第三章-克隆載體的特征及類型PPT

1、第三章 基因克隆的載體質(zhì)粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA粘粒（cosmid）與噬菌粒人工染色體載體載體的功能及特征載體：攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具。 能夠運(yùn)載外源DNA片段（目的基因）進(jìn)入受體細(xì)胞，具有自我復(fù)制能力，使外源DNA片段在受體細(xì)胞中得到擴(kuò)增和表達(dá)，不被受體細(xì)胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類DNA分子。第一節(jié) 載體的功能及特征載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件載體應(yīng)具備的條件有復(fù)制起點(diǎn)，在受體細(xì)胞中能自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制；具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)；具有篩選轉(zhuǎn)

2、化子的選擇性標(biāo)記基因；分子量小，拷貝數(shù)多；具有較高的外源DNA的載裝能力；安全，不含對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，不會(huì)任意轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞以外的其它生物細(xì)胞中。自主復(fù)制型載體和附加載體的擴(kuò)增方式 載體的類型n應(yīng)用范圍：克隆載體、表達(dá)載體。n應(yīng)用對(duì)象：原核載體、真核載體（酵母、植物和動(dòng)物）、穿梭載體。n構(gòu)建來源：質(zhì)粒載體、病毒或噬菌體載體、質(zhì)粒DNA與病毒或噬菌體DNA組成的載體、質(zhì)粒DNA與染色體DNA片段組成的載體?？寺≥d體(cloning vector) 用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增的載體。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。表達(dá)載體(expression vector) 使目的基因

3、在宿主細(xì)胞中得以表達(dá)的載體?？蓪⒅亟M體DNA導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞，使所載的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。穿梭載體(shuttle vector) n又稱雙功能載體，能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制的載體。n同時(shí)具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)和真核生物可識(shí)別的病毒復(fù)制原點(diǎn)或酵母菌的自主復(fù)制序列(ARS)，它既能在原核細(xì)胞中擴(kuò)增又能在真核細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)。n主要用于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，通常是將載體和待克隆的真核生物DNA片段先在細(xì)菌中克隆，再轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞中表達(dá)，并可提高外源基因的表達(dá)效率。第二節(jié) 質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子；

4、絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1 - 200 kb天然DNA質(zhì)粒具有3種構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)狀(cccDNA)、開環(huán)(ocDNA)和線性(lDNA)構(gòu)型。 Plasmid chromosome 絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征1. 質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA的復(fù)制受質(zhì)粒和宿主細(xì)胞雙重遺傳系統(tǒng)的控制根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒 1 - 5 拷貝 stringent plasmid松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒

5、10 - 60 拷貝 stringent plasmid質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制 質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合oriE.coli ColE1 plasmid復(fù)制方向rop（+）RopRNA IIRNA I3553RNAII是復(fù)制的正向調(diào)節(jié)分子，RNAI是復(fù)制的負(fù)調(diào)節(jié)物 質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制 質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征2. 質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)

6、構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容粒組成不相容性群。親緣關(guān)系密切的質(zhì)粒；野生型質(zhì)粒與其衍生的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)(親和性質(zhì)粒)其

7、中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征3. 質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等如Col、R的其它成員非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由 bom 和mob 基因決定由rec基因控制，使質(zhì)粒整合到染色體基因組上。在基因工程應(yīng)用的是重組缺陷型（rec）的質(zhì)粒和菌株。質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征4. 質(zhì)粒的重組性質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征5. 攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒D

8、NA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成 抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義 利用利用抗性抗性基因基因進(jìn)行進(jìn)行重組重組子的子的篩選篩選質(zhì)?；蚓幋a的特性nFertility /F質(zhì)粒：只含有tra基因，除了促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移外沒有其他功能。nResistance / R質(zhì)粒：含有氯霉素、青霉素等抗性基因。如RP4，發(fā)現(xiàn)于假單胞桿菌。nCol 質(zhì)粒：編碼大腸菌素，可以殺死其他細(xì)菌，如存在于E. coli 中的CoE1。n降解質(zhì)粒（Degradative plasm

9、ids）:可以降解特殊的分子如：甲苯，水楊酸。n致瘤質(zhì)粒（Virulence plasmids）：農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒。天然存在的兩種質(zhì)粒colE1colE1宿主細(xì)菌大腸桿菌，宿主細(xì)菌大腸桿菌，6.5kb6.5kb，松弛型復(fù)制，松弛型復(fù)制20-20-30/cell30/cellpSC101pSC101宿主細(xì)菌沙門氏菌，宿主細(xì)菌沙門氏菌，8.8kb8.8kb，嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制，嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制5/cell5/cell，標(biāo)記基因?yàn)?，?biāo)記基因?yàn)門cTcr質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)建理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具備的條件n分子量較小。 n松馳型，在受體細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)。n具有一個(gè)以上的選擇標(biāo)記基因，形成重組質(zhì)粒后，至少還要有一個(gè)強(qiáng)的選擇標(biāo)記

