細胞生物學資料講解

1、LncRNA wires up Hippo and Hedgehog signaling to reprogramme glucose metabolismLncRNA連接Hippo和Hedgehog信號(xnho)重新編程葡萄糖代謝匯報(hubo)人：蘭夢嬌學號：18213035第一頁，共27頁。背景(bijng)介紹 三陰乳腺癌 LncRNA Hippo signaling Hedgehog signaling第二頁，共27頁。三陰乳腺癌 三陰乳腺癌的癌組織免疫組織化學檢查結果為雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和原癌基因Her-2均為陰性的乳腺癌，預后與其他類型相比(xin b)較差

2、，且復發(fā)迅速。 肺轉移和肝轉移的發(fā)生率高。第三頁，共27頁。LncRNA 長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA。 研究發(fā)現, 長鏈非編碼 RNA 的表達或功能異常具體表現在序列和空間結構上的異常、表達水平的異常、與結合蛋白相互作用的異常等 它們在癌癥中調控染色質結合蛋白，在細胞核中形成核信號(xnho)復合物，控制蛋白細胞定位，調節(jié)基因表達。因此，他們被認為是癌癥潛在的治療靶點第四頁，共27頁。第五頁，共27頁。Hippo signaling Hippo signaling HippoHippo通路是一條由通路是

3、一條由一系列蛋白激酶和轉一系列蛋白激酶和轉錄因子組成的激酶鏈。錄因子組成的激酶鏈。主要包括三部分主要包括三部分: : 上上游調控元件游調控元件(NF2(NF2、MerMer等等) )、核心組件、核心組件( (主要是主要是Mst1/2Mst1/2、Lats1/2)Lats1/2)及下游效應及下游效應分子分子(fnz)(YAP)(fnz)(YAP)。在正常機體內在正常機體內, , 活化活化的的Mst1/2Mst1/2可以磷酸化可以磷酸化并激活其底物并激活其底物 Lats1/2, Lats1/2, 活化的活化的Lats1/2Lats1/2可以直接磷酸可以直接磷酸化下游效應分子化下游效應分子(fnz)

4、YAP, (fnz)YAP, 磷酸化的磷酸化的YAPYAP與細胞質中與細胞質中14-3-314-3-3蛋白結合滯留于胞漿蛋白結合滯留于胞漿中而無法進入細胞核中而無法進入細胞核, , 從而喪失作為轉錄輔從而喪失作為轉錄輔助因子的功能助因子的功能第六頁，共27頁。Hedgehog signaling在胚胎發(fā)育和胚胎形成后細胞(xbo)的生長和分化過程中都起著重要的作用，控制著細胞(xbo)的生長與增殖，通路由分泌糖型配體Hedgehog，跨膜蛋白受體PTC和Smo，核轉錄因子GLI蛋白及下游靶基因組成。Ptc抑制Smo蛋白活性，從而抑制下游通路，這時下游的Gli蛋白在蛋白酶體內被截斷，并以羧基端被

5、截斷的形式進入細胞(xbo)核內，抑制下游靶基因的轉錄。當Ptc和Hh結合以后，解除對Smo的抑制作用，促使 Gli蛋白與PKA及一些未知因子與微管形成大分子復合物，使得全長Gli蛋白進入核內激活下游靶基因轉錄。第七頁，共27頁。 研究發(fā)現BCAR4是TNBC中上調的lncrna之一，TNBC轉移需要BCAR4通過促進Hedgehog信號通路。 我們發(fā)現BCAR4是YAP的直接靶點，需要YAP通過GLI2依賴性Hedgehog信號通路促進糖酵解。從機理上講，BCAR4/GLI2通過上調HK2和PFKFB3兩種糖酵解酶來重新編程糖代謝。研究表明，特異性降低(jingd)葡萄糖氧化會增加腫瘤轉移。

6、因為YAP和BCAR4都有利于糖酵解和腫瘤轉移。轉移是否需要YAP-BCAR4糖酵解，有待進一步闡明。第八頁，共27頁。第九頁，共27頁。 BCAR4作為YAP下游基因的確定 為了闡明可能參與乳腺癌代謝的YAP下游靶基因，我們分析了發(fā)表的一篇YAP微陣列數據，這些數據來自于MCF10A穩(wěn)定過表達載體、野生型YAP、YAP活性突變體(5SA)和YAP非活性突變體(S94A)。 首先，在基因轉錄水平上，YAP- 5SA穩(wěn)定細胞野生型YAP穩(wěn)定細胞YAP-S94A和載體控制穩(wěn)定細胞，建立一組YAP正調控的基因 其次，我們通過參考TCGA數據庫和相關的出版物，優(yōu)先選擇在癌癥中高度表達的基因 BCAR4

7、是一種lncRNA，它參與了與乳腺癌轉移相關的Hedgehog級聯反應，被確定為潛在(qinzi)的YAP下游目標。第十頁，共27頁。一、LncRNA BCAR4是YAP的轉錄(zhun l)靶點 YAP的過表達顯著誘導了BCAR4及其他YAP下游靶基因的轉錄 在此過程中需要YAP的轉錄活性，因為(yn wi)YAP或YAP活性突變體(YAP- 5SA)過表達顯著誘導BCAR4的轉錄，而非活性突變體(YAP- s94a)則沒有第十一頁，共27頁。在MDA-MB-231細胞中，YAP的下調(xi dio)抑制了BCAR4和YAP下游基因的轉錄，通過對BCAR4啟動子分析，發(fā)現有兩個YAP/TEA

