簡明微生物工程

1、 簡明微生物工程微 生 物 工 程包括三個部分：微生物工程原理、微生物工程下游加工工程、微生物工程生產(chǎn)設備。第一章 微生物工程概論 1.第二代微生物發(fā)酵技術(shù)深層培養(yǎng)技術(shù)deep culture 又稱沉沒培養(yǎng)法。有時也稱液體培養(yǎng)法。在深層的液體培養(yǎng)中進行的一種發(fā)酵培養(yǎng)方法。操作時將無菌空氣通入容器中，不斷攪拌，使微生物充分與氧氣接觸而迅速繁殖。占地面積小，勞動力省，產(chǎn)量高，適合于機械化和自動化生產(chǎn)。適用于需氧性微生物。 2.半合成抗生素：某些天然抗生素在去側(cè)鏈后，可用化學合成法接上新的側(cè)鏈而改變原有抗菌譜或其它特性，這樣的抗生素就被稱為半合成抗生素。 3.微生物工程的應用（在哪些領域的有應用并舉

2、例）1） 微生物工程在食品工業(yè)中的應用： 含醇飲料：葡萄酒、果酒、黃酒、白酒、啤酒、白蘭地、威士忌、伏特加、金酒、香檳酒、朗姆酒等。 傳統(tǒng)調(diào)味品及發(fā)酵食品：醬、醬油、醋、豆鼓、豆腐乳、飴糖等 發(fā)酵乳制品：奶酒、干酪、酸奶等；用近代發(fā)酵或酶反應技術(shù)生產(chǎn)的食品原料：葡萄糖、麥芽糖、果葡糖漿、甘露糖醇、脂肪等。 食品添加劑：面包酵母、味精、賴氨酸、檸檬酸、紅曲(色素)、甜味肽、肌苷酸和鳥苷酸、右旋糖酐葡聚糖和茁霉多糖、葡萄糖氧化酶和異維生素C、乳鏈菌肽（食用防腐劉)、匹馬霉素(食品保護劑)。 新型發(fā)酵飲料：活性乳酸飲料2）微生物工程在醫(yī)藥衛(wèi)生中的應用 （1）抗生素：6000多種，絕大多數(shù)是微生物產(chǎn)生

3、的?？辜毦股兀呵嗝顾?、金霉素、紅霉素等等?？拐婢股兀褐泼咕?、兩性霉素、灰黃霉素等等?？乖x抗生素：煙古霉素、古曲霉素等?？鼓[瘤抗生素：放線菌素、絲裂霉素、內(nèi)瘤霉素 （2）氨基酸：氨基酸在醫(yī)藥中主要用于生產(chǎn)氨基酸大輸液?？山?jīng)發(fā)酵獲得的氨基酸有谷氨酸、賴氨酸等?？捎妹阜ǐ@得的氨基酸有天門冬氨酸、丙氨酸等。（3）維生素：目前可用生物技術(shù)生產(chǎn)的維生素或其中間產(chǎn)物有維生素B2、維生素B12、維生素c的前體、類胡蘿卜素、維生素D2的前體等。（4）甾體激素：可的松、氫化可的松、潑尼松、強的松龍、膚氫松、地塞米松、確安舒松等甾體激素化學合成過程中，有若干步是用微生物的生物轉(zhuǎn)化來完成的。 （5）生物制

4、品：生物制品是指含抗原的制品，被用于預防、診斷或治療傳染病。由減毒或死的病毒或立克次氏體制造的疫苗，如牛痘和斑疹傷寒疫苗；（6）治療用酶： 如蛋白酶和核酸酶可用于加速去除壞死組織、膿汁、分泌液、血腫；胃蛋白酶、脂肪酶、蛋白酶可幫助消化等等。（7）酶抑制劑淀粉酶抑制劑可治糖尿病；抑肽素(蛋白質(zhì)抑制劑)可用于治療胃潰瘍；多巴丁有降血壓作用。3.微生物工程在輕工業(yè)中的應用主要是用于輕工業(yè)及其食品工業(yè)中的酶：糖酶：蛋白酶：加入洗滌劑等果膠酶：果汁或果酒的澄清等脂肪酶：降解脂肪為甘油和有機酸凝乳酶：奶酪過氧化氫酶：將雙氧水分解4.微生物工程在化工能源產(chǎn)品中的應用利用發(fā)酵、生物轉(zhuǎn)化或酶法生產(chǎn)下列產(chǎn)品：烷烴

