic acid2,3,23-三羥基三羥基-12-烯烯-28-烏蘇酸烏蘇酸85單體化合物與總?cè)票８位钚员容^單體化合物與總?cè)票８位钚员容^ 熒光試劑合成熒

46、光試劑合成保肝功能研究保肝功能研究總?cè)瓶側(cè)芓reatmentDose(mg/kg)ALT(U/L)AST(U/L)Lipid peroxidation(nmol/g liver) Glutathione(mole/g liver)Vehicle control84.92 21.20122.48 19.9857.03 3.145.56 0.24Vehicle+ CCl41071.42 47.87a774.83 49.51a108.29 5.59a2.55 0.16aFr (3)+ CCl425.0568.85 38.24ab473.45 46.76ab79.66 4.22ab3.59 0.2

47、5abFr (3)+ CCl450.0430.36 43.63ab405.67 33.29ab76.73 3.03ab4.24 0.23abFr (3)+ CCl4100.0269.47 28.65ab282.26 29.28ab70.88 3.56ab4.68 0.34abFr (3)+ CCl4200.0106.02 27.56bNS149.6528.93bNS62.69 5.49bNS5.46 0.29bNSOLA+ CCl4156.0546.26 51.50ab486.88 48.23ab81.25 6.04ab3.96 0.26abOLA+ CCl4300.0420.56 41.59

48、ab398.36 41.59ab73.73 2.83ab4.34 86 小小 結(jié)結(jié) (五五) Sephadex-LH-20柱柱 采用采用UV、MS、1H-NMR和和13C-NMR進(jìn)行進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析結(jié)構(gòu)分析，確定，確定分別為分別為Oleanolic acid， Ursolic acid， 2,3,23-三羥基三羥基-12-烯烯-28-烏蘇酸，烏蘇酸， 2,3,19,23-四羥基四羥基-12-烯烯-28-烏蘇酸烏蘇酸 齊墩果酸不是單一的保肝作用成分，獼猴桃根的齊墩果酸不是單一的保肝作用成分，獼猴桃根的保肝作用是三萜化合物群的保肝作用是三萜化合物群的協(xié)同作用協(xié)同作用熒光試劑合成熒光試劑合成小小 結(jié)結(jié)8

49、7主要結(jié)論主要結(jié)論 n成功成功建立了建立了保肝動(dòng)物保肝動(dòng)物模型模型，為保肝活性物質(zhì)的提取、分離、純化提供，為保肝活性物質(zhì)的提取、分離、純化提供檢測手段檢測手段。n對獼猴桃根進(jìn)行分級(jí)提取，對提取物進(jìn)行活性檢測，結(jié)果表明：醇提取物的對獼猴桃根進(jìn)行分級(jí)提取，對提取物進(jìn)行活性檢測，結(jié)果表明：醇提取物的抗氧化抗氧化和保肝活性和保肝活性較好；較好；微波提取法微波提取法不影響提取物的保肝活性；醇提物的不影響提取物的保肝活性；醇提物的乙酸乙酯乙酸乙酯萃取物萃取物具有較高的抗氧化和保肝活性具有較高的抗氧化和保肝活性 。n建立了建立了總?cè)坪康目側(cè)坪康腡LC-分光光度分光光度測定法和齊墩果酸含量的測定法和齊墩果酸含量的TLC-HPLC測定法。測定法。TLC法適宜的法適宜的展開劑展開劑：氯仿：氯仿+甲醇甲醇+水水(7+3+1)；分光光度法顯色反應(yīng)的適宜；分光光度法顯色反應(yīng)的適宜條件條件：50g/L香草醛醋酸溶液香草醛醋酸溶液0.3 ml，高氯酸，高氯酸1 ml，60 oC反應(yīng)反應(yīng)15 min。采用。采用TLC-HPLC法法適宜的適宜的條件條件為：采用為：采用LunaC18柱，流動(dòng)相：乙腈柱，流動(dòng)相：乙腈+甲酸甲酸+水水(6