10、。n具有允許外源DNA片段克隆的位點(diǎn)，并且位于選擇標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)，插入外源片段不影響質(zhì)粒的復(fù)制功能。n能夠?qū)爰闹骷?xì)胞，具備轉(zhuǎn)化的功能。n操作簡單方便，可根據(jù)需要加裝其它元件，構(gòu)建不同用途的質(zhì)粒載體。天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必因而不適合用作基因工程的載體，必須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建：須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建：（1）加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于用作選擇）加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于用作選擇（2）增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組）增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組（3）縮短長度，切去不必要的片段，提

11、高導(dǎo)入效率，增加裝載量）縮短長度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量（4）改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝）改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝（5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的方法就是重組，拼拼接接，挖肉補(bǔ)瘡。方法就是重組，拼拼接接，挖肉補(bǔ)瘡。構(gòu)建質(zhì)粒載體應(yīng)遵循的原則n選用合適的出發(fā)質(zhì)粒n正確獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件n根據(jù)要轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞的特性，組裝合適的選擇標(biāo)記基因。n構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體，選用合適的啟動(dòng)子。n力求構(gòu)建過程簡單化質(zhì)粒質(zhì)粒的分類人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如

12、下幾類： 高拷貝質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù)1000-3000 擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒 來自pSC101 拷貝數(shù)小于10 表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測序質(zhì)粒 含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn) 便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒 裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子 便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒 裝有報(bào)告基因 便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制 pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH I

13、TcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR322： 氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù) 50 - 100 / cell用于基因克隆 優(yōu)點(diǎn)：n分子量?。?363bp, 容易純化。n含有2個(gè)抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作為選擇標(biāo)記。而且每一個(gè)標(biāo)記基因都含有單一的酶切位點(diǎn)，可以插入DNA，amp基因內(nèi)可被Pst I, Pvu I, Sac I切開，而四環(huán)素抗性基因可被BamH I, Hind III切開，通過插入失活篩選重組子。n受體細(xì)胞內(nèi)，pBR322以多拷貝存在，一般一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可達(dá)到50-100個(gè)，而在蛋白質(zhì)合成抑制劑存在條件下，如氯

14、霉素，可達(dá)到1000-3000拷貝。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：n 有被動(dòng)遷移的可能，不夠安全。有被動(dòng)遷移的可能，不夠安全。n 抗生素標(biāo)記插入失活篩選為負(fù)篩選法，比較麻煩?？股貥?biāo)記插入失活篩選為負(fù)篩選法，比較麻煩。質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18 / 19： 拷貝數(shù) 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和測序 裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記 lacZBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstI

15、SphIHindIII質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18 / 19：正選擇標(biāo)記 lacZ 的顯色原理pUC18/19PlaclacZMCSb-半乳糖苷酶的a-肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galpUC18也來自于pBR322，但只保留了復(fù)制起點(diǎn)和ampR位點(diǎn)，ampR基因的序列已改變限制性位點(diǎn)不再存在，所有的克隆位點(diǎn)集中在lacZ基因內(nèi)的一個(gè)小片段上。pUC18的優(yōu)點(diǎn)：1）突變位點(diǎn)位于復(fù)制起點(diǎn)，提高了拷貝數(shù)。2) 重組子的鑒定可一步完成，固體培養(yǎng)基中添加amp和X-gal, IPTG，節(jié)約了一半的時(shí)間。

16、3）多克隆位點(diǎn)，可以使具有不同粘端的DNA片段插入載體，而不必連接linker。4）載體中的多克隆位點(diǎn)與M13mp系列的載體是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接轉(zhuǎn)入M13mp載體，可以進(jìn)行DNA測序和體外定點(diǎn)突變。質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGEM-3Z：多拷貝裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記 lacZ用于外源基因的高效表達(dá) 注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等在重組

17、的在重組的pGEM3ZpGEM3Z載體中載體中加入相應(yīng)的加入相應(yīng)的RNARNA聚合酶聚合酶，可以，可以發(fā)生外源基因發(fā)生外源基因轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄。質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA： 氯化銫密度梯度離心法 質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿溶法 質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡便沸水浴法 質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化氯化銫密度梯度離心法： 用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDN

18、ARNAs質(zhì)粒載體總體評(píng)價(jià)n操作簡便n克隆容量有限（ 10kb）第三節(jié) 噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體：高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl 噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)l 噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成 l-DNA全長48502個(gè)核苷酸l-DNA上至少有61個(gè)基因約有約有20

19、kb的區(qū)域?yàn)闉槭删w的區(qū)域?yàn)闉槭删w生長非必需生長非必需的的，可以缺失或被外源，可以缺失或被外源DNA片段所取代。片段所取代。l 噬菌體生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l l - DNAn野生型入噬菌體野生型入噬菌體DNA為雙鏈線性分子為雙鏈線性分子n黏性末端黏性末端(cohesive end)：線性分子左右兩端各有線性分子左右兩端各有12bp組成的組成的5端端突出的粘性末端突出的粘性末端，l lDNA進(jìn)入宿

