青枯雷爾氏菌TN5轉(zhuǎn)座子無(wú)致病力突變株插入位點(diǎn)的鑒定與分析

1、帶格式的：字體:arial narrow, 小三帶格式的：居中帶格式的帶格式的（帶格式的m（帶格式的:£帶格式的f帶格式的j帶格式的：頂端：2.5網(wǎng)米，底 端：2.5厘米帶格生的ctl帶格多的匚二帶格式的： 字體：arial narrow帶格式的廠identification and analysis of tn5 transdosontransposed. insert smsites in avirulent mutants of ralstonia solanacearum che jiarvmeii, ma guimei2, liu bqzhu yuiingi,zheng x

2、uefanq!, tang jiarvvant丄(1. agricultural bioresource research institute, fujian academy of agricultural sciences, fujian fuzhou, 350003,=chinq； 2. kev laboratory of biopesticide and chemical biology fuiian agriculture and forest” university fuzhou350002, china)丄abstract： mulanis of rais伽ia sokmacwru

3、m strain fjap91 using tn5 iransposon mulagenesis were gol in (his daper, which were named fjatt582 and fjatt583 j?a/s伽bacterial will to obtain avielent nu4an&#sinqeztn5 并ansposon random insert rsobn/ebivm andfese審chinthe insert sites and ggigrv円o申holog米o(hù)口he4wosgb*viealeajffurtaftfscolony morphol

4、ogy and attenuation indexes showed that both of the mutants fjatt582 and fjatt583 were avirule" strains. and attenuation indexes of these 2 strains were over 0.8. a 681 bp fragment of the ranamycin resistance genq was amplified from the genome dna of the mutant strains jhe insertion sites of th

5、ese 2 avirulent mutants werq jocated 譏 4|tesulteihat-tfansposor-irseftiftputative diguanylate phosphodiesterase gene and type jll. effector protein gene, respectively-. it was suggested that mutations of ahese ihese 2 genes廠nurtatien- would affect the pathogenicity of the r solanacearum strainsjead

6、to sto佛 a曲enita護(hù)的洋伽間巒ifulen好ealthqkey wod、ralstonia solanacearunivirulent mutentmutanl 曲enuation attenuation index般式的：字體：aria. narrow,帶格迭的i帶格丟的：居中帶格式的：字體:arial narrow, 四號(hào)帶格式的帶格式的：字體：（國(guó)際）arial narrow帶格式的：屈中帶格式的，帶格式的帶格式的 匚二青枯雷爾氏菌是引起植物細(xì)菌性枯萎病的病原菌，廣泛分布丁熱帶、亞熱帶和溫帶，其寄主范i帶格式的：字體：arial macow堆金項(xiàng)ii： “h 農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技

7、汁劃課題（no.2012aa101504）,國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)丨|（ no. s20110410006）和福建省財(cái)政”項(xiàng)福建 省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)加金（nostlfy03）作者簡(jiǎn)介：乍加（1977），女，山東省乳山帀人，副研究閔，叫:，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)與生物防治°tch059187882571：em“ihchcim2002163 com。拿通訊作者：劉波1957）.男.福建省惠安具人，研究員，博上，研究方向?yàn)槲⒐の镒∥锛夹g(shù)與農(nóng)業(yè)生物藥物。ibh emaihiubofaas ：彎式的：行距:多倍行距l(xiāng)25i域代碼豆更改帶格式的：術(shù)萄牙語(yǔ)（巴西）青枯雷爾氏

8、菌卩5,轉(zhuǎn)座子無(wú)致病力突變株插入位點(diǎn)的鑒定與分析車建美i ,馬桂美2 ,劉波，朱育菁1 ,鄭雪芳i ,唐建陽(yáng)丨（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建福州，350003 ; 2.福建農(nóng)林大學(xué)生a物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州350002 ）摘 爰：丄青枯雷爾氏閥（ra/s紬浴soaacea加傀是植物細(xì)胡性青枯病的病原胡，刑丿ij ez-tn5苗入強(qiáng)致病 力青枯雷爾氏菌fjat-91，獲得究變株.fjat-t582,和.fjat-t583緲究且小5專座了隨機(jī)插入晉牯雷爾氏 菌（fjat9.）,從而獲得無(wú)致病力菌株,.°菌落形態(tài)觀察及弱化指數(shù)測(cè)定結(jié)果農(nóng)明，.突變株.fja

