集約化蔬菜種植區(qū)地下水中反硝化細(xì)菌的分離鑒定

1、集約化蔬菜種植區(qū)地下水中反硝化細(xì)菌的分離鑒定王琳1,2 ,李季2* ,宋效宗3 ,郭廷忠1 ,徐智21. 河南大學(xué)環(huán)境與健康工程研究中心，河南開封47500】；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京100094 ;3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所,山東濟(jì)南250100摘要：從研究我國典型集約化蔬菜種植區(qū)地下水中硝酸鹽的來源和濃度入手，進(jìn)行富集、培養(yǎng)、分離、純化，篩選出一株具 有反硝化作用的菌株，通過形態(tài)學(xué)、革蘭氏染色結(jié)合16s rdna序列同源性分析鑒定，其鑒定結(jié)果為農(nóng)桿菌(agrobacterium sp. 該研究為開展地下水硝酸鹽污染的生物修復(fù)儲備寶貴的菌種資源，為地下水中硝酸鹽污染的原位

2、微生物修復(fù)和相關(guān)污 水的生物處理提供微生物基礎(chǔ)，對于經(jīng)濟(jì)、有效的解決地下水硝酸鹽污染和水資源短缺的問題有著十分重要的意義。 關(guān)鍵詞：集約化蔬菜種植區(qū)；硝酸鹽；反硝化細(xì)菌；原位微生物修復(fù)中圖分類號：x87文獻(xiàn)標(biāo)識碼：a文章編號：1672-2175 ( 2008 ) 05-2078-04于無操作臺中，滅菌2() min后待用。大量的研究表明，農(nóng)業(yè)活動中化肥的投入與地 下水中硝酸鹽濃度具有相關(guān)性，是造成地下水硝酸 鹽污染的最顯著和最主要的原因，而且蔬菜生產(chǎn)中 的投入量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大田作物引。被譽(yù)為“中國蔬菜 之鄉(xiāng)”的山東省壽光市，近10年來單位播種面積化 肥和氮肥的施用水平原高于全國和山東省的平均 施用

3、水平，其中化肥為全國平均水平的2.32.4倍， 為山東省平均水平的1.72.4倍；氮肥則為全國平 均水平的1.92.5倍，為山東省平均水平的1.51.9 倍，表明早在9()年代初期壽光市的化肥和氮肥的 施用就已經(jīng)達(dá)到較高水平，且始終居高不下。近年來，國內(nèi)外已做過不少通過反硝化細(xì)菌去 除水體中硝酸鹽的研究&7】。反硝化細(xì)菌是原位生物 修復(fù)地下水硝酸鹽中起主要脫氮作用的微生物，其 種類在很大程度上決定著no.?的去除效果。因此， 獲得有效的反硝化細(xì)菌是確保地下水中硝酸鹽原 位微生物修復(fù)的關(guān)鍵。本研究擬對硝酸鹽污染嚴(yán)重的地下水中反硝 化細(xì)菌進(jìn)行富集、培養(yǎng)、篩選及鑒定，為將來開展 地下水硝酸鹽

4、污染的生物修復(fù)儲備寶貴的菌種資 源，為進(jìn)一步研究反硝化細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)及生態(tài)功能 和相關(guān)污水的生物處理提供微生物基礎(chǔ)，對于解決 我國日益嚴(yán)重的水污染和缺水的問題有著十分重 要的意義。1材料與方法1.1取樣點狀況取樣點為山東省壽光市古城街道辦后王村，定 點為36°57, 118°45t ,井深60 m。周圍種植作物 為大棚西紅柿，長期連作同種作物。1.2分離與純化1.2.1富集培養(yǎng)取井水水樣10() ml，接種于無菌反硝化細(xì)菌富 集培養(yǎng)液中，置于30 °c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)314 d ,培 養(yǎng)液變渾濁并產(chǎn)生氣泡，說明有反硝化細(xì)菌生長。 反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基：knos 2 g

