LUMINEX技術原理及應用

1、Luminex的基本原理及應用傳統(tǒng)的蛋白質分析主要采用雙抗體夾心 ELISA法。此法長期以來被視為蛋白 質定量分析的“標準方法”。ELISA可以用來準確測定大批量生物樣品，但每次 實驗只能分析一個目標分子，而不具備同時分析多種目標分子的能力。在ELISA基礎上發(fā)展出的luminex技術，不僅同樣通過雙抗體選擇而具有高特異性，同 時也具有ELISA的高通量、操作簡便、測量準確等優(yōu)點，而且可以在一次實驗中 完成對多種目標分子的分析，從而改變了過去的分析模式，建立了更加高效快速 的分析平臺。Luminex技術原理，在近年發(fā)表的文章中已有過詳細的介紹和說明。 Luminex技術應用微球和流式細胞儀的原

2、理。微球內部含有三種熒光免疫熒光，通過熒光不同的比例可以區(qū)分 500種不同的微球。每種微球可以用來檢測一種不 同的蛋白或基因。因此，利用微球技術，可以同時檢測高達500個蛋白或基因。該技術利用熒光編碼的微球共價交聯(lián)單克隆抗體，與被測定的目標分子結合后， 加入熒光素標記的檢測抗體，再通過激光掃描熒光編碼來識別單個微球和測量“檢測熒光”強度來確定被測分子的濃度。在使用相同抗體對的條件下，luminex 技術的測量結果在準確度、精確度、靈敏度方面與ELISA均可達到相似的水平。Luminex應用的熒光編碼微球帶有針對不同目標分子的特異性抗體，不同的微球在一定程度上可以自由組合，這樣在一次實驗中可以同

3、時完成多個目標分子的分 析。多目標分子的同時測定可以大大減少生物樣品的消耗量，節(jié)省成本和測定時問，并且使多種目標分子之間相關性的分析更加準確。很多公司已經開始提供 Luminex試劑盒，用于基礎和臨床醫(yī)學研究以及臨床檢測。目前， Luminex試劑 盒已經可以檢測500多種蛋白質分子，包括細胞因子、激素、自身抗體、腫瘤標 志物等。Luminex常見問題及解答LUMINEX用于哪些領域?生物醫(yī)學研究，生物標記物開發(fā)，臨床檢測等領域。Luminex技術主要用于蛋白和核酸檢測分析。LUMINEXK感性如何？靈敏度取決于開頭的質量。對于同樣的抗體對，Luminex檢測的靈敏度高于ELISA 技術。一般

4、檢測靈敏度在pg級。對不同類型的樣品制備和樣品量的要求是怎樣的？血活、血漿是常用的樣本，每次檢測需要10ul,每次可以檢測多個蛋白。從各種細胞或組織中提取的蛋白也可以用 Luminex技術檢測，制備方法與ELISA、Western Blot 完全一樣。一般可以檢測到多少基因或蛋白的表達信息？檢測蛋白和基因的數目主要取決于試劑盒。蛋白質檢測目前最高可以達到50個左右，基因檢測最高達500個。如何保證檢測結果的特異性？檢測的特異性取決于抗體高特異性。 試劑幾乎全部來源于美國大公司，產品經 過了嚴格的質量控制。同時，我們檢測公司也有近 15年的經驗、嚴格的操作程 序和質量控制體系?？蛻糇约禾峁┛贵w，

5、是否可以進行 LUMINEX僉測？Luminex和ELISA檢測試劑都需要兩個配套的特異性抗體。我們公司具有開發(fā) Luminex試劑盒的經驗。但是，需要一系列的開發(fā)工作才能保證結果的特異性、 重復性和可靠性。除了蛋白，LUMINE戲術是否還可以用于其它指標的檢測？可以用于基因表達，基因多態(tài)性和 HLA配型分析。檢測周期多久？視待測蛋白的種類、數量和標本數量定。一般來說，檢測一組蛋白（1-50個，視蛋白種類定）和一組標本（多達360個標）需要3-4小時的操作時間及基本數 據分析。但是，檢測周期也取決于公司當時的工作量。 一般來說，從標本收到起， 檢測應在1-2周完成；但是部分蛋白試劑盒需要收到訂

