集約化蔬菜種植區(qū)地下水中反硝化細(xì)菌的分離鑒定

1、集約化蔬菜種植區(qū)地下水中反硝化細(xì)菌的分離鑒定王琳1,2 ,李季2* ,宋效宗3 ,郭廷忠1 ,徐智21. 河南大學(xué)環(huán)境與健康工程研究中心，河南開(kāi)封47500】；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京100094 ;3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所,山東濟(jì)南250100摘要：從研究我國(guó)典型集約化蔬菜種植區(qū)地下水中硝酸鹽的來(lái)源和濃度入手，進(jìn)行富集、培養(yǎng)、分離、純化，篩選出一株具 有反硝化作用的菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)、革蘭氏染色結(jié)合16s rdna序列同源性分析鑒定，其鑒定結(jié)果為農(nóng)桿菌(agrobacterium sp. 該研究為開(kāi)展地下水硝酸鹽污染的生物修復(fù)儲(chǔ)備寶貴的菌種資源，為地下水中硝酸鹽污染的原位

2、微生物修復(fù)和相關(guān)污 水的生物處理提供微生物基礎(chǔ)，對(duì)于經(jīng)濟(jì)、有效的解決地下水硝酸鹽污染和水資源短缺的問(wèn)題有著十分重要的意義。 關(guān)鍵詞：集約化蔬菜種植區(qū)；硝酸鹽；反硝化細(xì)菌；原位微生物修復(fù)中圖分類(lèi)號(hào)：x87文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：a文章編號(hào)：1672-2175 ( 2008 ) 05-2078-04于無(wú)操作臺(tái)中，滅菌2() min后待用。大量的研究表明，農(nóng)業(yè)活動(dòng)中化肥的投入與地 下水中硝酸鹽濃度具有相關(guān)性，是造成地下水硝酸 鹽污染的最顯著和最主要的原因，而且蔬菜生產(chǎn)中 的投入量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大田作物引。被譽(yù)為“中國(guó)蔬菜 之鄉(xiāng)”的山東省壽光市，近10年來(lái)單位播種面積化 肥和氮肥的施用水平原高于全國(guó)和山東省的平均 施用

3、水平，其中化肥為全國(guó)平均水平的2.32.4倍， 為山東省平均水平的1.72.4倍；氮肥則為全國(guó)平 均水平的1.92.5倍，為山東省平均水平的1.51.9 倍，表明早在9()年代初期壽光市的化肥和氮肥的 施用就已經(jīng)達(dá)到較高水平，且始終居高不下。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已做過(guò)不少通過(guò)反硝化細(xì)菌去 除水體中硝酸鹽的研究&7】。反硝化細(xì)菌是原位生物 修復(fù)地下水硝酸鹽中起主要脫氮作用的微生物，其 種類(lèi)在很大程度上決定著no.?的去除效果。因此， 獲得有效的反硝化細(xì)菌是確保地下水中硝酸鹽原 位微生物修復(fù)的關(guān)鍵。本研究擬對(duì)硝酸鹽污染嚴(yán)重的地下水中反硝 化細(xì)菌進(jìn)行富集、培養(yǎng)、篩選及鑒定，為將來(lái)開(kāi)展 地下水硝酸鹽

4、污染的生物修復(fù)儲(chǔ)備寶貴的菌種資 源，為進(jìn)一步研究反硝化細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)及生態(tài)功能 和相關(guān)污水的生物處理提供微生物基礎(chǔ)，對(duì)于解決 我國(guó)日益嚴(yán)重的水污染和缺水的問(wèn)題有著十分重 要的意義。1材料與方法1.1取樣點(diǎn)狀況取樣點(diǎn)為山東省壽光市古城街道辦后王村，定 點(diǎn)為36°57, 118°45t ,井深60 m。周?chē)N植作物 為大棚西紅柿，長(zhǎng)期連作同種作物。1.2分離與純化1.2.1富集培養(yǎng)取井水水樣10() ml，接種于無(wú)菌反硝化細(xì)菌富 集培養(yǎng)液中，置于30 °c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)314 d ,培 養(yǎng)液變渾濁并產(chǎn)生氣泡，說(shuō)明有反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)。 反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基：knos 2 g