9、tt582 決.fjatt583,表現(xiàn)為典型的無(wú)致病力繭落形態(tài)，冃芻化指數(shù)均在0.8 .以i;。.刑用卡那特素抗性叢i大肘 異性引物從突變菌株fjatt582,和fjatt583川均擴(kuò)增出片段大小為681 bp,的條帶，而野型菌株 fjat9,木擴(kuò)增出任何條帶，說明tn5.轉(zhuǎn)座了工插入其基因組中屮冊(cè)究g抹無(wú)致病山轄株的:對(duì).這.2林 無(wú)致病力突變株進(jìn)行反向,pcr測(cè)序和序列比對(duì)，分析鑒尢出的入位占及茵落形態(tài)觀察結(jié)果農(nóng)唄， 轉(zhuǎn)座了分別插人插入位點(diǎn)了i編碼putative diguanylate phosphodiesterase基因和川型效應(yīng)蛋h基兩中，推 測(cè)瑾込,2個(gè).基因的突變致使強(qiáng)致病力菌

10、株表現(xiàn)出無(wú)致病力特征。 關(guān)鍵詞：青枯雷爾氏菌，無(wú)致病力突變株，弱化指奴帶格式的圍相當(dāng)廣辺妝特別是對(duì)茄科植物的危害史大。番茄青枯病在我國(guó)臺(tái)灣及長(zhǎng)江流域均跆發(fā)避1,通 常情況下，由青枯雷爾氏菌引起的番茄青枯病一般在,20-30%,嚴(yán)重時(shí)可引起,80%植株的死亡，甚至 絕收墜h前對(duì)青枯病的防治手段二般有藥劑防治、嫁接、生物防治等措施。藥劑防治見效快，效果 好，但易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留及抗藥性等問題理。嫁接對(duì)疾病的控制起到積極的作川，但操作方 法復(fù)雜。生物防治具有是無(wú)毒、安全、無(wú)公害等優(yōu)點(diǎn)，符合綠色農(nóng)業(yè)的要求，因此越來越多的人將 11光轉(zhuǎn)移到生物防治一i理。般普遍的生物防治的方法是利用生防菌對(duì)青枯病

11、進(jìn)行防治，如利用易培 養(yǎng)、有抗菌活性的蠟狀芽胞桿菌進(jìn)行青枯雷爾氏菌的防治尸雲(yún)也有報(bào)道利川無(wú)致病力菌株對(duì)青枯病 進(jìn)行防治，弱無(wú)致病力菌株與醪病力菌株間存在干擾現(xiàn)裂治。弱么湫病力的菌株不僅可以抑制致病菌的生長(zhǎng),還可以誘導(dǎo)植物的抗性駝讐因此無(wú)致病力青 枯雷爾氏菌對(duì)致病力藺株的在青枯病的.防治i為廣泛的應(yīng)用的潛力。帶格式的本實(shí)驗(yàn)室在前期研究屮利用ez-tn5入從番茄植株上分離得到的強(qiáng)致病力青枯雷爾氏菌fjat-91?構(gòu)建工青枯雷爾氏菌突變體庫(kù),共保存了004,株青枯雷爾氏菌突變株,獲得了多株無(wú)致病/ 力青枯雷爾氏菌苗落形態(tài)的突變株，前期研究對(duì)具小戸,株無(wú)致病力青枯雷爾氏菌遴存插入位點(diǎn)皚 舲分析,經(jīng)反向

12、.pcr,測(cè)序和序列比對(duì)，分析鑒定山這,5 ,株青枯雷爾氏菌突變株的插入位點(diǎn)分別位 于phca*因和腫cs岸因上理 但其它無(wú)致病力突變株的插入、是否還它致病性相關(guān)的插入位點(diǎn)還冇待于進(jìn)-步深入研究。冷研究的舁的昱通過檢測(cè)無(wú)致病力.責(zé)枯雷爾氏菌晁致病書突變株的插入位點(diǎn),分析其與菌株致 病和關(guān)性，從而為研制植物療枯病疫苗茁劑提供遺傳穩(wěn)定且基因突變位點(diǎn)明確的無(wú)理邊青枯宙爾 氏菌無(wú)谿曲菌株捉供依據(jù)）同時(shí)，也為番茄青枯病的生物防治奠定基礎(chǔ)。帶格式的帶格式的帶格式的j材料與方迭一j.1，菌株來源，一淸枯雷爾氏菌fjat-1582. fjat4583菌株來源于青枯雷爾氏菌fjat-91她,e§tn5

13、齡朋無(wú)插入突變 體庫(kù)。i帶格式的帶格式的j.2 .試劑與儀器，一（1）試劑與培養(yǎng)基：ttc培養(yǎng)基：每升含匍萄糖5g,蛋白blog,水解酪蛋白1 q, 瓊脂17g,每200 ml培養(yǎng)基中加入1 ml 1%ttc, ph7.0-7.2： spa培養(yǎng)基:每升含蔗糖20 g,蛋白腺5 q, k也po衛(wèi).5 / q, ,mgso025q, ph7.0-7.2； 0ntp購(gòu)鬥英駿生物技術(shù)有限公司：taq解購(gòu)h北京天根生化科技有限公 司；卡那霉素抗性基因的引物 kna£：rggtgcgacaatctatcga-3：和,kna&,5'-ctcatcgagcatcaaatg-3：； 青

