非放射性標(biāo)記物BrdU研究進(jìn)展

1、非放射性標(biāo)記物brdu研究進(jìn)展澳脫氧尿囉唳核昔是dna前體胸腺囉喘核昔類似物，通 過競爭摻入s期細(xì)胞單鏈dna核昔酸序列替代胸腺囉唳。b rdu與胸腺囉噪競爭摻 入的強(qiáng)度可能與細(xì)胞增殖異常有關(guān)，如肝癌細(xì)胞約的胸腺 囉唳被替代，而正常肝細(xì)胞僅有1。既往在分子遺傳學(xué)等 研究中常采用同位素標(biāo)記，但有放射污染，技術(shù)難度大，實(shí) 驗(yàn)周期長等缺點(diǎn)。近年來非放射性標(biāo)記物的研究發(fā)展迅速, 然而其敏感性多數(shù)不及同位素，使實(shí)驗(yàn)應(yīng)用受限。自82年g ratzer制備出抗brdu單抗及標(biāo)記檢測技術(shù)不斷改良提高， 應(yīng)用brdu標(biāo)記的敏感性已與氛胸腺喘唳核昔相似2, 3。 目前認(rèn)為brdu是最有希望取代同位素的非放射性標(biāo)記

2、物之 -o本文綜述近年來brdu研究概況，重點(diǎn)介紹標(biāo)記過程中 有關(guān)技術(shù)問題。一、標(biāo)記技術(shù)：1、劑量和途徑：brdu可用于體內(nèi)或體外標(biāo)記，體內(nèi)標(biāo)記時(shí)，實(shí)驗(yàn)鼠按體 重60mg -200mg/kg于鼠腹膜下注射4, 5,狗按體重 100mg/kg靜脈注射6,人體以表面積150 n g/m2用量，取標(biāo) 本前靜脈注射7,免疫組化檢測。brdu經(jīng)靜脈給藥一般無 副作用，偶有報(bào)道過量可致細(xì)胞突變。體外標(biāo)記的研究廣泛 而深入，通常將保存在培養(yǎng)液中的新鮮組織剪11 卒至1-2mm3大 小，離心去除了上清液后，加入looug/mlbrdu,或新鮮組 織在/ml濃度的brdu中37攝氏度1小時(shí)，然后固定包埋8, 細(xì)

3、胞標(biāo)記在rpm 11640-10培養(yǎng)液中進(jìn)行，細(xì)胞數(shù)低于1x10 6/ml,加入20卩1的brdu孵育209。2、標(biāo)本處理：適當(dāng)?shù)臉?biāo)本處理對brdu染色強(qiáng)度至關(guān)重要omeyer對450 例乳腺癌組織體外標(biāo)記總結(jié)出3點(diǎn)經(jīng)驗(yàn):切組織塊vlmm厚； 固定前組織有代謝活力；封閉脫氧胸腺核昔合成酶2,因 此酶能使脫氧尿昔轉(zhuǎn)變成脫氧胸昔，從而阻止內(nèi)源性脫氧胸 昔與brdu競爭摻入dna。xiang最近回顧大量文獻(xiàn)。廣泛討 論固定包埋方法后，制備狗脛骨骨折模型，設(shè)3組對照研究， 結(jié)果證明70%乙醇固定，ep on包埋未脫鈣狗骨組織的erdu 染色效果最好6 o swales和smi th用brdu單抗在超微

4、水 平研究昆蟲血腦屏障，重點(diǎn)探討標(biāo)記過程對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特 征的影響。作者比較4種固定后得出如下結(jié)論：單用多聚甲 醛固定可獲得良好的標(biāo)記效果，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)易損傷，可加入 單節(jié)顯性戊二醛聯(lián)合固定；等滲緩沖液加蔗糖磷酸/鹽酸緩 血酸胺緩沖劑或pbs對保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)有較好效果；用脫氧膽 酸處理可增加標(biāo)記，促進(jìn)抗體聯(lián)接，該項(xiàng)研究清晰顯示線粒 體，高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)果器10。也有人建議如準(zhǔn)備蛋 白酶消化時(shí)，可用甲醛固定，而不用ca rnoy或乙醇。3、dna變,性brdu摻入單鏈dna堿基序列須經(jīng)酸、堿、酶或加熱等打 開dna雙螺旋結(jié)構(gòu)中的氫鍵，離子鍵和堿基推積力使dna雙鏈 分離單鏈。dna變性方式及程度