6、單后從美國進口，檢測周期可能會延長到4-5周。如何判定LUMINEX數據表達水平差異有無意義？表達差異主要取決于標本的性質和數量,我們公司為客戶提供專業(yè)的數據統(tǒng)計服 務。LUMINE/驗和流式細胞儀的優(yōu)劣比較？Luminex技術是流式細胞儀和微球相結合的蛋白、核酸檢測技術，檢測對象是蛋白質、DN酣大分子。普通流式細胞儀主要用于檢測整體細胞表面或細胞內的 蛋白表達情況。Luminex檢測蛋白和標本數目大，是一種高通量檢測技術。普通 流式細胞儀每次只能檢測幾種蛋白分子，而且檢測速度較慢，不適合高通量分析。 由此可見，兩種方法應用方向有很大差別。報告的格式如何？報告以xcel表格形式，包括每種蛋白在

7、每個標本中的表達量。公司也可以為客 戶提供數理統(tǒng)計分析結果。完成一個LUMINEX勺實驗，需要的細胞的量是多少？至少10ul的血活、血漿，蛋白提取物，或50-100萬細胞如何控制LUMINEX僉測的質量？我們對每一次檢測都設定標準曲線， 并設定內參進行校正。我們會定期做儀器校 正，檢測精密度和重復性實驗以確保檢測結果的可靠性。實驗失敗有幾種原因？從實驗室角度看，成敗原因包括試劑盒的質量，待測樣品稀釋倍數；待測蛋白質 低于儀器檢測底限，實驗操作程序。從客戶角度看，成敗取決于樣品制備，保存和運輸是否恰當。我們公司可以提供 規(guī)范操作程序，供客戶參考。得到實驗的結果后，可以進行那些研究的工作？可進行多

8、方面的研究，例如：觀察不同實驗條件對待測蛋白含量的影響， 可進行 藥物作用靶點研究，不同人群血樣生物標記物的研究， 健康評估，疾病診斷，指 導治療等。經過分析后，若得到幾白個感興趣的基因或蛋白，如何對這些基因做功能分類或者Pathway相關分析呢？分析方法與其它技術平臺一樣，我們公司可以提供全套有償服務。如何考慮LUMINEX復實驗的問題？我們每次都會對使用的標準品和內參做重復性測定，同時也建議對每份樣本進行重復2次測定。在進行LUMINEX；驗時，由于經費的限制，是否可以把多個樣品進行混合以消除樣品的個體差異后再上 LUMINEX：測？不建議這么做。多個樣品做檢測，計算平均值和誤差才有統(tǒng)計學

9、意義。如果多個 樣品混合后測定只能算1份樣品。客戶是組織的樣品，準備自己提取樣品，請問樣品提取方面有沒什么技術要求？ 需要采用對抗原抗體反應，或者蛋白質抗原性沒有抑制作用的提取液進行提取， 避免采用會造成蛋白質變性的試劑，如高濃度的尿素或者鹽酸月瓜等。需要能完全提取待測蛋白質，否則對結果會造成誤判。提取以后需要怎么保存，怎么運輸？建議保存于-80度。避免反復凍融。可用十冰或者至少用冰袋運輸。LUMINEX勺假陽性率是多少？技術性的假陽性率非常低，小于1%生物假陽性率取決于每個蛋白的生物學特 征?？砷_展此項目的臨床科室有哪些？目前我公司擁有的世界最先進的高通量液相芯片檢測技術，在國內僅有3臺是否

10、可以將同一癥狀的病例混合后抽提，看共性表達？可以?；旌虾蟮臉悠穼⒈灰曌鲉我粯悠愤M行檢測。服務流程如何?幫助客戶制定檢測方案T樣品檢測T結果分析T報告出具T可為客戶提供更深 層次的服務(實驗設計、數據分析、論文撰寫與發(fā)表)如何訂購您們的服務？通過咨詢，協(xié)商檢測方案，然后付費或簽訂合同。LUMINEX蛋白檢測平臺服務項目、細胞因子、化學因子類：6Ckine/CCL2BCA-1/CXCL13CTACK/CCL27皮膚T細胞虜獲趨化因子EGF表皮生長因子ENA-78/CXC L5中性粒細胞Eotaxin嗜酸細胞活化趨化Eotaxin-2/CCL24/MPIF-2 嗜Eotaxin-3/CCL26 嗜酸

11、細胞活激活蛋白-78因子酸細胞活化趨化因子-2化趨化因子-3FGF-2成纖維細胞生長因子Flt-3 ligand FMS樣酪氨酸激Fractalkine 人神經趨化因子GCP2/CXCL6 人中性粒細胞-2酶3配體趨化蛋白2G-CSF粒系集落刺激因子GM-CSF粒-單系集落刺激因子GRO生長相關基因蛋白HCC-1/3/CCL14a / 6I-309/CCL1IFN a 2干擾素a 2IFN Y干擾素YIL-10白介素-10IL-11白介素-11IL-12 (p40)白介素-12IL-12 (p70)白介素-12IL-13白介素-13IL-15白介素-15IL-16白介素-16IL-17白介素-

