小細(xì)胞肺癌中信號(hào)通路及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

1、    小細(xì)胞肺癌中信號(hào)通路及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析    王東梅 張展英摘要：目的  分析小細(xì)胞肺癌相關(guān)的信號(hào)通路，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，探究小細(xì)胞肺癌相關(guān)的關(guān)鍵基因。方法  從cbioportal數(shù)據(jù)庫(kù)下載110例小細(xì)胞肺癌患者臨床和全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，采用r軟件分析數(shù)據(jù)的基本信息，kegg信號(hào)通路富集分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果  共收集110例小細(xì)胞肺癌患者，其中男性多于女性，大部分患者年齡在60歲及以上，且吸煙人數(shù)多于戒煙人數(shù)，吸煙患者的突變位點(diǎn)數(shù)（n=345.4）高于戒煙組（n=299.70），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2、（p關(guān)鍵詞：小細(xì)胞肺癌;基因突變;信號(hào)通路;蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)：r734.2                                 ：a                                 doi：10.3969/j.issn.1006-1

3、959.2020.01.025：1006-1959（2020）01-0081-04analysis of signal pathways and protein interaction networks in small cell lung cancerwang dong-mei1，zhang zhan-ying2（1.shanghai qiming information technology co.，ltd.，shanghai 200000，china;2.mayerdiagnostic products co.，ltd.，shanghai 200000，china）abstract：ob

4、jective  to analyze the signaling pathways related to small cell lung cancer， construct a protein interaction network， and explore key genes related to small cell lung cancer. methods  the clinical and whole-genome sequencing data of 110 small cell lung cancer patients were downloaded from

5、 the cbioportal database. the basic information of the data was analyzed using r software， and the kegg signal pathway enrichment analysis was performed to construct a protein interaction network. results  a total of 110 small cell lung cancer patients were collected， including more men than wo

6、men， most of whom were aged 60 years and over， and the number of smokers was more than the number of people who quit，the number of mutation sites （n=345.4） in smoking patients was higher than that in the smoking cessation group （n=299.70），the difference was statistically significant（pkey words：small

7、 cell lung cancer;gene mutation;signaling pathway;protein interaction network受生活環(huán)境、習(xí)慣和遺傳等因素的影響，肺癌的死亡人數(shù)不斷增加，目前已成為全球發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一。torre la等1報(bào)道，2012年全球新增肺癌患者約180萬(wàn)，占癌癥總?cè)藬?shù)的12.9%，肺癌死亡人數(shù)約159萬(wàn)，占癌癥總死亡人數(shù)的19.4%。在我國(guó)，肺癌的發(fā)病率和死亡率均居于惡性腫瘤之首，因此預(yù)防、治療肺癌成為亟需解決的問(wèn)題。目前肺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，大量資料表明，長(zhǎng)期大量吸煙是肺癌的一個(gè)重要致病因素，吸煙可增加肺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。d

8、ong j等2對(duì)肺癌新發(fā)易感位點(diǎn)與吸煙的交互作用研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者一些基因突變位點(diǎn)與吸煙量相關(guān)。garcía campelo mr等3報(bào)道，wnt信號(hào)通路作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)之一，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究選擇cbioportal數(shù)據(jù)庫(kù)中小細(xì)胞肺癌的臨床和全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)信號(hào)通路分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因，旨在為發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)理提供幫助，報(bào)道如下。1材料與方法1.1數(shù)據(jù)來(lái)源  從cbioportal數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//）中獲取110例小細(xì)胞肺癌患者的臨床和基因測(cè)序數(shù)據(jù)。檢索式為（“l(fā)ung can

9、cer”） and （not “mixed cancer types”） and （not “l(fā)ung squamous cell carcinoma”） and （not “l(fā)ung adenocarcinoma”）and （not “non-small cell lung cancer”），獲得small cell lung cancer（clcgp， nat genet 2012）、small cell lung cancer（johns hopkins， nat genet 2012），small cell lung cancer（u cologne， nature 2015）3個(gè)數(shù)據(jù)

10、集。選擇臨床資料豐富（包含性別、年齡、吸煙等信息）的數(shù)據(jù)集作為研究對(duì)象：small cell lung cancer （u cologne，nature 2015）。1.2方法  采用r軟件對(duì)收集到的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)，獲得數(shù)據(jù)的基本特征。根據(jù)過(guò)濾條件對(duì)分子數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理規(guī)則如下：根據(jù)variant_type類(lèi)型，挑選snp、ins、del三種變異類(lèi)型;保留編碼區(qū)變異位點(diǎn)，排除非編碼區(qū)域的變異位點(diǎn);排除熱點(diǎn)突變位點(diǎn);排除胚系變異位點(diǎn)。對(duì)基因進(jìn)行pathway的富集分析，由于pathway的條目中包含很多條信號(hào)通路，且每個(gè)信號(hào)通路所包含基因的數(shù)目變化較大，采用fisher精