14、枯雷爾氏菌突變株側(cè)翼序列擴(kuò)增引物fp-： p申cctacaacaaagctccataacq3 ”p1 ,5'£caatgtaacatcagagatntgaq3也上海博尚生物技術(shù)冇限公司合成。帶格式的（2）儀器:美國(guó)biometra梯度pcr儀；德國(guó)bio-rad電泳儀：淡國(guó)jvp凝膠成像儀；德國(guó)leica m165 fc體視顯微鏡。帶格式的帶格式的帶格式的j.3，試驗(yàn)方法，”1.3.1,枯雷爾氏菌，菌落形態(tài)觀察，無(wú)-80 °c,冰箱屮取出c經(jīng)構(gòu)建的突變體.菌株,在jtc （含有.50|jg/ml,卡那霉索）平板上劃線。再 丁*0 °cjh溫培并:箱屮培笄尹

15、占廠挑取單菌落轉(zhuǎn)接到上?0 ml spa液體培養(yǎng)基中（含有rug/ml卡那/ 霉素），30 q j70 r/min振蕩培養(yǎng)4-16 ho將過夜培養(yǎng)物稀釋到嚴(yán)稀稔涂布jtc,平板（含冇,50 pg/ml 卡那霉素），g-t30 °c;恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h加進(jìn)行菌落形態(tài)觀察。/1帶格式的帶格式的1.3.2清枯雷爾氏菌，弱化指數(shù)的測(cè)定一，對(duì)的涂巒板獲得的涓枯雷爾氏閩單菌落進(jìn)行弱化指數(shù)！測(cè)迄 忑體視顯微鏡下分別測(cè)量菌落 的白邊直徑和紅邊直徑，計(jì)算弱化指數(shù)耳。°/弱化指數(shù)=瓷鸞a白應(yīng)直徑j(luò).3.3，青枯雷爾氏菌突變拯的鑒定附轉(zhuǎn)座手滿入序列及其側(cè)翼序列的;rgr護(hù)堰,3）卡那抗性基

16、周的擴(kuò)堰 _ 參照promega試劑缺作方迭提取野牛型菌株和突變菌桂-基因組總 dna?？呛乃骱叫曰驍U(kuò)增25plpcr,反應(yīng)體系巴包範(fàn):2.5 pl wxbuffer, 0.5 pljo mmotldntp j pl 10 pm mol/lknafu knari物,0.3 pl2.5 utaq側(cè),j pl25ng,模板pn&°擴(kuò)增程序:預(yù)謎 3 min； 然后進(jìn)入他030 q,他030 q,化。cj miq,共,35個(gè)循環(huán)；最后涎伸jo min,。采用衛(wèi)創(chuàng)瓊脂糖 凝膠電泳檢測(cè),pcr產(chǎn)物，上樣量為,6叫，電壓為j0qx電泳時(shí)問,50miq,用,uvpj疑膠成像儀拍攝。 .

17、1.3.4青枯雷爾氏菌突變株插入序列及其側(cè)翼序列擴(kuò)增., 限制性內(nèi)切睥插入位點(diǎn)的側(cè)與序列擴(kuò)罐一pst 聖切反應(yīng)體系為忽叭 共中包括：joxbuffer q2叫,dnajm版叫,ps（lj叫。捋上述溶劑加入,pcr管中丁,脛混勻,07jc遍育80jcjm 育,20 min,終止酶反應(yīng)°,25pl能"4連接酶連接體系包括，：酶切后dnioyl, ,t4,連接酶,2.5叫,j0xt4 buffepm于？三七溫育jh后t6丫（溫育jo min到昶翠育總尹時(shí)，終止酶反図 采用，反向 引物進(jìn)行反向,pcr擴(kuò)增,25 plpcr反應(yīng)休系x： 2.5 pl wxbuffer, 0.5 pl

18、jo mmoldntps.j pl 10 pm mol/l fp-1和,rp-2$|物，,0.3 pl 2.5 u taq腳,dn/： j% 擴(kuò)增程彫為，:他。q,預(yù)變性,3miq；然后施入現(xiàn);q ,30 q, ,5lq30q,建兀規(guī)q, 共個(gè)循環(huán)；最后72；c伸omiq。采用齡瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) ,pcr,產(chǎn)物，上樣量那山 電壓為jo（1x，電泳時(shí)間50出;uvp,凝膠成像儀扌ii攝。j 34-5.側(cè)翼序列測(cè)定及比對(duì),分析，不同致病性青枯雷爾氏菌，插入位點(diǎn)側(cè)翼序列,pcr剖瀘增結(jié)果進(jìn)行ja,克降測(cè)序，由上海博尚 生物技術(shù)佇限公司完成。利用,ncbi,數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)插入位?；驕y(cè)序結(jié)果比對(duì)分 析。2

