微生物量碳的測(cè)定方法3頁(yè)

1、氯仿薰蒸浸提法測(cè)定土壤微生物生物量碳一、采樣與樣品預(yù)處理土壤樣品的采集方法和要求與測(cè)定其它土壤性質(zhì)時(shí)沒(méi)有本質(zhì)區(qū)別。采集到的新鮮土壤樣品立即去除植物殘?bào)w、根系和可見(jiàn)的土壤動(dòng)物(如蚯蚓)等,然后迅速過(guò)篩(23 mm)，或放在低溫下(24)保存。如果土壤太濕無(wú)法過(guò)篩，進(jìn)行晾干時(shí)，必須經(jīng)常翻動(dòng)土壤，避免局部風(fēng)干導(dǎo)致微生物死亡。過(guò)篩的土壤樣品調(diào)節(jié)到田間持水量的50%左右，在室溫下于密閉裝置中預(yù)培養(yǎng)1周，密閉容器中要放入兩個(gè)50mL的燒杯，分別加入水和稀NaOH，以保持其濕度和吸收釋放的CO2。預(yù)培養(yǎng)后的土壤最好立即分析，若需要放置一段時(shí)間，在低溫下(24)最好不要超過(guò)10d。土壤田間持水量采用改進(jìn)的Sh

2、aw（1958）方法測(cè)定。在漏斗下端連接一帶夾子的橡膠管，漏斗用玻璃纖維堵塞。取50.00 g土壤于漏斗中，夾緊橡膠管，加入50 ml水，保持30 min，再打開(kāi)夾子使多余的水流入量筒，30 min后測(cè)定流出的水量，同時(shí)測(cè)定土壤濕度，計(jì)算土壤田間持水量，用烘干土壤質(zhì)量表示。林啟美老師文件內(nèi)容二、方法氯仿薰蒸浸提法（FE）1、方法原理土壤經(jīng)氯仿薰蒸處理，微生物被殺死，細(xì)胞破裂后，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到土壤中，導(dǎo)致土壤中的可提取的碳大幅度增加。通過(guò)測(cè)定浸提液中全碳的含量可以計(jì)算土壤微生物量碳。浸提液中碳可用重鉻酸鉀容量法測(cè)定，也可用微量碳分析儀測(cè)定。此處介紹比較簡(jiǎn)單的重鉻酸鉀容量方法。2、儀器及設(shè)備培養(yǎng)

3、箱；真空干燥器；真空泵；往復(fù)式振蕩機(jī)(速率200rev/min)；冰柜；磷酸浴。3、試劑1. 無(wú)乙醇氯仿：量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液j(H2SO4)=5%，充分搖勻，棄除上層硫酸溶液，如此進(jìn)行3次。再加入50 mL去離子水，同上搖勻，棄去上部的水分，如此進(jìn)行5次。得到純氯仿存放在棕色瓶中，并加入約20g無(wú)水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存?zhèn)溆?。（試劑濃硫?j(H2SO4)=9598% ，稀釋19倍）2. 硫酸鉀溶液c(K2SO4)= 0.5 mol·L-1: 稱取硫酸鉀（K2SO4,化學(xué)純）87.10g，加熱溶于去離子水中，稀釋至1L。

4、(需加熱溶解)3. 重鉻酸鉀c(1/6K2Cr2O7)=0.2000 mol·L-1: 稱取經(jīng)130 oC烘干23h的重鉻酸鉀（K2Cr2O7，分析純）9.8110g，溶于1000mL的去離子水中。4. 重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液：c(1/6K2Cr2O7)=0.1000 mol·L-1: 稱取經(jīng)130 oC烘干23h的重鉻酸鉀（K2Cr2O7，分析純）4.9055g，溶于1000mL的去離子水中。5. 鄰啡羅啉指示劑：稱取鄰啡羅啉指示劑C12H8N2·H2O，分析純1.49g，溶于含有0.70g FeSO4·7H2O的100mL去離子水中，密閉保存于棕色瓶中。6

5、. 硫酸亞鐵溶液c(FeSO4)=0.05 mol·L-1：稱取硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)約13.9005g，溶解于600800mL去離子水中，加濃硫酸（化學(xué)純）20mL，攪拌均勻，定容至1000mL，于棕色瓶中保存。此溶液不穩(wěn)定，需在用時(shí)每天標(biāo)定其濃度。7. 硫酸亞鐵溶液濃度的標(biāo)定： 吸取重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00mL，放入100mL三角瓶中，加水約20mL,加濃硫酸5mL和鄰啡羅啉指示劑2滴，用FeSO4溶液滴定，根據(jù)FeSO4溶液的消耗量即可計(jì)算FeSO4溶液的準(zhǔn)確濃度。硫酸亞鐵溶液標(biāo)定方法：吸取0.1000 mol L-1（1/6 K2Cr2O7）標(biāo)準(zhǔn)溶液(試劑