11、確檢驗(yàn)計(jì)算p值（p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1數(shù)據(jù)基本情況  共收集110例小細(xì)胞肺癌患者，其中男70例（63.64%），女40例（36.36%）?；颊咂骄挲g為64.59歲，其中60歲及以上的共80例（72.73%）。吸煙53例（48.18%），戒煙42例（38.18%），無(wú)吸煙經(jīng)歷2例（1.81%），吸煙狀態(tài)信息缺失13例（11.82%）。統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的突變總數(shù)，去除離群值后，進(jìn)行單因素的方差分析，結(jié)果顯示吸煙患者的突變位點(diǎn)數(shù)（n=345.4）高于戒煙組（n=299.70），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。2.2 pathway富集分析 

12、在吸煙（current）和戒煙（former）患者中，以超過(guò)10%的突變基因?yàn)檠芯繉?duì)象，進(jìn)行pathway富集分析，結(jié)果顯示，發(fā)生突變的基因主要與wnt信號(hào)通路（吸煙：p=6.48e-6，fdr=3.54e-4;戒煙：p=8.27e-9，fdr=1.36e-6）、鈣粘蛋白信號(hào)通路（吸煙：p=1.40e-5，fdr=5.73e-4;戒煙：p=9.70e-7，fdr=5.30e-5）、煙堿乙酰膽堿受體信號(hào)通路（吸煙：p=3.09e-5，fdr=1.01e-3;戒煙：p=2.59e-3，fdr=3.85e-2）有關(guān)，見(jiàn)圖1。2.3蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)  以吸煙中超過(guò)10%的突變基因?yàn)檠芯繉?duì)象

13、，檢索kegg數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。用networkanalyzer工具計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋮?shù)，結(jié)果顯示度大于10的基因有pik3cg、erbb4、notch3、notch1、mylk、ep300、crebbp、tp53、araf、grm5、grm1、adcy8、gnal、adrbk2、gli3、arrb2、rb1，其中pik3cg基因在網(wǎng)絡(luò)中度最大為83，erbb4基因次之為36，且pik3cg和erbb4是網(wǎng)絡(luò)中介數(shù)中心性和緊密中心性最大的2個(gè)基因，見(jiàn)表1。3討論3.1小細(xì)胞肺癌的基本特征  chen w等4研究顯示，中國(guó)肺癌患者中男性的發(fā)病率為6

14、9.45%，女性發(fā)病率為30.55%。本研究統(tǒng)計(jì)了小細(xì)胞肺癌患者的性別比例，發(fā)現(xiàn)男性患小細(xì)胞肺癌的比例高于女性，表明小細(xì)胞肺癌可能與性別有關(guān)。本研究中小細(xì)胞肺癌患者的平均年齡為64.59歲，且大部分為60歲及以上的老年人，表明小細(xì)胞肺癌最常見(jiàn)于60歲以上的老年人。吸煙人數(shù)占總?cè)藬?shù)的48.18%，戒煙人數(shù)占38.18%，有吸煙經(jīng)歷的患者占86.36%，表明小細(xì)胞肺癌的發(fā)生與吸煙有關(guān)。這與tonini g等5的研究結(jié)論一致，說(shuō)明吸煙是肺癌的一個(gè)最重要的危險(xiǎn)因素，其中87%的肺癌患者死亡與吸煙有關(guān)。同時(shí)，吸煙患者的基因突變位點(diǎn)數(shù)高于戒煙患者6，表明吸煙容易引起與癌癥相關(guān)的基因突變。3.2 pathw

15、ay富集分析  目前已有研究顯示，wnt信號(hào)通路、煙堿乙酰膽堿受體信號(hào)通路與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。wnt信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、運(yùn)動(dòng)及凋亡等過(guò)程，為細(xì)胞發(fā)育所需，調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為及細(xì)胞的相互作用，vaughan ae等7發(fā)現(xiàn)激活wnt信號(hào)通路可增加腫瘤發(fā)生的概率。尼古丁對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用主要通過(guò)尼古丁乙酰膽堿受體實(shí)現(xiàn)，除中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元，全身許多細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及腸道和肺的上皮細(xì)胞均表達(dá)尼古丁乙酰膽堿受體。schuller hm8研究表明，尼古丁及尼古丁乙酰膽堿受體在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，包括調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、

16、新生血管的形成等。本研究顯示，發(fā)生突變的基因主要與wnt信號(hào)通路、鈣粘蛋白信號(hào)通路、煙堿乙酰膽堿受體信號(hào)通路有關(guān)。wnt信號(hào)通路主要通過(guò)3種途徑進(jìn)行傳導(dǎo)：經(jīng)典wnt信號(hào)途徑（wnt/-catenin信號(hào)通路），該通路激活后將募集細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的-catenin，隨后-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活靶基因表達(dá)，而在沒(méi)有wnt信號(hào)存在時(shí)，-catenin則被apc-axin-gsk3-ck復(fù)合體泛素化降解，通路即關(guān)閉;wnt/pcr通路：主要作用可能是參與調(diào)控胚胎發(fā)育時(shí)期細(xì)胞骨架的重排;wnt/ca2+ 途徑：該通路由wnt-5a或wnt-1l激活，活化后的cdk2和pkc使胞內(nèi)鈣離子濃度升高，導(dǎo)致nf