19、，結(jié)果與分析：2.1，青枯雷爾氏菌黑變菌株與聞生型歯桃菌落形態(tài)比找育枯雷爾氏菌野生型菌株fjat-91 勺突變菌株fjat-t582j1ifjat-t583落形態(tài)如圖所示。從菌 落形態(tài)上可以看出野生型菌株fjat-91為原始斛z菌落表面較濕sk，月流動(dòng)性強(qiáng),菌落中間為粉 紅色，門邊較寬,，為典型的強(qiáng)致病力青枯雷爾氏甌琵突變株,fjat-t582,和,fjat-t583出菌落表面較干 燥,無(wú)流動(dòng)性，屮間為暗紅色，并且白邊較窄.，為典型的無(wú)致病力青枯雷爾氏蝕°帶格式的 二2帶格式的帶格式的帶格式的：縮進(jìn)：許行縮進(jìn)：0字 :符，定義網(wǎng)格后不調(diào)整右縮進(jìn) 帶格式的三帶格式的匸二帶格式的匸=|f

20、jatt582fjat4583fjat-91，圖青枯雷爾氏菌笑變菌株?duì)幧途鷻z的畫落彤態(tài)fig.1 colony morpholoa比of the wild woealssnia solancearum strain and itsfvieulent mutants片帶格式的:字體:arial narrow, .字體顏色：紅色帶格式的一.帶格式的2?，青枯雷爾氏菌黑變菌株與宵生型菌株弱化指數(shù)差尾為了進(jìn)二步分析疔枯宙爾氏菌突變菌株與野生型菌株致病性的差并，采用體視顯微銳進(jìn)行了不 同菌株弱化指數(shù)的測(cè)遼（圖丸。從表h中可以看出，不同菌株皚弱化指數(shù)也發(fā)寵了明顯的發(fā)化，涓帶格式的枯雷爾氏直突變株fjat

21、-t582ifjat-t583/i<j弱化指數(shù)均在,0.8&以上，分別為0.8611 p.84,均人于野生帶格式的醴菌株的弱化指數(shù)a0.65, 推測(cè)冋能曲于jn5,的插人引起戦基因功能改變，如冊(cè)除盼物質(zhì)的 / 泌董迄，導(dǎo)致致病性發(fā)生改瓷。50 0(.25 76亦e21 952md1fjat45835 00 mm4 257mm周2 樣視顯微鏡平青枯雷爾氏菌突變菌株與野生型畫籾弱化指數(shù)的差異測(cè)定帶格式的determinatio n of attenuation indexes of the wild tvoe ralstonia solancearum strain and its

22、avieulent mutant帶格式的，表淸枯雷爾氏菌來變菌株與営生型逋抵弱化指數(shù)的比較帶格式的(.)fjat-t582fjat-91i帶格式的：字體:arial narrow2.612mm:字體:arial narrow菌株編號(hào)哲邊直徑白邊直徑弱化指數(shù)(strain number)直(diameter of red edqe) x(diameter of white edqe) x 二二一 t(attenuation indexes)直fjat 迪 8223.3 翌.9527.1.80厲阻）.01fjat 謔 8314.1.65j6jq+p-48p.tp.oi'fjat-00912

23、7鉀0£27±pm0 觀).02(table 1 8mdarisor)of attenuation indexes of the wild type ralstonia solancearum strain and its avieulent mutants帶格式的:字體：arial marrow帶格式表格帶格式的：字體：arial narrow 帶格式的：字體：arial narrow2.q，青枯雷爾氏菌突變菌株插入側(cè)舅序列的擴(kuò)增的鑒定.w別丿u卡那霉素抗性基因特異性引物對(duì)青枯雷爾氏菌野生型菌株和突變菌悔進(jìn)行,pcr擴(kuò)増，結(jié)果表明，從突變菌株,fjat-t582和,fja

24、t-t583中丄垃擴(kuò)増加段人小為,681 bp,的條帶，而野生型菌株fjat-91未擴(kuò)增出任何條帶，說明tn5轉(zhuǎn)座了已經(jīng)插入其基因組中.（圖w24青枯雷爾氏菌突變菌株插入側(cè)翼序列的擴(kuò)增.粋變菌株fjat-t582/iifjat-t583j基因組,dna。采用尸sil進(jìn)行iw切，經(jīng)j4,連接酶連接，利用反 向fcr幼物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果如圖,6丙示，從突變菌株fjat-t582/'增得到約,200 bp的片段，從 fjat-t583/ ifi得到約,300 bp的片段，由此可以證明，在青枯雷爾氏菌突變菌株fjat-t582jh fjat-t583 中均存在jn5ifi入序列。厶|t582