12、17IL-1ra 白介素-1raIL-1 a白介素1 aIL-1 6白介素-1 6IL-2白介素-2IL-20白介素-20IL-21白介素-21IL-23白介素-23IL-28a 白介素-28aIL-29白介素-29IL-3白介素-3IL-33/NF-HEV (mature)白介素-33IL-4白介素-4IL-5白介素-5IL-6白介素-6IL-7白介素-7IL-8白介素-8IL-9白介素-9IP-10干擾素誘導蛋白-10I-TAC/CXCL1 1干擾素誘導T細胞趨化因子LIF白血病抑制因子Lymphotactin 淋巴細胞趨化蛋白MCP-1(MCAF)單核細胞趨化蛋白1MCP-2單核細胞趨化

13、蛋白2MCP-3/CCL7 單核細胞趨化蛋白3MCP-4單核細胞趨化蛋白4M-CSF巨噬細胞集落刺激因MDC/CCL22 巨噬細胞來源MIG/CXC L9趨化因子9MIP-1D (MIP-5/CCL15)巨噬子的趨化因子細胞炎性蛋白-1DMIP-1a巨噬細胞炎性蛋白MIP-16巨噬細胞炎性蛋白MIP-3& /CCL19巨噬細胞炎性MIP- 3a /CCL20巨噬細胞炎性-1a-16蛋白36蛋白3aMMP -1基質金屬蛋白酶-1MMP -2 基質金屬蛋白酶-2MMP -3基質金屬蛋白酶-3MMP -7基質金屬蛋白酶-7MMP -9基質金屬蛋白酶-9MMP -10基質金屬蛋白酶MMP -1

14、2基質金屬蛋白酶MMP -13基質金屬蛋白酶-10-12-13NAP-2/CXCL7 中性粒細胞趨PDGF-AA血小板衍生生長PDGF-AB/BB 血小板衍生生RANTES分泌趨化因子化蛋白2因子AA長因子AB/BBsCD30可溶性CD30sCD40L 可溶性 CD40LSCF干細胞因子SDF-1a +6 /CXCL12 基質細胞衍生因子-1 a +(3sEGFR可溶性表皮生長因子sgp130可溶性糖蛋白130sIL-1RI可溶性白細胞介素-1sIL-1RII可溶性白細胞介素-1受體受體I受體IIsIL-2Ra可溶性白細胞介素-2sIL-4R可溶性白細胞介素-4sIL-6R可溶性白細胞介素-6

15、sRAGE可溶性晚期糖基化受體a受體受體中產物受體sTNF RI可溶性腫瘤壞死因sTNF RII可溶性腫瘤壞死因sVEGF R2可溶性血管內皮sVEGF R3可溶性血管內皮子受體I子受體II生長因子受體2生長因子受體3sVEGF RI可溶性血管內皮TARC/CCL17 胸腺活化調節(jié)TGFa轉化生長因子&TIMP-1組織金屬蛋白酶抑制生長因子受體I趨化因子劑-1TIMP-2組織金屬蛋白酶抑制TIMP-3組織金屬蛋白酶抑制TIMP-4組織金屬蛋白酶抑制TNFa腫瘤壞死因子a劑-2劑-3劑-4TNF&腫瘤壞死因子6TPO甲狀腺過氧化物酶TRAIL/TNFSF10TSLP人胸腺基質淋巴

16、細胞生產素VEGF血管內皮生長因子、細胞信號通路類:Active Caspase 3 活化半胱胺酸蛋白酶3Active C leaved PARP 活化切割的多腺昔二磷酸多聚酶Akt/PKB (Ser473)磷酸化蛋白激酶BAkt/PKB (Thr308)磷酸化蛋白激酶BATF2 (Thr69/71)活化復制因子2BAD (Ser112)CD& (pan Tyr)c-Jun (Ser73)c-Kit (pan Tyr)Cleaved PARPc-Met/HGFR (pan Tyr)CREB (Ser133)EGF Receptor (pan Tyr) 表皮生長因子受體Erb-B2/HE

17、R2 (pan Tyr)第二人體表皮生長因子受體ERK/MAPKinase1/2(Thr185/Tyr187)GAPDHH2A.X (Ser139)HSP27 (Ser 78)IGF1R (pan Tyr)胰島素樣生長因子1受體IRS1 (pan Tyr)I k Ba (Ser 32)JNK (Thr183/Tyr185)LAT (pan Tyr)Lck (pan Tyr)MEK1 (Ser 222)MKK6 (Ser 207/Thr21 1)MSK1 (Ser 212)p21p38 (Thr180/Tyr182)p53 (Ser15)p53 (Ser46)p70 S6 Kinase ( Th