5、,檸檬酸鈉5 g , k2hpo4 1 g , mgso4-7h2o 0.2 g , ph 7.2 ,蒸館水 loooml , 121 °c ,滅菌 20 min。1.2.2分離純化利用硅酸膠平板分離。在每個硅膠平板上加反 硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基2ml，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使培 養(yǎng)液分布均勻，打開皿蓋，置于50 °c烘箱內(nèi)，到 平板上無水流動為止。然后，打開皿蓋，將平板置將反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)液()ml涂布于烘烤 后的硅膠平板培養(yǎng)基上，置于3() °c培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至菌落生長良好，用滅菌后的牙簽挑取單菌落， 在2 ml液體富集培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。重復(fù)上述操作，直至獲得純菌

6、種。1.3菌種的鑒定對所篩選到的菌株進(jìn)行鑒定，通過觀察菌落形 態(tài)、顯微鏡下菌體形態(tài)觀察、革蘭氏染色、16s rdna擴(kuò)增以及dgge等分子生物學(xué)手段相結(jié)合的方法 進(jìn)行了菌株的鑒定等，依照微生物學(xué)細(xì)菌分類鑒定 實驗方法，對獲得的菌株進(jìn)行初步鑒定。1.3.1樣品準(zhǔn)備和細(xì)菌dna提取取分離純菌株的液體培養(yǎng)液于8 ml離心管中， 8 000 r/min ,4 °c，離心20 min，棄上清液，取沉淀， 加入 0.5 ml dna 提取緩沖液(im tris-hcl , ph 8.0 )備用。單菌株dna的提取采用benzyl chloride方 法。1.3.2 pcr 擴(kuò)增pcr擴(kuò)増采用am

7、plitaqgold 反應(yīng)系統(tǒng) (perkin elmer, applied biosystems , nj , usa ' 引物為357f和517r ,它們的序列分別為5，cctacgggaggcagcag-3',5'-attaccgcggctgctgg-3'。pcr的反應(yīng)程序：95 °c 10 min ；接下來是下 面的程序進(jìn)行25個循環(huán)，93 °c 1 min ,50 °c 1 min , 72 °c 1 min 30sec ,之后，93 °c 1 min , 50 °c 1 min , 72 &

8、#176;c 5 mino 反應(yīng)體系(50 pl ) ： 1 pl dntp ( 10 mmol/l x 5 pl loxpcr gold buffer. 4 pl mgcl2 (25 mmol/l 0.5 pl 357f ( 45 pmol/pl 0.5 pl 517r ( 45 pmol/pl , lpl 模板 dna ( 10 ng/pl ) 和0.5 pltaq酶(2 u/ml )，其余體積用無菌水補(bǔ)充。 pcr產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)純化后送 測序公司測序，所獲得的dna序列與blast程序 的數(shù)據(jù)庫序列比較，確定菌株的分類地位。1.3.3 dgge電泳及分析圖i votoi

9、-f的菌落特征fig. i colonies of bacteria strain votoi -f on plate medium采用 dcode 系統(tǒng)(bio-rad , laboratories , hercules , calif )對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用雙變性法進(jìn)行 dgge分析的。聚丙烯酰胺凝膠濃度為6%12% , 尿素變性梯度為20%55% (尿素為7 mol/l ,甲酰 胺為40%時的變性濃度為100% )，在61 °c恒溫下， 電壓為200 v時電泳5 h ,采用sybrgreen i (molecular probes , eugene , ore )染色 30 mi