25、 t583 91 mt582 t583 m3000 bp3000 bp（帶格式的： 字體：ariol narrow 帶格式的：字體：.arial narrowi帶格式的：字體：arial narrowi帶格式的：字體：arial marrow ® i帶格式的_帶格式的 般g帶格式的 聊磴帶格式的 獗帶格式的 g朋我格式的帶格式的_冊(cè)qi帶格式的帶格式的一0*,'帶格式的1000 bp1(x)0 bp帶格式的帶格式的：字體：加粧（國(guó)際） arial narrow50() bp50() bp陳格式的:縮進(jìn):首行縮進(jìn)字 j帶格式的帶格式的帶格式的 帶格式的 周a清枯雷爾氏菌突變菌株

26、與，野生型園株豐那基因檢測(cè) 周£，青枯雷爾氏菌黑變菌株尸sfl禹切，圖譜（m：分子 帶格式的query42sb jet1538407query102sbjcr1538347query162sbjct1538287tcggcctcttcgcgctgcagg 182llllllllllllllllllllltcggcctcttcgcgctgcagg 1538267tgggcatccgacagattcactgcggcgtgcaggtccggttggcgggccgtgccggcacgctgggcatccgacagattcactgcggcgtgcaggtccggttggcgggccgtgccg

27、gcacgc圖a，青枯雷爾氏菌突變菌株fjat-t582插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的blast結(jié)果fig.6 blast result of the flank of insertion of avirulent mutant fjatt58410115383481611s38288gcaatgtaacatcagagattttgagacacaattcatcgatgatggttgagatgtgtataagagacaggcttgccagtcaggtcatgcto gaccagcaggcgccggaacttcagcagcgtggtcgcgtccggcacgttctcgaccgccagatcaatgccggcg

28、aacgcacgcatcg ccatgctgtcgtacaacgcatcttccagtccttcgtccgacagcccgtaccactgctgcaagaaataaatgcgcagcatcctctgcag gtcgactctagaggatccccgccacggttgatgagagctttgttgtaggt帶格式的帶格式的：字體:arial narrow帶格式農(nóng)格 帶格式的鑒定zm：分子雖標(biāo)準(zhǔn)？00皿5 2°°帥以、jsooj) j20.星標(biāo)準(zhǔn)poooj)f>.j500j) j20> jopopooj)jopox foqj)5 oqj) 7ooj) foqj)$

29、凱啦：400) ooj) 7ooj) ooj) ooj) 少觀 p0 ooj)3呱 mm jow/fiq.3 identification of the wild tvoe ralstonia solancearum strain fig.4 fs【idjpn enzyme mapdiriqwithf s i jf the wild tge and its avieulent mutants (m: marker, 3000 bp、2000 bp、1500 bp、 ralstonia solanceaivm strain and its avieulent mutantsl(m: marker

30、, 1200 bp、1000 bd、900 bd、800 bd、700 bd、600bs 500bp、 3000 bq、2000bp,、1500 bp,、1200 bd、1000 bp、900bp、800400 bd、300 bx 200 bp、100 bd、bp、700 bp、600 bp、500 bp、400 bx 300 bp、200 bo、100 bp i2.青枯雷爾氏菌黑變菌株插入側(cè)翼序列的分機(jī);1色反向fcr礦增的青枯雷爾氏菌突變菌株插入側(cè)滅序列進(jìn)行ja克隆測(cè)序并在"cbl數(shù)據(jù)庫(kù)小進(jìn) 行比對(duì)（圖,5®。結(jié)果農(nóng)明，突變株fjat-t582jfti入位點(diǎn)的側(cè)翼序歹i

31、位無(wú)青枯雷爾氏菌gmi1000大質(zhì) 粒匕，但未表明其基因功能。進(jìn)一步將該基因與青枯雷爾氏菌gmi1000的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，比 對(duì)結(jié)果為t衣明,該慕因t主要.用斗編碼putative diguanylate phosphodiesterase丄轉(zhuǎn)座了在該基因的1538406 bd處插入（圖6兒。淡變株fjat-t583/ffi入位點(diǎn)的側(cè)翼序列位于青枯雷爾氏菌的ype iii effector protein 基因上，轉(zhuǎn)座了在type iii effector protein2074 bp處插、（圖8）。因而推測(cè),，青枯雷爾氏菌的 大質(zhì)粒上 putative diguanylate phosp

32、hodiesterase 和 jtype 111 effector protein可能打其致病力相關(guān)，一旦這些 族因受到外源基因的干擾，可能會(huì)影響致病相關(guān)物質(zhì)劇的衣達(dá)攻分泌,從而表現(xiàn)，出無(wú)致病力的篩 gcaatgtaacatcagagattttgagacacaattcatcgatgatggttgagatgtgtataagagacaggcaccgcgtggcgcgcggcaa* tgtcgcgtaccacctcgctcagctgcgggtcgagcagttgggcatccgacagattcactgcggcgtgcaggtccggttggcgggcc gtgccggcacgctcggcctcttc