5、,檸檬酸鈉5 g , k2hpo4 1 g , mgso4-7h2o 0.2 g , ph 7.2 ,蒸館水 loooml , 121 °c ,滅菌 20 min。1.2.2分離純化利用硅酸膠平板分離。在每個(gè)硅膠平板上加反 硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基2ml，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培 養(yǎng)液分布均勻，打開(kāi)皿蓋，置于50 °c烘箱內(nèi)，到 平板上無(wú)水流動(dòng)為止。然后，打開(kāi)皿蓋，將平板置將反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)液()ml涂布于烘烤 后的硅膠平板培養(yǎng)基上，置于3() °c培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至菌落生長(zhǎng)良好，用滅菌后的牙簽挑取單菌落， 在2 ml液體富集培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。重復(fù)上述操作，直至獲得純菌

6、種。1.3菌種的鑒定對(duì)所篩選到的菌株進(jìn)行鑒定，通過(guò)觀察菌落形 態(tài)、顯微鏡下菌體形態(tài)觀察、革蘭氏染色、16s rdna擴(kuò)增以及dgge等分子生物學(xué)手段相結(jié)合的方法 進(jìn)行了菌株的鑒定等，依照微生物學(xué)細(xì)菌分類(lèi)鑒定 實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)獲得的菌株進(jìn)行初步鑒定。1.3.1樣品準(zhǔn)備和細(xì)菌dna提取取分離純菌株的液體培養(yǎng)液于8 ml離心管中， 8 000 r/min ,4 °c，離心20 min，棄上清液，取沉淀， 加入 0.5 ml dna 提取緩沖液(im tris-hcl , ph 8.0 )備用。單菌株dna的提取采用benzyl chloride方 法。1.3.2 pcr 擴(kuò)增pcr擴(kuò)増采用am

7、plitaqgold 反應(yīng)系統(tǒng) (perkin elmer, applied biosystems , nj , usa ' 引物為357f和517r ,它們的序列分別為5，cctacgggaggcagcag-3',5'-attaccgcggctgctgg-3'。pcr的反應(yīng)程序：95 °c 10 min ；接下來(lái)是下 面的程序進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，93 °c 1 min ,50 °c 1 min , 72 °c 1 min 30sec ,之后，93 °c 1 min , 50 °c 1 min , 72 &

8、#176;c 5 mino 反應(yīng)體系(50 pl ) ： 1 pl dntp ( 10 mmol/l x 5 pl loxpcr gold buffer. 4 pl mgcl2 (25 mmol/l 0.5 pl 357f ( 45 pmol/pl 0.5 pl 517r ( 45 pmol/pl , lpl 模板 dna ( 10 ng/pl ) 和0.5 pltaq酶(2 u/ml )，其余體積用無(wú)菌水補(bǔ)充。 pcr產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)純化后送 測(cè)序公司測(cè)序，所獲得的dna序列與blast程序 的數(shù)據(jù)庫(kù)序列比較，確定菌株的分類(lèi)地位。1.3.3 dgge電泳及分析圖i votoi

9、-f的菌落特征fig. i colonies of bacteria strain votoi -f on plate medium采用 dcode 系統(tǒng)(bio-rad , laboratories , hercules , calif )對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用雙變性法進(jìn)行 dgge分析的。聚丙烯酰胺凝膠濃度為6%12% , 尿素變性梯度為20%55% (尿素為7 mol/l ,甲酰 胺為40%時(shí)的變性濃度為100% )，在61 °c恒溫下， 電壓為200 v時(shí)電泳5 h ,采用sybrgreen i (molecular probes , eugene , ore )染色 30 mi

