實驗七 植物mRNA原位雜交技術(shù)上課講義

1、實驗七 植物mRNA原位雜交技術(shù)mRNA原位雜交技術(shù)的原理原位雜交（insituhybridization）是一種在細胞水平上研究基因表達調(diào)控的最直接有效的分子生物學(xué)技術(shù)。RNA原位雜交是用同位素標記或非同位素標記的雙鏈DNA或單鏈反義RNA探針對組織切片或裝片的不同細胞中基因產(chǎn)物mRNA或rRNA進行原位定位。分布于細胞中的mRNA與反義RNA探針互補而雜交產(chǎn)生雙鏈的RNA。標記在反義鏈上的同位素經(jīng)放射自顯影、非同位素經(jīng)酶促免疫顯色或免疫熒光反應(yīng)，均可顯示mRNA在植物組織細胞中的分布位置。用標記的有義RNA作探針，由于與細胞內(nèi)的mRNA不互補而不能雜交，可以作為對照。材料固定混合固定液：混

2、合固定液：1、 FAA固定液：植物組織最常用的固定液。固定時間不受限制，并且固定后材料可以正常染色。配方：50%或70%酒精90毫升（軟材料用50%酒精，硬材料用70%酒精），冰醋酸5 ml，福爾馬林5 ml。2、卡爾諾氏（Carnoys）固定液：多用于組織和細胞的固定，滲透力極快，一般情況下，固定根尖和花藥只需40-60分鐘。固定后用95%酒精沖洗，在組織不能立即處理時，需轉(zhuǎn)入70酒精中保存。配方1：15 ml乙醇和5 ml冰醋酸混合；配方2：30 ml乙醇，5 ml氯仿和1 ml冰醋酸混合。3、納瓦興（Navaschjns）固定液：植物制片技術(shù)中廣泛應(yīng)用。配方：75 ml 1%鉻酸，5 m

3、l冰醋酸和20 ml福爾馬林混合。根據(jù)實驗材料的種類，目前有很多的改良液，效果更好。材料脫水材料洗滌后，如果材料含有水分，水與石蠟不能相溶，通常用酒精脫水。材料由水入酒精中，由低濃度酒精漸至高濃度酒精。通常由30%、50%、70%、80%到90%酒精，每次須經(jīng)半小時左右，具體的時間由材料大小而定。材料可放在70酒精中較長保存，但在高濃度酒精中不能過久。因為酒精能使材料硬化，過久則材料由硬而脆，切片時易于粉碎。材料透明材料脫水后，仍需除去酒精，脫酒精通常用二甲苯。材料由酒精入二甲苯，也需要漸次進行，先經(jīng)酒精和二甲苯的混合液，再入純二甲苯中，純二甲苯須換一、二次才行。時間每次約半小時。二甲苯不僅脫

4、去酒精，并且具透明作用，所以又叫透明劑。材料包埋埋蠟是把材料包埋在石蠟里面，便于切片。石蠟質(zhì)地必須純凈，溶點通常在48-56 范圍內(nèi)，以52 的石蠟使用更為方便。將石蠟置陶瓷缽中加熱熔化；在進行封埋的全過程中，石蠟的溫度以高于溶點2 為宜，溫度低則石蠟?zāi)蹋瑴囟冗^高則傷害實驗材料。在包埋之前需要對實驗材料進行浸蠟。浸蠟需要漸次進行。一般先用石蠟和二甲苯的混合液浸蠟，再用純石蠟換1-2次，每次時間視材料大小而定，通常每次半小時。二、制片（12月3日）切片切片： 1. 先將蠟塊切成小塊，粘固在小木頭樁上。 2. 安裝切片刀，調(diào)好角度和切口部位。 3. 根據(jù)需要調(diào)整切片厚度，進行切片。展片展片：將切