33、gcgctgcaggtcgactctagaggatccccgccacggttgatgagagctttgttgtaggt圖q清枯雷爾氏菌突變菌株fjat-t582插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列 亙 下劃線部分為引物序列:陰影部分為me序列)f ig.q $quence of the flank of insertion of avirulent mutantf jatt58?f equence olunderlinqis primeqand sequence of gray shadow istn5 transdosase recoqnition seauence/me). me=mosaic end. 5

34、：人gatgtgtataagagacag3'.注，下劃勢(shì)分為引物序列，>廠 qnfcal6460531! e3 ralstonia solanacearum gmi100d xegaplasand complete sequence length=2094509features in this part of subject sequence:probab2e signal 二三aasduunoxieal-qqdef domannsscore =261 bits (141), expect = le-66identities = 141/141 (100%)r gaps = 0/

35、141 (0%) strand=plus/minustn5 transposase recognition sequence (me). me二mosaic end. 5 agatgtgtataagagacag3；井. 下廿緒軀令泊引物岸不ila廠 11 slsonxa aolanace&rwn rxpc7for cype xxx effector prorexn,uocapl“ cdsl«enghw4815scexe 363 bxs (196), ebcpect 4e-97id«nciie0 « 199/200 (»»%># g

36、ep * 1/200 (1%) 3xaadoplud/hxnuaque"acaggcttgccaotcagotcatgctcgaccagcagocgccggaacttcagcagcgtootc98sbjut2070aca-gcttoccagtcaggtcatgctcgxccagcaggcgccgoaxcttcagcagcgtogtc2012qixxy158sbj"2011gcgtccggcjicgttctcgaccgccjigatcaatgccggcgaacgcacocatcgccatgcto1952(xxry159tcgtacjukcgcatcttccagtccttcgt

37、ccgacaocccotaccactgctgcaagaaataa218sbjc1951tcgtacaacgcatcttccagtccttcgtccgxcagcccgtacckctgctgcaagaaxtaa1892qi>ery219atocgcagcatcctctgcag 23618913討論帶格式的帶格式的：字體:arial narrow貝帶格靈的一(帶格式的t7t冰帶格式的f帶格式的,帶格式的atgcgcagcatcctctgcao 1872圖艮 清枯雷爾氏菌突變菌株fjatt邂揷入位點(diǎn)側(cè)翼序列的blast結(jié)果 f®.8 blast result of the flank

38、of insertion of avirulent mutant fjatt583帶格式的：字體：.arial narrow帶格式的青枯雷爾氏菌尚落形態(tài)我現(xiàn)出種的多態(tài)性，種的分類方法也呈現(xiàn)多樣性，如不同的生理小種巴、帶格式的生化卿叫、血斜脂肪酸魏啤和致病型警1 等。致病性檢測(cè)將青枯宙爾氏菌分為強(qiáng)致病/ 力菌株和，無(wú)致病力菌株期？類。|就，青枯雷爾氏菌菌株致病力檢測(cè)的二般方法為l依據(jù)青枯雷爾 氏菌侵入植株后，觀察植株的發(fā)病情況，并參照病害嚴(yán)重度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)門世行分類叫該方法的缺 點(diǎn)是復(fù)雜費(fèi)本實(shí)驗(yàn)室建立了二和噺的分類致病性檢測(cè)方法,即弱化指數(shù)溝咚 翁化指數(shù)與青枯 雷爾氏菌的致病性存在特定的相關(guān)性，弱

39、化指數(shù)0.60時(shí)，菌株冋接發(fā)病率為100%,弱化指數(shù)0.80, 菌株回接發(fā)病率為啤。利用弱化指數(shù)對(duì)青枯雷爾氏菌的強(qiáng)弱致病力進(jìn)行分類，方法簡(jiǎn)單方便,易 操作°通過弱化指數(shù)的測(cè)運(yùn)，結(jié)合菌落形態(tài)觀察，可以確足依據(jù)弱化拒數(shù)法對(duì)首枯需爾氏苗突變體 副心磁砂網(wǎng)砌曲扮類l青枯雷爾氏菌fjat4582和fjat-t583 緲無(wú)致病力菌株。，無(wú)致病力菌株右淸枯病的牛物防治屮起君乖耍作用，兒獲得途徑多樣,較直接的方法就足分離 白發(fā)突變株h黑,j耳工作疑較大，而fl較肓目。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們選擇使用基因工程，氐獲得 無(wú)致病力菌桃,如利用愆km interposon插入hrp因獲得/)咗突變體以及利川