17、at在核內(nèi)蓄積誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)。e-鈣粘蛋白是參與細(xì)胞間粘附連接的重要分子，發(fā)揮著維持細(xì)胞極性和組織結(jié)構(gòu)完整性的功能，其主要通過(guò)與-連環(huán)蛋白形成復(fù)合體介紹同質(zhì)細(xì)胞之間的相互粘附抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲;同時(shí)e-鈣粘蛋白競(jìng)爭(zhēng)性和-連環(huán)蛋白結(jié)合，降低細(xì)胞內(nèi)游離型-連環(huán)蛋白水平，從而抑制其參與wnt信號(hào)通路細(xì)胞增殖基因的表達(dá)。e-鈣粘蛋白復(fù)合體的異?？赡軙?huì)引起細(xì)胞之間的黏附能力減弱以及腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞容易脫離、侵襲和轉(zhuǎn)移。小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系均存在尼古丁乙酰膽堿受體，目前發(fā)現(xiàn)尼古丁在肺癌細(xì)胞中的主要作用為促進(jìn)腫瘤組織細(xì)胞增殖和抑制藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。3.3蛋白相互作用網(wǎng)

18、絡(luò)  本研究構(gòu)建的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，度大于10的基因有pik3cg、erbb4、notch3、notch1、mylk、ep300、crebbp、tp53、araf、grm5、grm1、adcy8、gnal、adrbk2、gli3、arrb2、rb1，提示這些基因可能與小細(xì)胞肺癌密切相關(guān)，其中pik3cg，erbb4是網(wǎng)絡(luò)中度最大的2個(gè)基因，表明pik3cg和erbb4基因在網(wǎng)絡(luò)中起重要的作用。這與很多研究的結(jié)論類(lèi)似，如：pik3ca基因編碼的蛋白是pi3ks的催化亞單位，pi3ks是一種脂激酶家族。pik3ca基因的突變可以導(dǎo)致pi3ks的催化活性異常增強(qiáng)，促使細(xì)胞發(fā)生癌變，其機(jī)制

19、主要為pi3k/akt通路是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中一個(gè)重要通路，pi3ks能特異性磷酸化磷脂酰肌醇的3位羥基，產(chǎn)生第二信使肌醇類(lèi)物質(zhì)如pip3，pip3可促使akt轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上并被pdk1/pdk2活化，akt則是pi3k/akt信號(hào)通路中核心因子，異?；罨腶kt會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。kurppa kj等10發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中存在erbb4致癌突變，該基因編碼的蛋白屬于表皮生長(zhǎng)因子受體家族，該家族包括her1、her2、her3及her4，也屬于受體酪氨酸激酶家族。erbb4可被neuregulins等蛋白激活，從而磷酸化下游蛋白，參與細(xì)胞的有絲分裂和分化，其突變與多種癌癥有關(guān)。westhoff b等

20、13在原代nsclc上皮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)notch1基因突變的細(xì)胞被-分泌酶抑制劑選擇性地殺死，提示腫瘤細(xì)胞增殖的優(yōu)勢(shì)依賴(lài)notch信號(hào)。notch基因編碼一類(lèi)高度保守的細(xì)胞表面受體，這些受體調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的發(fā)育，從而notch信號(hào)影響細(xì)胞正常形態(tài)發(fā)生的多個(gè)過(guò)程，包括多能祖細(xì)胞的分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及細(xì)胞邊界的形成。fernandez-cuesta l等14的研究表明，參與細(xì)胞周期調(diào)控的重要抑癌基因tp53是小細(xì)胞肺癌的特征性基因變異。tp53基因又稱(chēng)為p53，是一種抑癌基因，該基因的異常與超過(guò)半數(shù)的腫瘤相關(guān)。p53還是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，與很多靶基因有關(guān)，影響細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程，比

21、如編碼細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶抑制蛋白的p21基因和凋亡前體蛋白bax的編碼基因等。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌與吸煙有關(guān)，且吸煙會(huì)引起基因突變位點(diǎn)數(shù)量的增加。小細(xì)胞肺癌與wnt信號(hào)通路、鈣粘蛋白信號(hào)通路、煙堿乙酰膽堿受體信號(hào)通路有關(guān)，可能與pik3cg、erbb4基因密切相關(guān)。參考文獻(xiàn)：1torre la，bray f，siegel rl，et al.global cancer statistics，2012j.ca cancer j clin，2015，65（2）：87-108.2dong j，hu z，wu c，et al.association analyses identify mu

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