5、好的石蠟材料平展在玻片上，一般借助水將石蠟切片展開。粘片粘片：通過加熱使切好蠟帶平展在載玻片上。用濾紙吸去載玻片上多余水分，同時以記號筆在玻片上編號以確定材料方位，放入42溫箱中烘干，約12小時。粘片（載玻片的處理）多數(shù)采用多聚賴氨酸作為粘貼劑，多聚賴氨酸常用PBS配制。方法：用之前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內(nèi)，使其溫度回升至室溫（一般為18-26 ）。將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液中5-30分鐘。然后在60 烘箱干燥1小時，或室溫18-26 過夜干燥，待用。三、探針制備RNA探針是指帶有標記的能與組織內(nèi)相對應(yīng)的核苷酸序列互補結(jié)合的一段單鏈cDNA或cRNA分子。根據(jù)在RNA雜交中所使用的探

6、針依其來源可分為三種：1、特異性特異性cDNA： cDNA中不存在內(nèi)含子及其它高度重復(fù)序列，又克服了雙鏈cDNA探針在雜交反應(yīng)中兩條鏈之間復(fù)性的缺點，從而提高了雜交反應(yīng)的敏感性2、cRNA探針探針：以cDNA為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄而獲得的。因為它是一種單鏈探針，因此也避免了應(yīng)用雙鏈cDNA探針做雜交反應(yīng)時存在的兩條鏈之間的復(fù)性問題。cRNA與RNA之間形成的雜交體要比cDNA-RNA雜交體穩(wěn)定。cRNA-RNA之間形成的雜交體不受RNA酶的影響。因此雜交反應(yīng)后可用RNA酶處理，以除去未結(jié)合的探針。3、人工合成寡核苷酸探針人工合成寡核苷酸探針：人工合成的寡核苷探針是以核苷酸為原料，通過DNA合成儀

7、合成，避免了真核細胞中存在的高度重復(fù)序列帶來的不利影響。它與mRNA形成的雜交體不如cRNA-RNA雜交體穩(wěn)定，再則探針較短，所攜帶的標記物少，敏感性較低。探針標記同位素標記探針和非同位素標記探針同位素標記探針和非同位素標記探針1、同位素標記：主要包括3H、35C、32P和125I等，不同的同位素探針其穿透力、定位和半衰期各不相同，無一種同位素探針具有穿透力強、定位好和半衰期長所有優(yōu)點。2、非同位素標記;標記物主要有生物素、地高辛、酶和熒光標記等。其中地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但具有生物素標記優(yōu)點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干擾等缺點，其應(yīng)用

8、越來越廣泛。標記探針的方法酶反應(yīng)法：酶反應(yīng)法：用于RNA探針的酶反應(yīng)法主要為末端標記法與體外轉(zhuǎn)錄法。1、末端標記末端標記：適用于合成寡核苷酸探針的標記，用末端標記制備的探針一般攜帶的標記分子較少。2、體外轉(zhuǎn)錄法體外轉(zhuǎn)錄法是一種制備與片段序列相同的單鏈RNA探針的方法。進行體外轉(zhuǎn)錄時，先將靶核苷酸序列轉(zhuǎn)入到含噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動子的載體中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA為模板，以含有標記的三磷酸苷為原料，對啟動子下游的序列進行轉(zhuǎn)錄，而啟動子本身并不被轉(zhuǎn)錄。體外轉(zhuǎn)錄法制備探針體外轉(zhuǎn)錄常用噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動子，如沙門氏菌噬菌體和大腸桿菌噬菌體T3、T7。當兩個不同的噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動子結(jié)合在載體多位點的兩側(cè)

9、，用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶在插入序列的下游將質(zhì)粒線性化。SP6噬菌體的RNA聚合酶對SP6啟動子序列具有高度的親和性，從而啟動下游的轉(zhuǎn)錄，在4種三磷酸核糖核苷和相應(yīng)的噬菌體RNA聚合酶存在的條件下，即轉(zhuǎn)錄成RNA。如反應(yīng)物中含有標記的三磷酸核糖苷核，所有的RNA就被標記。體外轉(zhuǎn)錄法中常使用的載體mRNA雜交探針（體外轉(zhuǎn)錄）T7 promoter55 與mRNA序列相同，對照探針與mRNA序列互補，探針T3 promoterHind III探針長度（200-500bp）通過限制性內(nèi)切酶的酶切控制體外轉(zhuǎn)錄合成探針的長度！體外轉(zhuǎn)錄制備探針的步驟1、將目的基因的特異性片段構(gòu)建在合適的載體中；2、通過限制性