8、Dbinding位點第十二頁，共27頁。 在葡萄糖刺激下，對照組的BCAR4顯著增加。 通過(tnggu)熒光酶素檢測，發(fā)現突變BCAR4啟動子中YAP/ TEAD的結合位點，顯著降低了YAP/ TEAD誘導的BCAR4的表達第十三頁，共27頁。用乳腺癌組織陣列對乳腺腫瘤中YAP與BCAR4水平的相關性進行分析，發(fā)現BCAR4的表達(biod)與YAP的表達(biod)呈正相關這些數據表明YAP-BCAR4軸可能在乳腺癌的發(fā)生(fshng)發(fā)展中發(fā)揮致癌作用。第十四頁，共27頁。二、YAP誘導(yudo)糖酵解需要BCAR4葡萄糖攝取(shq)，乳酸生產以及細胞培養(yǎng)基酸化是測量糖酵解的指標在T

9、NBC細胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468中，對BCAR4或GLI2的過表達促進了糖酵解過程。第十五頁，共27頁。在YAP活性突變(tbin)細胞中，敲除BCAR4和GLI2，糖酵解被抑制第十六頁，共27頁。在YAP敲除細胞中，分別加入外源BCAR4、GLI2,糖酵解顯著(xinzh)提高因為因為YAP在促進在促進(cjn)糖酵解和糖酵解和BCAR4轉錄方面起作用，轉錄方面起作用，BCAR4/GLI2信號信號可能參與可能參與YAP誘導的糖酵解誘導的糖酵解第十七頁，共27頁。三、BCAR4/GLI2通過上調(shn dio)糖酵解酶HK2和PFKFB3促進糖酵解為了識別這些參與糖代謝

10、的BCAR4/ GLI2調控基因，在MDA-MB-231細胞中檢測了一組糖代謝相關基因的轉錄，發(fā)現過表達BCAR4/GLI2主要(zhyo)增強了HK2和PFKFB3的表達。第十八頁，共27頁。為了驗證HK2和PFKFB3在YAP-5SA或BCAR4/ GLI2誘導糖酵解中的作用，用HK2抑制劑與PFKFB3抑制劑對YAP-5SA或BCAR4/GLI2過表達乳腺癌細胞進行治療(zhlio)，發(fā)現抑制HK2和PFKFB3可顯著抑制癌細胞對葡萄糖的攝取以及細胞增殖由于HK2和PFKFB3都是糖酵解激活劑，表明HK2和PFKFB3是YAP-BCAR4/GLI2的潛在下游基因，是促進糖酵解作用所必需的

11、第十九頁，共27頁。四、HK2和PFKFB3是BCAR4/GLI2的直接(zhji)下游基因 之前的研究表明BCAR4作為一種LNA，可以激活p300,導致組蛋白標志物H3K27ac等乙酰化，從而激活基因。 通過RNA純化(ChIRP)和染色質免疫沉淀(ChIP)檢測，發(fā)現BCAR4/GLI2及p300和H3K27ac在葡萄糖刺激下均與HK2和PFKFB3的啟動子相關。 表明，BCAR4/GLI2/p300復合物通過標記為乙?；慕M蛋白直接(zhji)激活了HK2和PFKFB3的轉錄。第二十頁，共27頁。五、BCAR4促進YAP參與的腫瘤(zhngli)的發(fā)生在乳腺腫瘤發(fā)生10天后，裸鼠每隔一

12、天注射(zhsh)一次雜化LNA或BCAR4 LNABCAR4和GLI2的下調明顯抑制了YAP-5SA誘導的細胞增殖，而YAP-5SA的過表達增加了MDA-MB-231移植瘤的生長。與使用LNA治療相比，在vivo優(yōu)化的使用LNAs中BCAR4的消耗明顯降低了YAP-5SA誘導的腫瘤的生長。第二十一頁，共27頁。在移植瘤中證實了LNA介導的BCAR4下調BCAR4的缺失(qu sh)降低了YAP-5SA誘導HK2和PFKFB3的上調第二十二頁，共27頁。在異種移植腫瘤中，BCAR4的缺失降低了YAP-5SA誘導(yudo)HK2和PFKFB3的表達Ki67和cleaved caspase-3分

13、別提示增殖減少，凋亡增加第二十三頁，共27頁。六、高YAP/BCAR4表達與乳腺癌患者臨床預后不良(bling)相關通過檢測乳腺癌組織中BCAR4和YAP的表達情況，發(fā)現高水平的BCAR4或YAP不利于乳腺癌患者(hunzh)無復發(fā)生存率，而BCAR4和YAP的低水平均有利于無復發(fā)生存率第二十四頁，共27頁。CYR61是一種細胞外基質相關蛋白，處于外信號轉導通路下游，可促進細胞增殖，黏附，遷移，分化和細胞外基質合成等作用，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要(zhngyo)作用。在乳腺癌患者樣本中，BCAR4的表達與YAP或下游基因CYR61的表達呈正相關這些數據提示這些數據提示(tsh)YAP-BCAR4軸通過重新編程葡萄糖代謝參與乳腺癌的軸通過重新編程葡萄糖代謝