5、直接影響標(biāo)記效果， williamson等回顧123份關(guān)于結(jié)直腸癌的報(bào)告，發(fā)現(xiàn)用酸變 性約占80%,作者在間設(shè)9個(gè)濃度比較分析，對每種濃度作用 的組織切片分別數(shù)5x1 03個(gè)細(xì)胞，結(jié)果冰凍切片vhcl濃 度變性后標(biāo)記指數(shù)最高。低濃度酸產(chǎn)生高l i的原因可能dna 雙鏈?zhǔn)Х€(wěn)態(tài)，組胺蛋白離解產(chǎn)生易使抗原摻入的sssna片段, 另有人提出用低濃度酸從dna離解出組胺蛋白后加熱變性, 可避免組胺產(chǎn)生穩(wěn)定dna低抗熱變性的作用。消除組胺可降 低原位dna的熔解溫度閾，酸預(yù)處理使染色質(zhì)核小體結(jié)構(gòu)幾 乎全部破壞，從而使dna解螺旋更廣泛11。堅(jiān)持熱變性者 認(rèn)為加熱較酸對brdu摻入能提供更多結(jié)合部位。此外，

6、變 性和單抗孵育須嚴(yán)格銜接，如變性后bu20a單抗孵育延誤1 小時(shí)，brdu陽性細(xì)胞核標(biāo)記數(shù)便從%降至%7,說明影響li 的因素復(fù)雜，加單抗前仔細(xì)研究變性技術(shù)及干擾因素，從而 獲得br du標(biāo)記應(yīng)有的高li是必要的。另外采作brdu標(biāo)記 核酸分子可能對dna變性有特殊要求，需進(jìn)一步探索。4、標(biāo)記染色：如何延長brdu作用時(shí)間以標(biāo)記新進(jìn)入s期的細(xì)胞。使增 殖緩慢的細(xì)胞標(biāo)記率提高，是另一個(gè)重要問題，早年有人用 恒定套管裝置和非生物降解彈丸對大鼠研究，但結(jié)果重復(fù)性 差。近來may singer研制一種具有很好的生物相容性可降解 的微囊用于體內(nèi)、外標(biāo)記，通過電鏡、影像技術(shù)及免疫細(xì)胞 化學(xué)分析，證明微囊

7、中brdu能有效摻入鼠腦疾患周圍的增 生細(xì)胞核中，可連續(xù)釋放高濃度brdu達(dá)4 8-50小時(shí)12。 另有人研究滲透性微囊和緩彈丸，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記效果均優(yōu)于單次 注射。研究非放射性標(biāo)記物常與放射性標(biāo)記物相比，以證明特 異性，敏感性及其它有關(guān)特性，在同一靶細(xì)胞比較似乎更具 有說服力。然而3h-tdr和brdu的比標(biāo)記研究不能在同一時(shí) 間給藥，因兩種標(biāo)記物在同一個(gè)細(xì)胞增殖周期內(nèi)競爭胸腺喀 噪激酶。有人認(rèn)為兩種標(biāo)記先后給藥均可，另有主張先標(biāo) brdu,理由是3h-tdr放射自顯影乳膠用胰酶去除時(shí)偶有細(xì)胞 丟失，致其后brdu標(biāo)記信號(hào)損失，lin等強(qiáng)調(diào)br du標(biāo)記時(shí) 間較3h-td r長約50分鐘，如先標(biāo)記

8、3h-tdr可望brdu能標(biāo) 記更多早期s期細(xì)胞3 o thoolen從另外角度觀察兩種標(biāo)記 染色之間關(guān)系，將成年的雄鼠分3組，腹膜下分別注射3h-tdr, brdu和兩中標(biāo)記物曲小時(shí)后取睪丸標(biāo)記處理，免疫金銀法染 色，分別計(jì)數(shù)精原細(xì)胞每組平均陽性胞核數(shù)量，結(jié)果3h-td r標(biāo)記為162個(gè)，brdu標(biāo)記為166個(gè)，雙標(biāo)記為146個(gè)說明 90%br du摻入的清原細(xì)胞顯示3 htdr標(biāo)記，另有10%胞核僅 顯示一種標(biāo)記，無交叉性。3h-tdr的b射線散射范圍有限， 使放射自顯影反應(yīng)不可能超過遠(yuǎn)離乳膠lum以上的胞核， 這些胞核或許能被brdu標(biāo)記顯色，少數(shù)細(xì)胞僅接受一種標(biāo) 記的確切原因不清楚，也

9、可能與堿基配對所形成的氫鍵數(shù)量 有關(guān)。此外已證明微波，氯化鋰13、氟尿囉除核昔等均有 助于brdu標(biāo)記。二、檢測：br du特異摻入s期細(xì)胞，通常測定其li,即s期細(xì)胞占 細(xì)胞周期的百分?jǐn)?shù)，標(biāo)記陽性為光鏡下致密覆蓋于胞核上的 褐色沉淀物。檢測方法用單抗或多抗的免疫化學(xué)法，也可用 dna熒光染料染色的細(xì)胞化學(xué)法。目前常用免疫金銀法，因 該法不受內(nèi)源性過氧化酶影響，較免疫酶標(biāo)法有更好對照背 景。不同類型細(xì)胞dna對變性敏感性的差別可能由染色質(zhì)結(jié) 構(gòu)決定，某些類型對變性反應(yīng)遲鈍，使檢測不敏感或失敗, 有人提倡單抗聯(lián)接b rdu后用fcm檢測較免疫組化法更客觀 省時(shí)，且可測出腫瘤倍體14。但需注意惡性