10、n ,紫 外凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果川】。2結(jié)果與討論2.1反硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)將井水水樣接種到反硝化細(xì)菌液體富集培養(yǎng) 基中，培養(yǎng)314 d ,培養(yǎng)液變渾濁并產(chǎn)生氣泡，說 明有反硝化細(xì)菌生長。2.2所篩菌株votof的菌落特征和細(xì)胞形態(tài) 特征采用硅膠平板稀釋分離方法，分離到一株具有 反硝化作用的純菌株。voto1-f菌株在分離培養(yǎng)基圖2 voto1-f的個體形態(tài)特征fig. 2 individual morphology character of strain voto1-f平板上形成圓形、無色透明、邊緣整齊、表面光滑 濕潤的菌落(見圖1 )，革蘭氏染色為陰性，細(xì)胞呈 球桿狀，單個存在(見圖2 b

11、2.3 dgge 分析將反硝化細(xì)菌液體培養(yǎng)液收集后用苯法提bp120050()300200100m voto1-f取dna ,將提取的dna進(jìn)行2%瓊脂糖電泳，然 后進(jìn)行16s rdna v3區(qū)序列pcr擴(kuò)增，將pcr擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行dgge電泳 電泳圖譜如圖3從dgge 圖中可以檢測到只有一條帶。2.4菌種鑒定同一菌株的dna條帶在膠上的位置相同，而 不同菌株的dna的條帶位置不同，因此可以利用dgge方法對獲得的菌株進(jìn)行篩選。經(jīng)過平板分離純化和dgge篩選，確定獲得的菌株voto1-f是圖3 voto1f dgge圖譜fig. 3 dgge profile of v3 region of 1

12、6s rdna from voto1 f純菌種。通過16s rdna基因測序并與ncbi基因 數(shù)據(jù)庫中已有菌種的16s rdna序列進(jìn)行同源性分 析和相似性分析，在分子水平對voto1-f進(jìn)行系 統(tǒng)發(fā)育、種屬鑒定。在顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)如圖1 ,單個菌的 形狀主要為球桿狀。通過16s rdna基因序列并與騒點亮心燈數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較分析，比對結(jié)果如表1所示，根據(jù) 同源性檢索和相似性分析鑒定菌株voto1-f為農(nóng) 桿菌(agrobacterium sp.),登錄號為 ef554922o 近年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物、酵母菌、真菌、人體細(xì)胞等的基因轉(zhuǎn)化均取得了很大進(jìn)展，農(nóng)桿菌 質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前研究

13、最多、技術(shù)方法最成 熟的基因轉(zhuǎn)化途徑，l2-，41o對農(nóng)桿菌在降解污染物方表】v0t01-f菌株16s rdna序列與數(shù)據(jù)庫對比結(jié)果 tabic i strain v0t01-f of percent homology of sequences分離菌株近緣種相似率/%voto1-fagrobacterium sp. (ef554922)99.6%面的研究較少，主要集中在對4-氨基苯磺酸鈉的降 解以及作為c宀的吸附劑l5-,7wo目前，關(guān)于農(nóng)桿 菌具有反硝化作用的研究還未見報道。3結(jié)論成功地從集約化蔬菜種植區(qū)地下水中分離出 了反硝化細(xì)菌，不僅探索出了其分離、純化方法， 而且通過形態(tài)學(xué)、革蘭氏染色

14、結(jié)合16s rdna序列 同源性分析鑒定，鑒定結(jié)果為農(nóng)桿菌 (arobacterium卜關(guān)于農(nóng)桿菌的反硝化作用效果以及其它深入的研究還在進(jìn)行之中。本研究為了解硝酸鹽污染的地下水中脫氮微 生物的生態(tài)、為進(jìn)一步開展地下水中硝酸鹽污染的 原位微生物修復(fù)和相關(guān)污水的生物處理提供了寶 貴的菌種資源，對于經(jīng)濟(jì)、有效的解決地下水硝酸 鹽污染和水資源短缺的問題有著十分重要的意義。參考文獻(xiàn)：1| ju x t, kou c l, zhang f s, et al. nitrogen balance and ground- water nitrate contamination: comparison among

15、 three intensive cropping systems on the north china plainj. environmental pollution, 2006, 143: 117-125.|2| cemek m, akkaya l, b1rdane y o, et al. nitrate and nitrite in fruity and natural mineral waters marketed in western turkcyj. journal of food composition and analysis, 2(x)7, 20: 236-240.3 li