18、r412)PDGF Receptor & (pan Tyr)Rsk1 (Ser380)STAT1 (Tyr701)STAT1 (Tyr707)STAT2 (Tyr690)STAT3 (Ser727)STAT3 (Tyr705)STAT5A/B (Tyr694/699)STAT6 (Tyr641)Syk (pan Tyr)ZAP-70 ( pan Tyr)三、神經因子類:CortisolApo AlApo CIIIApo EBDNFCathepsin D 組織蛋白酶 DComplement C3Complement C4Complement Factor HC reactive prot

19、ein (CRP) C-反應蛋白MelatoninMIP-4MPONCAMNeurotensinOrexin AOxytocinPAI-1 (total)PDGF-AAPDGF-AB/BBPEDFPrealbuminRANTESSAPsICAM-1Substance PsVCAM-1& -Antitrypsina 2MacroglobulinaMSHEndorphin四、骨代謝因子類：RANKLAdiponectin 脂聯(lián)素IL-16ACTHIL-6InsulinLeptin瘦素Osteopontin (OPN)骨橋蛋白OsteocalcinOsteoproteger inPTHTNF

20、a腫瘤壞死因子aCortisolFibronectinHSAInvolucr inLPSKeratin-6Keratin - 1Keratin - 10六、凋亡及敗血癥因子：MIF巨噬細胞移動抑制因子PAI-1 (Total)sFassFa sLsICAM-1sVCAM-1七、免疫球蛋白分型：IgAIgG1IgG2IgG3IgG4IgM八、腫瘤生物標記物：CA-125癌抗原125IGF-II胰島素樣生長因子2Leptin瘦素MIF巨噬細胞移動抑制因子Osteopontin (OPN)骨橋蛋白Prolactin泌乳刺激素MMP-1基質金屬蛋白酶-1MMP-2基質金屬蛋白酶-2MMP-9基質金屬蛋

21、白酶-9CA 15-3癌抗原檢測15-3Serum amyloid A 血清淀粉樣蛋白ACA 19-9 癌抗原 19-9TGF a轉化生長因子aCathepsin D 組織蛋白酶 DTNFa腫瘤壞死因子 aVEGF血管內皮生長因子VEGFR2血管內皮生長因子伊2-Micr oglobulin林2 微球蛋CEA癌胚抗原C reactive protein (CRP) C-受體2白反應蛋白E-cadherin上皮型鈣黍占附蛋白EGFR表皮生長因子受體Eotaxin嗜酸細胞活化趨化因子ER- a雌激素受體aFas(CD95 or Apo-1)腫瘤壞死因子受體超家族成員 6Ferritin鐵蛋白Fib

22、rinogen纖維蛋白原AFP甲胎蛋白Follistatin 卵泡素G-CSF集落刺激因子3Haptoglobin 結合珠蛋白HER-2(erbB2) 第二人體表皮生長因子受體ICAM- 1細胞間粘附分子-1IGFBP-1胰島素樣生長因子IGFBP-2胰島素樣生長因子IGFBP-3胰島素樣生長因子結合蛋白1結合蛋白2結合蛋白3Angiopoietin- 2血管生成素2LH賴氨酸羥化酶MCP-1(MCAF)單核細胞趨化蛋白1MIG/CXC L9趨化因子9tPSA總前列腺特異性抗原fPSA游離前列腺特異性抗原NSE神經元特異性烯醇化酶Free- $hCG游離血清人絨毛膜促性腺激素EB antibo

23、dy EB 病毒抗體HE4人附睪分泌蛋白4CA215癌抗原215CA242癌抗原242CA724癌抗原724CA50癌抗原50Cyfra 21- 1角蛋白19片段SCCA鱗狀細胞癌抗原九、內分泌激素類：ACTHAGRPAmylin (Active or Total)BDNFCNTFC-PeptideFSHGHGLP-1 (Active)GlucagonIGF-1IGFBP-1胰島素樣生長因子結合蛋白1IGFBP-2胰島素樣生長因子結合蛋白2IGFBP-3胰島素樣生長因子結合蛋白3IGFBP-4胰島素樣生長因子結合蛋白4IGFBP-5胰島素樣生長因子結合蛋白5IGFBP-6IGFBP-7InsulinLeptinLH賴氨酸羥化酶Prolactin泌乳刺激素TSHGhrelin (Active)GIP (Total)PPPYY