10、n ,紫 外凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果川】。2結(jié)果與討論2.1反硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)將井水水樣接種到反硝化細(xì)菌液體富集培養(yǎng) 基中，培養(yǎng)314 d ,培養(yǎng)液變渾濁并產(chǎn)生氣泡，說(shuō) 明有反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)。2.2所篩菌株votof的菌落特征和細(xì)胞形態(tài) 特征采用硅膠平板稀釋分離方法，分離到一株具有 反硝化作用的純菌株。voto1-f菌株在分離培養(yǎng)基圖2 voto1-f的個(gè)體形態(tài)特征fig. 2 individual morphology character of strain voto1-f平板上形成圓形、無(wú)色透明、邊緣整齊、表面光滑 濕潤(rùn)的菌落(見(jiàn)圖1 )，革蘭氏染色為陰性，細(xì)胞呈 球桿狀，單個(gè)存在(見(jiàn)圖2 b

11、2.3 dgge 分析將反硝化細(xì)菌液體培養(yǎng)液收集后用苯法提bp120050()300200100m voto1-f取dna ,將提取的dna進(jìn)行2%瓊脂糖電泳，然 后進(jìn)行16s rdna v3區(qū)序列pcr擴(kuò)增，將pcr擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行dgge電泳 電泳圖譜如圖3從dgge 圖中可以檢測(cè)到只有一條帶。2.4菌種鑒定同一菌株的dna條帶在膠上的位置相同，而 不同菌株的dna的條帶位置不同，因此可以利用dgge方法對(duì)獲得的菌株進(jìn)行篩選。經(jīng)過(guò)平板分離純化和dgge篩選，確定獲得的菌株voto1-f是圖3 voto1f dgge圖譜fig. 3 dgge profile of v3 region of 1

12、6s rdna from voto1 f純菌種。通過(guò)16s rdna基因測(cè)序并與ncbi基因 數(shù)據(jù)庫(kù)中已有菌種的16s rdna序列進(jìn)行同源性分 析和相似性分析，在分子水平對(duì)voto1-f進(jìn)行系 統(tǒng)發(fā)育、種屬鑒定。在顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)如圖1 ,單個(gè)菌的 形狀主要為球桿狀。通過(guò)16s rdna基因序列并與騒點(diǎn)亮心燈數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較分析，比對(duì)結(jié)果如表1所示，根據(jù) 同源性檢索和相似性分析鑒定菌株voto1-f為農(nóng) 桿菌(agrobacterium sp.),登錄號(hào)為 ef554922o 近年來(lái)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物、酵母菌、真菌、人體細(xì)胞等的基因轉(zhuǎn)化均取得了很大進(jìn)展，農(nóng)桿菌 質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前研究

13、最多、技術(shù)方法最成 熟的基因轉(zhuǎn)化途徑，l2-，41o對(duì)農(nóng)桿菌在降解污染物方表】v0t01-f菌株16s rdna序列與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比結(jié)果 tabic i strain v0t01-f of percent homology of sequences分離菌株近緣種相似率/%voto1-fagrobacterium sp. (ef554922)99.6%面的研究較少，主要集中在對(duì)4-氨基苯磺酸鈉的降 解以及作為c宀的吸附劑l5-,7wo目前，關(guān)于農(nóng)桿 菌具有反硝化作用的研究還未見(jiàn)報(bào)道。3結(jié)論成功地從集約化蔬菜種植區(qū)地下水中分離出 了反硝化細(xì)菌，不僅探索出了其分離、純化方法， 而且通過(guò)形態(tài)學(xué)、革蘭氏染色

14、結(jié)合16s rdna序列 同源性分析鑒定，鑒定結(jié)果為農(nóng)桿菌 (arobacterium卜關(guān)于農(nóng)桿菌的反硝化作用效果以及其它深入的研究還在進(jìn)行之中。本研究為了解硝酸鹽污染的地下水中脫氮微 生物的生態(tài)、為進(jìn)一步開(kāi)展地下水中硝酸鹽污染的 原位微生物修復(fù)和相關(guān)污水的生物處理提供了寶 貴的菌種資源，對(duì)于經(jīng)濟(jì)、有效的解決地下水硝酸 鹽污染和水資源短缺的問(wèn)題有著十分重要的意義。參考文獻(xiàn)：1| ju x t, kou c l, zhang f s, et al. nitrogen balance and ground- water nitrate contamination: comparison among