10、瘤常伴組織及 細(xì)胞壞死，:brdu不能摻入死亡細(xì)胞，故用fcm分析須除外死 亡細(xì)胞，否則可被錯(cuò)誤當(dāng)成靜止細(xì)胞。胰酶和dnase混合孵 育細(xì)胞標(biāo)本有可能克服死亡細(xì)胞干擾三、brdu標(biāo)記和3h-tdr標(biāo)記的比較與32p、35s等常用放射性核素相比，3h-tdr釋放的b -粒子能量低，散射極少，因此感光乳膠上的成影分辨最高， 放射性損傷相對較小，且半衰期較長。3h -tdr標(biāo)記用放射 自顯影術(shù)和閃爍計(jì)數(shù)檢測，靈敏度高，結(jié)果確切。其應(yīng)用價(jià) 值已經(jīng)肯定。因此研究非放射性標(biāo)記物多以3h-tdr為標(biāo)準(zhǔn) 對照。在腫瘤生物學(xué)和細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)的研究中，mayer在 試管內(nèi)分析一組人乳腺癌大樣本，比較brdu和3h

11、-tdr的標(biāo) 記效果，3h-tdr標(biāo)記234例，平均li為士； btciu標(biāo)記450 例，平均土,兩種標(biāo)記物無顯著差異(p>)obrd u和3h-tdr 標(biāo)記的腫瘤大小，組織類型，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，胞核大小以及dna 倍體均正相關(guān)，充分說明兩種標(biāo)記物之間的密切關(guān)系。在同 一靶細(xì)胞標(biāo)記也證明9 0%以上標(biāo)記3h-tdr陽性細(xì)胞也標(biāo)記 有brdu,反之亦然。四、應(yīng)用：brdu標(biāo)記用于dna修復(fù)、復(fù)制、分子雜交的重組dna技 術(shù)可替代同位素標(biāo)記，在分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞增殖動(dòng) 力學(xué)，腫瘤生物學(xué)、免疫學(xué)、藥理和藥代動(dòng)力等領(lǐng)域有廣泛 應(yīng)用價(jià)值。kitazaws等用brdu標(biāo)記對白血病細(xì)胞hl-60和

12、k562基因表達(dá)進(jìn)行研究，將標(biāo)記dn a和rna原位雜交，發(fā) 現(xiàn)80%用于合成dna的胸腺囉噪被brdu替代1 50stevenson 等用brdu單抗和fcm對哺乳動(dòng)物細(xì)胞balb/c, 3t3, colon2 6等6種細(xì)胞系研究殺瘤性巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒作用對細(xì)胞動(dòng) 力學(xué)的影響。受試細(xì)胞系接觸之前，先經(jīng)br du脈沖標(biāo) 記，即在適當(dāng)時(shí)間加入brdu,只作用短時(shí)間馬上洗去，以保 證brdu摻入dna的精確時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在12小時(shí)的細(xì)胞培 養(yǎng)中，6促細(xì)胞系的細(xì)胞均可被殺瘤性m©阻滯在細(xì)胞周期的每一個(gè)時(shí)相內(nèi)16 o近幾年來，由于brdu標(biāo)記方法敏感、簡單和迅速，該技 術(shù)在腫瘤增殖動(dòng)力學(xué)領(lǐng)域

13、的研究也非?；钴S17-20 o目前 brdu標(biāo)記不僅用于腫瘤診斷，評(píng)估預(yù)后，對指導(dǎo)腫瘤治療已 受重視，將活檢標(biāo)本li作為術(shù)后的是否行輔助治療的依據(jù)， 尤其對增大的區(qū)域淋巴結(jié)價(jià)值更大，區(qū)域淋巴結(jié)已轉(zhuǎn)移病例 可按li高低確定化療方案，現(xiàn)已明確小劑量化療后腫瘤復(fù) 發(fā)者是li高的病例，而不是li低者。值得提出的是b rdu 的li較fcm的di更客觀可靠，因fcm難于識(shí)別雙相二倍體 和異倍體腫瘤dna分布的s期細(xì)胞，而且di的s期細(xì)胞數(shù) 也可能含有死亡細(xì)胞21。此外已證明brdu替代腺11 密喘所 合成的dna對放射性物質(zhì)更敏感，使腫瘤對放療的敏感性增 加22, 23 o可以預(yù)言，brd u標(biāo)記作為一

14、種新近倍受重視 的材料和方法在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景將會(huì)十分廣闊。參考文獻(xiàn)knol ja. walkersc, roberisonjm, etof5-bromo- 2deoxyuridin eintocolorec tallivermeta stasesandliv erinpatients receivinga7-dayhepaticar terialinfusi on. cancerres ,1995,55：368 7meyerjsk oehmsl,hughe sjmetlabdlin gfors-phasem easurementinbreastcarcio nma cancer, 19

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