5、：甲烷醇及溶劑： 乙醇、甘油(丙三解)等有機酸：醋酸、丙酸等多糖：右旋糖酐、黃原膠等。清潔能源：氫氣等。5.微生物工程在農(nóng)業(yè)中的應用（1）生物農(nóng)藥：微生物殺蟲劑、防治病害如殺稻瘟菌素等。（2）生物除草劑：利用微生物產(chǎn)生的環(huán)己酰胺、谷氨酰胺合成酶等除草；（3）生物增產(chǎn)劑：赤霉素是一種能促種子萌芽、植株助長的植物生產(chǎn)素。還有固氮菌、鉀細菌、磷細菌、抗生菌制劑作為輔助肥料及抗菌增產(chǎn)劑。（4）食用菌和藥用真菌：主要品種有蘑菇、草菇、香菇、猴頭菌、靈芝銀耳、木耳、冬蟲夏草等。6.微生物工程在環(huán)境保護中的應用自然界本身就存在著碳和氮的循環(huán)，而微生物在對生物物質(zhì)的排泄物及尸體的分解起著重要的作用。厭氣發(fā)酵法

6、：如沼氣發(fā)酵；好氣發(fā)酵法：如活性污泥對工業(yè)和生活污水處理；7.微生物工程在細菌冶金中的應用利用化能自養(yǎng)細菌如鐵細菌、硫化細菌等把鐵氧化為高鐵，將合硫金屬礦石(一般采用貧礦)中的金屬離子形成硫酸鹽而釋放出來。此法浸取的金屬有銅、鈷、鋅、鉛、鈾等8.微生物工程在高技術(shù)研究中的應用如基因工程中用的限制性內(nèi)切酶、連結(jié)酶、DNA探針等；醫(yī)學診斷或工業(yè)過程檢測用的生物傳感器(酶或微生物電極) 、生物芯片(blochip）等。第二章 生產(chǎn)菌種的來源微生物工程的工業(yè)生產(chǎn)三個要素：生產(chǎn)菌種的性能、發(fā)酵及提純工藝條件、生產(chǎn)設備，其中優(yōu)良的菌種是最重要的。1.富集培養(yǎng)：又稱增殖培養(yǎng)，就是利用不同微生物生長對環(huán)境和培

7、養(yǎng)基的特殊要求，設計選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長條件，使目的微生物在最適環(huán)境中大量繁殖，由原來自然條件下的劣勢種變?yōu)槿斯きh(huán)境下的優(yōu)勢種，以利于分離。2.一般菌種分離純化和篩選步驟如下： 標本采集 標本材料的預處理富集培養(yǎng) 菌種初篩菌種復篩性能鑒定 菌種保藏。3.菌種的分離1） 施加選擇性壓力分離法2） 隨機分離方法：（1. 抗生素產(chǎn)生菌的分離、2. 抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離、3. 酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離、4. 生長因子產(chǎn)生菌的分離、5. 多糖產(chǎn)生菌的分離）第三章 優(yōu)良菌種選育 自然選育：在生產(chǎn)程中，不經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變而進行菌種篩的過程。 雜交育種：是指將兩個基因型不同的菌株經(jīng)吻合或

8、接合，使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選出具有新性狀的菌株。 準性生殖：所謂準性生殖是指真菌中不通過有性生殖的基因重組過程。準性生殖的整個過程包括三個相互聯(lián)系的階段，即異核體的形成，二倍體的形成，體細胞重組。 1.誘變選育誘變育種能有效提高菌種生產(chǎn)能力誘變育種的原理：誘變育種的理論基礎是基因突變，突變主要包括染色體畸變和點突變二大類。（知道提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法有哪些）第4章 菌種保藏的原理和方法 要創(chuàng)造適于微生物休眠的環(huán)境，主要是通過降低培養(yǎng)基營養(yǎng)成分（寡營養(yǎng)）、低溫、干燥和缺氧四個階段。 1.斜面低溫保藏法：將菌種接種在不同成分的斜面培養(yǎng)基上，待菌種充分生長后，便可放在4左右的冰箱內(nèi)保藏。細