15、 three intensive cropping systems on the north china plainj. environmental pollution, 2006, 143: 117-125.|2| cemek m, akkaya l, b1rdane y o, et al. nitrate and nitrite in fruity and natural mineral waters marketed in western turkcyj. journal of food composition and analysis, 2(x)7, 20: 236-240.3 li

16、x hu c s, delgado j a. et al. increased nitrogen use efficiencies as a key mitigation alternative to reduce nitrate leaching in north china plainj agricultural water management, 2007, 89: 137-147.4 董章杭，李季.孫麗梅.集約化蔬菜種植區(qū)化肥施用對(duì)地下水硝酸 鹽污染影響的研究|j農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào).2005, 24(6): 1139-1144.dong zhanghang, li ji, sun lim

17、ei nitnhe contamination in the groundwater of intensive vegetable cultivation areas in shouguang city. shandong provice. china(j) journal of agro-environment science, 2(x)5, 24(6): 1139-1144|5 aslan s, cakici h. biological denitrification of drinking water in a slow sand filter!j. journal of hazardo

18、us materials, 2007, 148: 253-258.|6 rocca c d. belgiorno v. meric s. hctcrotrophic/autotrophic denitrification (had) of drinking water: prospective use for permeable reactive barrier!j |. desalination, 2007, 210: 194-204.17)張小玲，梁運(yùn)祥.一株反硝化細(xì)菌的篩選及其反硝化特性的研究 |j|.淡水漁業(yè),2006, 36(5): 28-32.zhang xiaoling, lia

19、ng yunxiang screening of a strain denitrobacteria “nd its denitrification characteristic!j. freshwater fisheries, 2006, 36(5): 28-32.|8陳紹銘，鄭福壽.水生微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)法(上冊(cè))m.北京：海洋出版 社，1985: 84- 86.chen shaoming< zheng fushou methods of hydrobiology experiment, part 1|m. beijing: ocean press, 1985: 82-85.|9 zhu h

20、, qu e zhu l h. isolation of genomic dnas from plants, fungi and bacteria using benzyl chlorideu. nucleic acids research, 1993,21:5278-5280.|10j haruta s, cui z, huang z, et al. construction of a stable microbial community with high ccllulosc-dcgradation ability!j |. applied microbiology and biotech

21、nology, 2(x)2, 59: 529-534111 pedro m s, haruta s. hazaka m. et al. official methods of analysis-15th cd m association of analytical chemists, arlington, virginia. usa, 1990. 7080.12 gelvin s b improving plant genetic engineering by manipulating lhe hostj. trends in bi (technology, 2003, 21: 95-98.(

22、13| de groot m j. agrobacterium tumefaciens-medita&l transformation of filamentous fungi(j). nature biotechnology, 199& 16: 839-842.14 gouka r j.transformation of aspergillus awamori by agrobacterium tumefaciens-mediated homologous recombination|j). nature biotech nology, 1999, 17: 598-601.1

23、51 feigal b, knackmuss h j. syntropic interactions during degradation of 4-aminobenzenesulfonic acid by a two species bacterial cul- turej. archives of microbiology, 1993, 15: 9124-9130.16 singh r mishra lc. pandey a, ivengar l. degradation of 4-aminobenzenesulfonate by alginate encapsulated cells o

24、f agrobacterium sp. pns-1j. bioresource technology, 2006, 97: 1655-1659.171 baytak s, turker a r. the use of agrobacterium tumcfacients immobilized on amberlite xad-4 as a new biosorbent lor the column prcconccntration of iron (111), cobalt (ii ), manganese (11) and chromium taianta, 2005, 65: 938-9

25、45gg點(diǎn)亮心燈nn i精誠(chéng)凝聚二八二成就夢(mèng)想isolation and identification of denitrifying bacteria from groundwater contami-nated with nitrate of a typical intensive vegetable cultivation areawang lin1,2 , li ji2* , song xiaozong3 , guo tingzhong 1 , xu zhi21. environmental and healthy engineering research center, henan university. henan kaifeng 475001, china ；2. college of resources and environment, china agricultural university. beijing 100094, china ；3. soil and fertil