40、pm075:tn5轉(zhuǎn)座/插入 fop。基因獲得胞外蛋門輸出功能喪失的突變株等7$理。木實(shí)驗(yàn)室采用tn5轉(zhuǎn)座子插入的方法構(gòu)建工 青枯雷爾氏菌突變體咋，tn5,轉(zhuǎn)座子插入只令隨機(jī)性，突變株較易獲得，并且突變株具佇較高的遺傳 穩(wěn)定性徑 訝枯雷爾氏曲突變體fjatm582和fjat-t583即卻礙隨機(jī)播入構(gòu)建的無(wú)致病力菌株。根據(jù)青枯雷爾氏菌插入基因的ncbi比對(duì)發(fā)現(xiàn)，fjat-t582的插入?yún)惨驗(yàn)榛芸堇自醣と丝?82 禺卡utaliveaguaaytet&phosphgdiestefase+mrjtative diguanylate phosphodiesterase,該剛是 eal 信號(hào)

41、轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域。eal在細(xì)菌中普遍存在陶獨(dú)電，用于環(huán)狀雙鳥昔酸(gyelig-cxc!ic_dimericgmp)降 解【初到。i2有研究我明，青枯雷爾氏菌廠putative diguanylate phosphodiesterase因的缺失將影響細(xì)歯的 行為，包括生物膜的形成國(guó)誓駕、細(xì)胞的生長(zhǎng)國(guó)型、菌體細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)固馬及基因表達(dá)的調(diào)節(jié)等警!。推 u青枯雷爾氏菌fjat-t582因putative diguanylate phosphodiesterase因發(fā)生的插入突變,阻斷具基因表 達(dá)，致便其致病力發(fā)生改變。tf枯雷爾氏菌fjat4583是編碼 type 111 effector prolei

42、n基|孔的突變，轉(zhuǎn)座了于 type hl effector protein沖的2074郵處jfutbpe iii effector protein是青枯雷爾氏菌致病力相關(guān)蛋門陋馮 多數(shù)植物致病菌 一貝帶格式的亍均是通過tvoe-lj/pe泌系統(tǒng)的毒力效應(yīng)蛋白侵入植牧嚴(yán)理，瞬女匹iii效應(yīng)蛋白的缺失將導(dǎo)致致病菌的致病力下降，因此突變株fjat-t583表現(xiàn)出無(wú)致病力的特征的主要原因是其 me iii effectorprotein的插入突變。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)架的青枯甫爾氏菌突變休庫(kù)中存在較多的無(wú)致病力突變株，因血亦 后續(xù)研究中還將繼續(xù)進(jìn)行插入位點(diǎn)的檢測(cè)及致病件分析，以期為作物青枯病的丫物防治提供依據(jù).

43、帶格式的齊祐：acal narrow參考文獻(xiàn)一一帶格式的：字體：arial narrow丹 m 劉蛻體孑色護(hù)抗苑泊將叫爲(wèi)慈碼卅注料申另利性研殉沖胡做業(yè)科洱加07亍40(報(bào) 15534566：2)2誇海陽(yáng)邦慶逍，盧書文等.番茄宵松病的研究進(jìn)展j岡藝學(xué)執(zhí)2的山8艸刊:64昶5役厶曲3療柏也朱療苛 烤賽陌周涵護(hù)l別巍 坤狀芽砲桿甬對(duì)番茄青枯雷n氏苗致病性的彫嗨j用門人學(xué)？眾 007460)57?；沖爾氏胡在杭株體內(nèi)分布娛其致病刃的異質(zhì)帶格式的：字體:arial narrow,帶格式的:萬(wàn)百符號(hào)和編號(hào)4)3d55'、5-lgvfekgvigh_l7_fafka_s_g_lr_lndued

44、63;fote6lier_agaiastldlkesease_ifijpbagoa¥esuea4ed_wnham(ilted加cteriqj4atwe j 90523884帶格式的帶格芬的 帶格式的帶格式的：行距:多倍行距125 字行，不對(duì)齊到網(wǎng)格帶格式的帶格式的帶格式的6) 6少禮遍井燃巴申出庁枯苗無(wú)毎梅株和黃光假q2園7)由 3-146.7) 亮,，車建光 別遶 潔枯薜爾氏菌刊承座帝無(wú)致禪咲釣8別波曲什也朱育罠貝慈斌，胛宜一工防菌對(duì)青枯雷爾氏蘭的致弱特性jj農(nóng)'ik牛物技術(shù)丫報(bào)/ 2004,.9)_wlcanneiig a：少ior出odja 14；山hkoleu 艮曲i

45、6eui j nd 眉e66e p誌valuatiofi of 紺06曲怖6 lo 他冷 3)iov審 2of 用念映sobnacea 他叫 in gmato gennplas 觀 jmumal gfhytop0hology.2oo654(8:3g44o&4q) 10stobni efiosue$dnd44&z召捋6hi4jldetection oq念em infeiofis of fhstonia sotenacea他做 bkwaf 2j2ce 3 in tomak)j 帶格式的efgpj71k)wna4rlanrathology2006,p：7(3笄 6在1比/包菌誘導(dǎo)佗牛