6、4)5.0ml，放入150ml三角瓶中，加濃硫酸5ml和鄰啡羅啉指示劑2滴，用硫酸亞鐵溶液滴定，滴至溶液由藍(lán)綠色變?yōu)樽丶t色即為終點(diǎn)。根據(jù)滴到終點(diǎn)消耗的硫酸亞鐵溶液量計(jì)算其準(zhǔn)確濃度，即C2 =（C1 ´ V1）/ V2。式中：C1重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（0.1000mol L-1）；C2硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mol L-1）；V1吸取的重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（5ml）；V2滴到終點(diǎn)時(shí)消耗硫酸亞鐵溶液體積（ml）。4、操作步驟4.1薰蒸 稱取相當(dāng)于20.0g烘干土重的濕潤(rùn)土壤3份，分別放在約100 mL的燒杯中，一起放入同一干燥器中，干燥器底部放置小燒杯盛裝少量的水以保持濕度，同時(shí)放入一個(gè)裝

7、有50mL NaOH溶液和一個(gè)裝有約50mL的無(wú)乙醇氯仿的小燒杯(根據(jù)干燥器的大小可以增加氯仿的用量，同時(shí)加入少量的直徑約為0.5mm的碎瓷片)，用少量凡士林密封干燥器，用真空泵抽氣至氯仿沸騰并保持至少2 min。關(guān)閉干燥器的閥門，在25oC的黑暗條件下放置24h。打開(kāi)閥門，如果沒(méi)有空氣流動(dòng)的聲音，表示干燥器漏氣，應(yīng)重新稱樣進(jìn)行薰蒸處理。當(dāng)干燥器不漏氣時(shí)，取出裝有水、堿液和氯仿的燒杯，氯仿倒回瓶中可重復(fù)使用。擦盡干燥器底部，用真空泵反復(fù)抽氣，每一次都要打開(kāi)干燥器，以加快除去氯仿的速度，直到土壤聞不到氯仿氣味為止。薰蒸開(kāi)始的同時(shí)，稱取等量土壤3份，用K2SO4溶液(見(jiàn)下一步驟，試劑2)浸提，同時(shí)

8、做不加土壤為空白對(duì)照。浸提液在室溫下可以放置1周，4下放置1個(gè)月或在-15oC下保存。4.2浸提 薰蒸結(jié)束后，將土壤全部轉(zhuǎn)移到250 mL的塑料震蕩瓶中，加入80 mL 0.5mol/LK2SO4溶液(1:4水土比)，在振蕩機(jī)上振蕩浸提30min（25，185 rev/min）（轉(zhuǎn)速根據(jù)儀器進(jìn)行調(diào)整，必須使得土壤完全振蕩開(kāi),過(guò)濾。4.3測(cè)定 準(zhǔn)確吸取浸出液10.00 mL放入硬質(zhì)消煮管中，加入重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液(試劑3)5.00 mL、濃H2SO4 5mL，加入少量的抗暴物質(zhì),在170-180磷酸浴上煮沸10min，冷卻后用去離子水洗滌消化管全部轉(zhuǎn)移至150mL三角瓶中，總體積為70mL左右，。

9、加入2滴鄰啡羅啉指示劑，用硫酸亞鐵溶液(試劑6)滴定剩余的K2Cr2O7。溶液顏色由橙黃色變?yōu)樗{(lán)綠色，再變?yōu)樽丶t色即為滴定終點(diǎn)。4.4 測(cè)定土壤含水量稱5.00g 上述濕潤(rùn)土壤，放在鋁盒中，在105烘箱中烘8h，然后稱其干重。5、結(jié)果計(jì)算1.有機(jī)碳(Oc)的計(jì)算W(C) =（V0-V1）×c×3×ts × 1000 /DW 式中：W(C) ¾¾ 有機(jī)碳(Oc)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg·kg-1； V0 ¾¾ 滴定空白樣時(shí)所消耗的FeSO4體積，mL； V1 ¾¾ 滴定樣品時(shí)所消耗的FeSO4體積,mL； c ¾¾ FeSO4溶液的濃度,mol·L-1； 3 ¾¾ 碳(1/4C)的毫摩爾質(zhì)量，M(1/4C)=3mg/mmol； 1000 ¾¾ 轉(zhuǎn)換為kg的系數(shù)； ts ¾¾ 分取倍數(shù),等于（浸提液體積+土中的水中）/吸取液的體積；