16、x hu c s, delgado j a. et al. increased nitrogen use efficiencies as a key mitigation alternative to reduce nitrate leaching in north china plainj agricultural water management, 2007, 89: 137-147.4 董章杭，李季.孫麗梅.集約化蔬菜種植區(qū)化肥施用對地下水硝酸 鹽污染影響的研究|j農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報.2005, 24(6): 1139-1144.dong zhanghang, li ji, sun lim

17、ei nitnhe contamination in the groundwater of intensive vegetable cultivation areas in shouguang city. shandong provice. china(j) journal of agro-environment science, 2(x)5, 24(6): 1139-1144|5 aslan s, cakici h. biological denitrification of drinking water in a slow sand filter!j. journal of hazardo

18、us materials, 2007, 148: 253-258.|6 rocca c d. belgiorno v. meric s. hctcrotrophic/autotrophic denitrification (had) of drinking water: prospective use for permeable reactive barrier!j |. desalination, 2007, 210: 194-204.17)張小玲，梁運祥.一株反硝化細(xì)菌的篩選及其反硝化特性的研究 |j|.淡水漁業(yè),2006, 36(5): 28-32.zhang xiaoling, lia

19、ng yunxiang screening of a strain denitrobacteria “nd its denitrification characteristic!j. freshwater fisheries, 2006, 36(5): 28-32.|8陳紹銘，鄭福壽.水生微生物學(xué)實驗法(上冊)m.北京：海洋出版 社，1985: 84- 86.chen shaoming< zheng fushou methods of hydrobiology experiment, part 1|m. beijing: ocean press, 1985: 82-85.|9 zhu h

20、, qu e zhu l h. isolation of genomic dnas from plants, fungi and bacteria using benzyl chlorideu. nucleic acids research, 1993,21:5278-5280.|10j haruta s, cui z, huang z, et al. construction of a stable microbial community with high ccllulosc-dcgradation ability!j |. applied microbiology and biotech

21、nology, 2(x)2, 59: 529-534111 pedro m s, haruta s. hazaka m. et al. official methods of analysis-15th cd m association of analytical chemists, arlington, virginia. usa, 1990. 7080.12 gelvin s b improving plant genetic engineering by manipulating lhe hostj. trends in bi (technology, 2003, 21: 95-98.(

22、13| de groot m j. agrobacterium tumefaciens-medita&l transformation of filamentous fungi(j). nature biotechnology, 199& 16: 839-842.14 gouka r j.transformation of aspergillus awamori by agrobacterium tumefaciens-mediated homologous recombination|j). nature biotech nology, 1999, 17: 598-601.1

23、51 feigal b, knackmuss h j. syntropic interactions during degradation of 4-aminobenzenesulfonic acid by a two species bacterial cul- turej. archives of microbiology, 1993, 15: 9124-9130.16 singh r mishra lc. pandey a, ivengar l. degradation of 4-aminobenzenesulfonate by alginate encapsulated cells o

24、f agrobacterium sp. pns-1j. bioresource technology, 2006, 97: 1655-1659.171 baytak s, turker a r. the use of agrobacterium tumcfacients immobilized on amberlite xad-4 as a new biosorbent lor the column prcconccntration of iron (111), cobalt (ii ), manganese (11) and chromium taianta, 2005, 65: 938-9

25、45gg點亮心燈nn i精誠凝聚二八二成就夢想isolation and identification of denitrifying bacteria from groundwater contami-nated with nitrate of a typical intensive vegetable cultivation areawang lin1,2 , li ji2* , song xiaozong3 , guo tingzhong 1 , xu zhi21. environmental and healthy engineering research center, henan university. henan kaifeng 475001, china ；2. college of resources and environment, china agricultural university. beijing 100094, china ；3. soil and fertil