10、酶切控制轉(zhuǎn)錄合成探針的大??；3、體外轉(zhuǎn)錄（同時標記探針）地高辛標記的體外轉(zhuǎn)錄（12月3日）1、按照下表將各成分加入EP管中，混勻后在37 保溫2小時；2、加入2 l無RNase的DNaseI，37保溫15分鐘；3、加入2 l 0.2 mol/L EDTA終止反應(yīng)；4、加入2.5 l 4 mol/L LiCl 和75 l冰冷的100%乙醇，沉淀過夜；5、12000 rpm，4 離心15分鐘。用70%冷乙醇清洗后在室溫下進行干燥。6、根據(jù)沉淀物的多少（一般為6-10 g），重懸于30-50 l DEPC-H2O中， 并加入20 U RNase抑制劑，-20 保存。四、預(yù)雜交預(yù)雜交（12月月4日上午

11、）日上午）1將已粘片的石蠟切片在二甲苯中脫蠟30分鐘。2在二甲苯：乙醇（1:1）、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、30%乙醇和DEPC-H20中復(fù)水，每級2-5分鐘。3在0.2 mol/L HCl中浸20分鐘。4在2 SSPE中洗2次，DEPC-H2O中洗2次，每次5分鐘。5在含有1%牛血清白蛋白的10 mmol/L Tris-HCl（pH 8）中浸10分鐘。6DEPC-H2O中洗2次，每次5分鐘。7經(jīng)30%，70%，95%，100%乙醇系列脫水，每次2-5分鐘，室溫晾干。五、雜交（12月月4日）日）1、將轉(zhuǎn)錄物用稀釋液（50%甲酰胺，10 mM二硫蘇糖醇（DTT），用DEPC-H2O定

12、容）稀釋。2、70加熱5分鐘，再加入雜交緩沖液。3、每玻片上加雜交液100 l，輕輕蓋上經(jīng)180 烘烤8小時以上的蓋玻片。4、在濕盒中60 保溫過夜。（約12-16小時）雜交緩沖液配方雜交緩沖液配方10鹽：3 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl （pH 6.8），0.1 mol/L Na2HPO4， 50 mmol/L EDTA，溶于DEPC-H2O。六、雜交后處理（12月5日上午）1、讓蓋玻片在2 SSC中自由滑落，室溫浸泡15分鐘。2、轉(zhuǎn)入另一2 SSC中浸泡15分鐘。3、1 SSC中15分鐘。4、0.5 SSC中15分鐘。七、免疫反應(yīng)（12月5上午）1、在緩沖液I

13、（100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.5）中5分鐘。2、每片滴加約500 l含2%正常兔血清，0.3% Triton X-100的緩沖液I，室溫放置30分鐘，作封阻反應(yīng)。3、將anti-DIG-AP按1:500的比例用含1正常兔血清，0.15% Triton X-100的緩沖液稀釋。4、倒掉封阻液，每片滴加100 l稀釋的anti-DIG-AP，室溫條件下，在濕盒中放置2-4小時。八、顯色反應(yīng)（12月5日下午） 1、玻片在緩沖液I中浸2次，每次15分鐘。2、緩沖液II（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2，pH 9.5）中5分鐘。3、將10%聚乙烯醇（PVA）90 溶于100 mmol/L Tris-HCl（pH 9.5），100 mmol/L NaCl中，冷卻至室溫后，每ml PVA溶液中加50 l 1 mol/L MgCl2，5 l氮藍四唑（NBT），3.75 l 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）配成顯色液。4、每片滴加200 l顯色液，置濕盒中37 黑暗處顯色6-12小時。九、封片觀察（12月6日）1、將載玻片轉(zhuǎn)入緩沖液III（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmo