常規(guī)SNPs-PCR在水稻遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

1、    常規(guī)snpspcr在水稻遺傳多樣性研究中的應(yīng)用    張羽+李小剛+王保軍+王俊義+周凱摘要：探索常規(guī)snps-pcr在生物遺傳多樣性分析中的應(yīng)用。利用5個(gè)功能基因的snp標(biāo)記和11對(duì)ssr標(biāo)記，對(duì)112份陜西省水稻種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析。5個(gè)snp標(biāo)記聚類分析結(jié)果基本符合材料的親緣關(guān)系，11對(duì)ssr標(biāo)記聚類結(jié)果更接近材料的系譜來(lái)源。在樣本量小時(shí)，可以利用常規(guī)snps-pcr分析生物的遺傳多樣性，樣本量大時(shí)，測(cè)序技術(shù)分析更方便和準(zhǔn)確。關(guān)鍵詞：snps-pcr；遺傳多樣性；snp標(biāo)記；ssr標(biāo)記；水稻： s511.032 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： a：1002-

2、1302（2016）09-0028-04發(fā)生在基因組dna水平上的堿基的轉(zhuǎn)換/顛換、插入/缺失及重排等變化導(dǎo)致了生物個(gè)體之間的差異，由此產(chǎn)生了rflp、rapd、ssr和snp等分子標(biāo)記技術(shù)，從dna水平上來(lái)分析各種變異。snp（single nucleotide polymorphism，簡(jiǎn)稱snp）即單核苷酸多態(tài)性，屬于第三代分子標(biāo)記，是許多物種基因組中最常見(jiàn)的變異形式，在基因組中的分布頻率很高。近年來(lái)，snps在人類、擬南芥、大麥、大豆和玉米等多個(gè)物種中的高密度分布已有報(bào)道1-7。2002年，發(fā)表了水稻秈、粳2個(gè)亞種的基因組序列草圖8，2005年又發(fā)表了水稻基因組序列全圖，至此已完成全長(zhǎng)

3、389 mb的水稻全基因組序列95%以上的測(cè)序工作9。研究發(fā)現(xiàn)在水稻基因組中大約每幾百bp10-14甚至幾十bp就有1個(gè)snp15，表明水稻基因組中存在大量的snp，snp已經(jīng)應(yīng)用在水稻圖位克隆、功能基因檢測(cè)、輔助育種選擇等方面16-18。作為第二代分子標(biāo)記的代表ssr（simple sequence repeat）即簡(jiǎn)單序列重復(fù)，在真核生物基因組中大約每隔1050 kb就存在1個(gè)ssr，在生物的遺傳多樣性研究中利用最廣，特別是水稻、油菜、玉米等植物在品種鑒定、新品種保護(hù)等dna指紋圖譜檢測(cè)中都用ssr標(biāo)記19-23。在生物的遺傳多樣性分析中，從理論上講，檢測(cè)位點(diǎn)越多，和實(shí)際越符合，閆雙勇等利

4、用水稻數(shù)據(jù)庫(kù)多態(tài)性，搜索了與水稻抽穗期候選基因有關(guān)的820個(gè)snps，分析了它們的多樣性24。王佳媛等以采自四川南部麻咪澤和美姑大風(fēng)頂2個(gè)自然保護(hù)區(qū)的29份野生凹葉木蘭為材料，運(yùn)用在pcr和測(cè)序基礎(chǔ)上的snps分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)凹葉木蘭的遺傳多樣性進(jìn)行了初步分析25。王文斌等利用2 846個(gè)高質(zhì)量的snps標(biāo)記，對(duì)31份玉米自交系材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析26。aslam等對(duì)32羽來(lái)自不同種群的火雞用549萬(wàn)個(gè)snps分析了不同種群火雞的遺傳多樣性27。也有將其他分子標(biāo)記和功能snp標(biāo)記結(jié)合進(jìn)行遺傳多樣性研究，van inghelandt等用8 244 個(gè)snps標(biāo)記和359個(gè)ssr標(biāo)記分別對(duì)1 5

5、37個(gè)玉米自交系進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)和多樣性分析，得到了基本一致的聚類結(jié)果28。陳蓉等利用110對(duì)srap引物和1對(duì)影響穿心蓮內(nèi)酯生物合成的關(guān)鍵限速酶cps內(nèi)部存在的1個(gè)snp位點(diǎn)對(duì)103份穿心蓮樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析29。上述這些結(jié)果一般都是基于測(cè)序得到的大量snp數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，不適合于普通實(shí)驗(yàn)室利用，本研究利用常規(guī)snps-pcr 技術(shù)，參考ssr標(biāo)記對(duì)相同供試材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，探索常規(guī)snps-pcr在生物遺傳多樣性分析中的應(yīng)用。1 材料與方法1.1 材料供試的112個(gè)水稻材料（表1）由陜西省水稻研究所提供。1.2 方法1.2.1 基因組提取及pcr 水稻基因組dna采用sds法提取，并采

6、用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)基因組dna的質(zhì)量。pcr反應(yīng)體系為：2×taq master mix 15 l，10 mol/l的正反引物各1 l，dna模板1 l，反應(yīng)總體積30 l，用ddh2o補(bǔ)足。反應(yīng)程序?yàn)椋?4.0 預(yù)變性5 min；94.0 變性50 s，x （視不同引物而定）退火50 s，72.0 延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72.0 延伸10 min，4 保存；8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離pcr產(chǎn)物，銀染法顯色拍照。1.2.2 引物設(shè)計(jì) 本研究所用的5個(gè)功能基因的snp標(biāo)記，包括4個(gè)抗稻瘟病基因位點(diǎn)和1個(gè)蠟質(zhì)基因位點(diǎn)（pigm、pi9、pita、pib和wx）。ssr

7、引物為國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心網(wǎng)站分子標(biāo)記中與育性恢復(fù)基因連鎖的11對(duì)rm*標(biāo)記30。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。1.2.3 數(shù)據(jù)處理 ssr標(biāo)記擴(kuò)增統(tǒng)計(jì)條帶時(shí)，電泳圖譜中每條擴(kuò)增帶代表引物的1對(duì)結(jié)合位點(diǎn)，且被視為有效的分子標(biāo)記。每對(duì)引物檢測(cè)到的每條多態(tài)性帶視為1個(gè)等位變異，將電泳圖譜中的條帶（包括弱帶）賦值為“1”，無(wú)帶時(shí)賦值為“0”，缺失時(shí)為“9”。 用3引物法對(duì)snp位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)位點(diǎn)有3種基因型，分別為野生型純合體、雜合體和突變型純合體。snp標(biāo)記擴(kuò)增統(tǒng)計(jì)條帶時(shí)，按基因型的等位位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，相同等位位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)為“1”，不同等位位點(diǎn)賦值為“0”，缺失時(shí)為“9”。利用ntsys-pc2.10e系統(tǒng)軟件中dice法計(jì)算遺傳相似系數(shù)，用upgma進(jìn)行聚類分析。2 結(jié)果與分析2.1 基于snp的聚類分析snp標(biāo)記分析的遺傳相似系數(shù)和聚類如圖1所示，在遺傳相似系數(shù)0.45處將112份供試材料聚為2大類群。第一類群包括黃52、52香占、r2152、紅410b等109個(gè)材料，第二類群只有成恢047、日本晴和揚(yáng)稻6號(hào)-1等3個(gè)材料。第一大類群在遺傳相似系數(shù)