9、菌、酵母菌、放線菌和霉菌都可使用這.保藏方法。保存期為3-6個月。原理：低溫下，微生物代謝. 2.砂土管保藏法：適合于產(chǎn)孢子或芽胞的微生物。一般保存期為2年左右，有的可達十幾十年。原理：干燥，寡營養(yǎng)。 3.真空冷凍干燥保藏法：加有保護劑的菌懸液在凍結(jié)狀態(tài)下予以真空干燥。適用于各種微生物，便于大量保藏，菌種存活時間長，是目前最好的保藏方法。原理：干燥，低溫。 4.液氮保藏法：將菌種置于保護劑中，預凍后保存在液氮超低溫冰箱中（ -196）。適用于各種微生物的較理想的保藏方法。對一些不產(chǎn)孢子的菌絲體用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法。其保存期最長。原理：低溫 5.懸液保藏法（寡營養(yǎng)保藏）：將微生物

10、懸浮在不含養(yǎng)分的溶液中，如水、緩沖液、生理鹽水，室溫保藏，一般為一年。適用于絲狀狀真菌、酵母及腸道細菌。原理：寡營養(yǎng) 6.低溫保藏法：-20, -40, -80低溫冰箱保藏。 7.石蠟油封存法：向培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，倒入一層滅過菌的石蠟油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中此法可適用于不能利用石蠟油作碳源的細菌、霉菌酵母等微生物的保存。保存期約一年左右。原理：低溫、缺氧 第5章 微生物的代謝調(diào)節(jié)和代謝工程 1.酶促調(diào)節(jié)的方式包括酶活性的調(diào)節(jié)和酶合成調(diào)節(jié)兩大類。 酶活性調(diào)節(jié)包括：酶的激活作用和酶的抑制作用。酶活性調(diào)節(jié)的機制：有變構(gòu)調(diào)節(jié)理論、化學修飾作用、締合與解離、競爭性抑制等。酶合成調(diào)節(jié)

11、的類型：包括誘導和阻遏兩種類型。阻遏：是在某種物質(zhì)作用下導致某種酶合成停止或合成速率降低的現(xiàn)象。誘導：是指在某種化合物作用下，導致某種酶合成或合成速率提高的現(xiàn)象。酶合成的誘導作用 在微生物里，酶可以分成誘導酶與組成酶兩大類。組成酶：是機體內(nèi)一類不依賴于酶的底物或底物結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶,如：EMP途徑的一些酶。誘導酶(又稱適應酶)：是一類依賴于底物或底物結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶。如：乳糖酶。2.酶量的調(diào)節(jié)與酶活調(diào)節(jié)的區(qū)別： 區(qū)別：酶活性調(diào)節(jié):是對現(xiàn)有的酶在活性變化上進行調(diào)節(jié)，它不會涉及酶量的變化；酶量的調(diào)節(jié):不涉及現(xiàn)有酶活性的變化，只是通過影響酶合成或酶合成速率以控制酶量變化，達到控制

12、代謝過程的目的。從調(diào)節(jié)作用的特點上看:酶活性調(diào)節(jié)的效果既及時又迅速，但由于酶量調(diào)節(jié)涉及到酶蛋白合成，它調(diào)節(jié)的效果相應地來得慢。葡萄糖效應：分解代謝產(chǎn)物阻遏是在研究混合碳源對微生物生長的影響時發(fā)現(xiàn)的。發(fā)現(xiàn)葡萄糖能夠抑制其他糖的利用，只有在葡萄糖利用完以后，才開始利用其它的糖。在利用其它糖時，有一生長停滯期，是利用第二種糖的酶合成時期。這種酶誘導的阻遏現(xiàn)象最初以為只限于葡萄糖，因而被稱為葡萄糖效應。組成突變株：通過誘變處理，使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，不產(chǎn)生有活性的阻遏蛋白，或者操縱基因發(fā)生突變不再能與阻遏物相結(jié)合，都可達到此目的。 這樣的突變株稱為組成型突變株。3.人工控制代謝的手段（代謝調(diào)控）：控制發(fā)

13、酵條件（生物化學方法）；改變微生物遺傳特性(遺傳學方法）；改變細胞膜透性； 4.前體：是指加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物，能被微生物直接結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而自身的結(jié)構(gòu)無多大變化，且具促進產(chǎn)物合成的作用。 誘導物：許多與蛋白質(zhì)、糖類或其他物質(zhì)降解有關(guān)的酶類都是誘導酶，在發(fā)酵過程中加入相應的底物作為誘導物。 前體與誘導物的區(qū)別：1. 有時難于區(qū)分促進作用是誘導物的作用還是前體的作用。2.一般，可把那些能在生長期內(nèi)、生產(chǎn)期前促進產(chǎn)物合成的化合物看做誘導物，而前體往往只在生產(chǎn)期內(nèi)起作用。3.另外，誘導物可以被非前體的結(jié)構(gòu)類似物取代。 5.初級代謝與次級代謝的概念及代謝產(chǎn)物： 初級代謝：是為生物提供能

14、量、合成中間體及其關(guān)鍵大分子的各種相互關(guān)聯(lián)的代謝網(wǎng)絡（包括分解與合成） ，對菌的生長是必需的。初級代謝產(chǎn)物有單糖、核苷酸、脂肪酸、蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂類等等。次級代謝：次級代謝主要涉及合成過程，其終產(chǎn)物、次級代謝物對菌的生長不是必需的，對其生命活動可能具有某種意義，通常是在生長后期開始形成的。次級代謝產(chǎn)物主要有抗生素，青霉素、鏈霉素、生物堿、維生素、色素、毒素、生長刺激素等。第6章 培養(yǎng)基1. 按其他特殊用途劃分 ：1.孢子培養(yǎng)基 、2.種子培養(yǎng)基 、3.發(fā)酵培養(yǎng)基2. 孢子培養(yǎng)基：是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基，對這種培養(yǎng)基的要求是：能使菌體迅速生長，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，并要求這培養(yǎng)

15、基不易引起菌種發(fā)生變質(zhì)。 種子培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌體長得粗壯，成為活力強的“種子”。 發(fā)酵培養(yǎng)基：酵培養(yǎng)基是供菌種生長、繁殖和合成產(chǎn)物之用。它即要使種子接種后能迅速生長，達到一定的菌絲濃度，又要使長好菌體能迅速合成所需產(chǎn)物。3. 培養(yǎng)基設計的步驟： 根據(jù)前人的經(jīng)驗和培養(yǎng)基成分確定時一些必須考慮的問題，初步確定可能的培養(yǎng)基成分； 通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分 當培養(yǎng)基成分確定后，剩下的問題就是各成分最適濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實驗次數(shù)常采用一些合理的實驗設計方法如正交實驗設計、響面分析法。4. 培養(yǎng)基成分：碳源、氮源、無機鹽、微量元

16、素、特殊生長因子、促進劑、前體和水等幾大類。5. 補料的作用：1）豐富培養(yǎng)基，避免了菌體過早衰老，使產(chǎn)物早衰老，使產(chǎn)物合成的旺盛期延長2）控制了pH值和代謝方向； 3）改善了通氣效果，避免了菌體生長可能受到的抑制；4）補料還能補足發(fā)酵酵液的體積補料的物質(zhì)：碳、氮、水及其他。 第七章 種子擴大培養(yǎng)斜第8章 發(fā)酵工藝控制表現(xiàn)在哪五個方面，影響這五個條件的因素有哪些，又如何去控制？ 影響供氧因素：（主要為前兩個因素）攪拌、空氣流量、發(fā)酵液性質(zhì)、微生物生長、消泡劑、離子強度泡沫對發(fā)酵的危害：1) 降低了發(fā)酵罐的裝料系數(shù)。 2)增加了菌群的非均一性 3)增加了污染雜菌的機會 4)導致產(chǎn)物的損失 5)消沫

17、劑的加入將給提取工序帶來困難。泡沫的產(chǎn)生與通氣、攪拌的劇烈程度有關(guān)。泡沫的消除與防止：泡沫控制的方法可歸納為機械消沫和消沫劑消沫兩大類。也有從微生物本身的特性著手，防止泡沫的形成，如選育或混養(yǎng)。 第八章 微生物反應動力學 反應動力學：研究反應速度變化規(guī)律的學科。即研究各種環(huán)境因素與微生物代謝活動之間相互作用隨時間而而變化的規(guī)律。 發(fā)酵動力學：研究各種發(fā)酵過程變量在活細胞的作用下變化的規(guī)律，以及各種發(fā)酵條件對這些變量變化速度的影響。并以數(shù)學、工程學的原理，定量描述。 發(fā)酵過程按進行過程有三種方式：分批發(fā)酵（與生長相關(guān)型、與生長部分相關(guān)型、與生長不相關(guān)型)、補料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵 稀釋率D：流量與

18、培養(yǎng)液體積之比，其含義是是指單位時間內(nèi)加入的培養(yǎng)基體積占發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基體積的分率。dX/dt ( -D ) X 單級連續(xù)培養(yǎng)中進入穩(wěn)定狀態(tài)后，細胞的與D相等。 對數(shù)生長期：在這一階段中，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)豐富，有毒代謝物少，細胞生長不受限制，因此細胞濃度隨培養(yǎng)時間呈指數(shù)增長，細胞濃度的變化率與細胞濃度成正比：dX/dt ( -D ) X 比生長速率與微生物種類、培養(yǎng)溫度、pH、培養(yǎng)基成分及限制性基質(zhì)濃度等因素有關(guān)。 連續(xù)發(fā)酵：培養(yǎng)基料液連續(xù)輸入發(fā)酵罐，并同時放出含有產(chǎn)品的相同體積發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)料液量維持恒定，微生物在近似恒定狀態(tài)（恒定的基質(zhì)濃度、恒定的產(chǎn)物濃度、恒定的pH、恒定菌體濃度、恒

19、定的比生長速率）下生長的發(fā)酵方式。 補料分批發(fā)酵：補料分批發(fā)酵又稱半連續(xù)發(fā)酵或流加分批發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方式。 分批發(fā)酵：分批培養(yǎng)指的是一次投料，一次接種，一次收獲的間歇培養(yǎng)方式。在這一過程中，除了氧氣、消泡劑及控制pH的酸或堿外，不再加入任何其它物質(zhì)。發(fā)酵過程中培養(yǎng)基成分減少，微生物得到繁殖 微生物下游加工工程概論 1.微生物工程下游加工工程的特點：.培養(yǎng)液中所含欲提取的生物物質(zhì)濃度很低，雜質(zhì)含量卻很高。.下游加工過程的代價昂貴，回收率不高；.欲提取的生物物質(zhì)通常很不穩(wěn)定。遇熱、極端pH、有機溶劑會引起失活或分解。發(fā)酵或培養(yǎng)都是分批操作、生物變異性大

20、，各批發(fā)酵液不盡相同，這就要求下游加工有一定的彈性，特別是對染菌的批號，也要能處理。 2.般說來下游加工過程可分為4個階段：1)培養(yǎng)液(發(fā)酵液)的預處理和固液分離；2)初步純化(提取)；3)高度純化(精制)；4)成品加工。 第12章 發(fā)酵液的預處理和過慮1. 發(fā)酵液處理的目的：1）改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，加快懸浮液中固形物沉降的速度；2）盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于以后處理的相中（多數(shù)是液相）；3）能夠除去部分雜質(zhì)。2.高價無機離子的去除方法：Ca2：草酸 Mg2：Na5P3O10三聚磷酸鈉 Fe3：黃血鹽3. 可溶性雜蛋白的去除方法：等電點、變性、利用吸附作用除去蛋白質(zhì)4. 凝聚：是在中性鹽作用下，由

21、于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。這種方法形成的顆粒較小，不能有效分離。 絮凝：是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團的過程，是一種以物理的集合為主的過程。5. 改善過濾性能的方法：等電點、變性、吸附、凝聚和絮凝、加入助濾劑、直接在發(fā)酵液中形成填充-凝固劑、酶解作用6. 細胞破碎的阻力與方法：1） 細胞破碎的主要阻力來自于細胞壁。破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密程度和強度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度。2） 機械方法：球磨機、高壓勻漿器（常用機器）、X-press法、超聲波破碎 非機械方法：酶解、滲透壓沖擊

22、、凍結(jié)和融化、干燥法、化學法破碎方法的選擇：選擇合適的破碎方法需要考慮下列因素：1）細胞的數(shù)量； Ø2）所需要的產(chǎn)物對破碎條件(溫度、化學試劑、酶等)的敏感性；3）要達到的破碎程度及破碎所必要的速度，盡可能采用最溫和的方法； Ø4）具有大規(guī)模應用潛力的生化產(chǎn)品應選擇適合于放大的破碎技術(shù)。第19章 培養(yǎng)基滅菌及其滅菌 1.濕熱滅菌 即利用飽和蒸汽進行滅菌。優(yōu)點：1）蒸汽來源容易，操作費用低，本身無 毒；2）蒸汽有強的穿透力，滅菌易于徹底；3）蒸汽有很大的潛熱；4）操作方便，易管理。2. 培養(yǎng)基滅菌溫度的選擇：達到要求的無菌程度 (取N=10-3)。（必須選擇既能達到滅菌目的，又能使培養(yǎng)基的破壞降至最低的工藝條件。一般情況下，培養(yǎng)基滅菌采用高溫短時間的方法，以減少營養(yǎng)成分的破壞。）3.培養(yǎng)基的分批滅菌：將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設備一起