46、.產(chǎn)4抗前化j申.物保護(hù)學(xué)執(zhí)1990,帶格式的帶格式的帶格式的.帶格式的 帶格式的 帶格式的 帶格式的444劉濟(jì) 帝訂他乍建島#焯葩n*秋纟/育 抵於稱昇爾氏荊脂肪酸現(xiàn)與谿耳性的關(guān)系已沖國(guó)農(nóng)業(yè)科氓 帶格式的嗎 12thu 隕 on h.d. hopiga! pbnl pathology:a! homabro 劉 j annual r eview of 丹 ygpathok)gy.200hpg："込嗎 口3謝希禺coresta尹枯箭共同試驗(yàn)分學(xué)組研究報(bào)旬j.沖|草科瘓2001):303314汁羽一肖崇処謁茄疔枯病病菌尢致病力菌株的分海和控赭研剜j.円南農(nóng)業(yè)人學(xué)學(xué)皆004禺4)媲34饌均

47、15 【巴 耀閽鷲呂常甌 少理趣 出用青枯萌胞外蛋白輸曲缺尖突變軸勒細(xì)船?？萸G的繃pp護(hù)物傑護(hù)學(xué)報(bào),2005.22(3):28728&16) 16 frey pfrioyg j<otoujan&ky a jvigalet 即金nturigalet 位”申祁/沏需 of pseudomonq春olanacea/v/n衛(wèi)ptent©倉(cāng)oon"o!和en&ofjpfnqlq 塩 gleria!別 iqj 屮 pplied 由記環(huán)聞0朋槍皿31皿血0飯0!09片19&4£0伶:3175法318£4-3-4 17ltrin!p

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49、273 &i r) 【1q falnprin my rardarial ai cn tranrhiiniian nafwcrk in a canamict naranpctiualll frn/ircn mimhinl 7004if vz tt. 了 <-tv<7lv<v<« twvltvtt jjxtvxzt i xwit171 q|zwltvvvj. » i tt vtttttx/tx/x/tvjj . t w« « v vt vvr.i-q4 (1 ql fialnnri n l( y an nikrdcicaun

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53、on meeting 帥anning and 壞ps4ajysaggharide帶格式的25）25&£3燈°叫£&只盤 事以併 加缶 simulate& p&ba!越pr©&&ion in 迪26）26 anna block, guangyong lif heng qing fu, jame& r alfanq尸hytopathogonype 川越ector卅eaponry and加孑翅測(cè)以飯?jiān)X眇.27）27 janie 氐用mfano and alan collmer. ® 阻川 貸gr

54、ehomys 帕傀 ftfectohb妙恥：gpuble 卻 ent & in 加gteri#；ysease and 屈 ant1），劉波，朱育:筲，林抗美，肖榮風(fēng)，葛慈斌，藍(lán)江林，冒乃利青枯雷爾氏菌在植株體內(nèi)分布及其致病力的界質(zhì)一性研究【卩國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)200j：叫（乙）：1559566./2）擰海濤，鄒慶道.匕卩文等.譯茄青枯病的研究進(jìn)展j1 聞藝學(xué)報(bào),200 2®（增刊人64965纟_3）血?jiǎng)⒉?，林營(yíng)志，朱冇塊 葛慈斌曲耳作防菌對(duì)青枯雷爾氏俏的致弱特溝jl推業(yè)f.物技術(shù)學(xué)報(bào)322329.帶格式的：行距:多倍行距125 . 字行，不對(duì)齊到網(wǎng)格 汽帶格式的匚a（帶格式的f只帶格

55、無(wú)的r帶格式的帶格式的帶格式的帶格式的4）擲生芳，乍建淡，林背志，藍(lán)江林，劉波 朋j：jts丿芋列和rams標(biāo)記分析育枯宙爾氏菌的遺傳弟樣性s 農(nóng)業(yè) 牛.物技術(shù)學(xué)報(bào)，200&, j6.（4）694-700、帶格式的5）浮柏廿，朱療勞，抿賽群，周涵韜，劉波.姑狀芽他桿菌對(duì)番茄左枯雷爾氏菌致病性的影響j1. .廈門人學(xué)學(xué)報(bào)， 200746.（4）： 5745776) mckinney h h. mosaic diseases in the canary islands, west africa, and gibraltarjjl journal of agricultural research, 1929, 39; 557558.7) lovrekovich l, farka s g l. induced protection aaainst wildfire disease in tobacco leaves treated with heatkilled bacteria*na怕re, 1965 205:8238248) 何禮遠(yuǎn)，康耀衛(wèi)利用青枯菌無(wú)毒菌株和熒光假單胞菌誘導(dǎo)花生產(chǎn)生抗病性ml ,植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1990., 2(億)： 113116.9) 屛本亮，車建類，劉波.枯宙爾氏lwtn5,技座了無(wú)致病力突變株構(gòu)建及