20、主細(xì)胞后黏性末端連接形成環(huán)進(jìn)入宿主細(xì)胞后黏性末端連接形成環(huán)DNA分子。分子。 ncos位點(diǎn)位點(diǎn)(cohesive end site) ：指在連接酶的作用下，連接上述：指在連接酶的作用下，連接上述黏性末端結(jié)合形成的雙鏈黏性末端結(jié)合形成的雙鏈DNA區(qū)段。又稱區(qū)段。又稱黏性末端位點(diǎn)黏性末端位點(diǎn)。nl l噬菌體噬菌體DNA分子上有分子上有56種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。n溫和噬菌體，易于在溶源生長保存，在溶菌生長增殖溫和噬菌體，易于在溶源生長保存，在溶菌生長增殖。nl 噬菌體生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl 噬菌體生物學(xué)特性： 感染周期

21、E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl 噬菌體生物學(xué)特性： 感染周期體內(nèi)包裝100個(gè)左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75 - 105%即 36 - 51 kbDA噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl 噬菌體生物學(xué)特性： 溶原狀態(tài) l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于

22、溶菌狀態(tài)，或處于溶菌狀態(tài) DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度 野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體： 插入型載體取代型載體噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度 插入型載體體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長度

23、 37 kb插入片段大?。? - 14 kb（51 37）噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度 取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度 10 kb（51 26）載體長度 26 kb插入片段最大裝載長度 25 kb（36 26）噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1 - 2個(gè)同時(shí)，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)除了簡單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)噬菌體或

24、病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記 imm434imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活， l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌

25、體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記 lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：構(gòu)建琥珀密碼子的突變體 琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型l-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性

26、的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株 噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的主要類型：插入滅活型載體Charon2、Charon6、lgt11取代型載體lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正選擇型載體lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細(xì)菌中繁殖（Spi+），這種生長抑制表型受l-DNA上的red和gam兩個(gè)基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌

27、受體菌中繁殖，并形成透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA重組分子的體外包裝：l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿

28、菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期 加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37培養(yǎng)1小時(shí) 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4 -12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒 密度已達(dá)1013 -1014 / L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解 超速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放l-DNA 乙醇或異丙醇沉淀l-DNA 噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 l-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量 重組l-DNA分子的篩選較為方便 重組l-DNA分子的提取較為簡便 l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表

29、達(dá) 外源基因噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀M13 噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成 M13 DNA全長6407個(gè)核苷酸M13 DNA上至少有10個(gè)基因2700個(gè)外殼蛋白分子M13 噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長 噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性： 感染周期+ DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA- DNAIIV噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13 DNA載體的構(gòu)建：III VI I IV II X V VII IX VIII野生型M1

30、3RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列載體lacZpolylinker噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13 DNA載體的特點(diǎn)：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡便被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大 但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5 kb噬菌體或病毒DNA 與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病 毒基因組DNA。 動(dòng)植物病毒種類繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性的病毒。

31、按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類： 單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒 RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組?？妓官|(zhì)粒與噬菌粒 l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25 kb和1.5 kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段， 考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。 在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時(shí)又能保證重組DNA分

32、子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建pHC796400 bpTcrl fragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNA cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體cos site - carrying plasmid1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段裝載范圍為31 - 45 kb考斯質(zhì)粒與噬菌粒考斯質(zhì)粒（

33、cosmid）考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemid or phasmid）噬菌粒載體的特點(diǎn)：噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10 kb）能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈

34、DNA考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemid or phasmid）重要的噬菌粒載體：pUC118 / 119pUC118 pUC18 + M13間隔區(qū) IGpUC119 pUC19 + M13間隔區(qū) IG500 個(gè)拷貝3200 bpMCSlacZlacIoriAprM13-MGpUC118 / 119表示M13輔助噬菌體DNA考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemid or phasmid）重要的噬菌粒載體：pBluescript 體外轉(zhuǎn)錄載體pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT72958 bpMCSlacZPT7oriAprf1-oripBluescr

35、iptPT3噬菌體啟動(dòng)子PT3和PT7強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄提取出來的單鏈DNA重組分子在噬菌體RNA聚合酶的存在下，又可實(shí)現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄人造染色體載體 人類、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千 kb 的DNA片段， 此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。 將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。 目前常用的人造染色體載體包括：細(xì)菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（YAC）人造染色體載體細(xì)

36、菌人造染色體（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50 - 300 kb之間各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝pBACs主要適用于：克隆大型基因簇（gene cluster）結(jié)構(gòu)構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫人造染色體載體酵母人造染色體（Yeast Artificial Chromosomes YAC）YAC載體應(yīng)含有下列元件： 酵母染色體的端粒序列 酵母人造染色體的構(gòu)建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色體的復(fù)制子 酵母染色體的中心粒序列 酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記大腸桿菌的復(fù)制子 大