丙二醛含量測定學習資料

1、丙二醛含量測定植物組織中丙二醛含量測定方法一：一、目的通過實驗，掌握植物體內丙二醛含量測定的原理及方法。二、原理丙二醛（MDA是由于植物官衰老或在逆境條件下受傷害，其組織或器官膜 脂質發(fā)生過氧化反應而產(chǎn)生的。它的含量與植物衰老及逆境傷害有密切關系。 測定植物體內丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性條件下加熱與組織中的丙二醛產(chǎn)生顯色反應，生成紅棕色的三甲川（3、5、5三甲基惡唑2、4 二酮），三甲川最大的吸收波長在 532nm但是測定植物組織中 MDA寸受多 種物質的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與硫代巴比妥酸顯色反應產(chǎn)物的 最大吸收波長在450nm處，在532nm處也有吸收。植物

2、遭受干旱、高溫、低溫 等逆境脅迫時可溶性糖增加，因此測定植物組織中丙二醛與硫代巴比妥酸反應 產(chǎn)物含量時一定要排除可溶性糖的干擾。此外在532nm波長處尚有非特異的背景吸收的影響也要加以排除。低濃度的鐵離子能顯著增加硫代巴比妥酸與蔗糖 或丙二醛顯色反應物在532、450nm處的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛與硫代 巴比妥酸顯色反應中需要有一定的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100 300pgg1Dw根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入 Fe3+的終濃度為0.5nm ol L S在532nm 600nm和450nm波長處測定吸光度值，即可計算出丙二醛含 量。三、材料、儀器設備及試劑1. 材料：植

3、物葉片。2. 儀器設備：離心機，分光光度計；電子分析天平；恒溫水浴；研缽；試 管；移液管（1ml、5ml）、試管架；移液管架；洗耳球；剪刀。3. 試劑：10%三氯乙酸；0.6 %硫代巴比妥酸（TBA溶液：石英砂。四、實驗步驟1. 丙二醛的提取稱取受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片 1g,加入少量石英砂和1 0%三氯乙酸2ml，研磨至勻漿，再加8ml10%三氯乙酸進一步研磨，勻漿以 40 00r/min離心10min,其上清液為丙二醛提取液。2. 顯色反應及測定取4支干凈試管，編號，3支為樣品管（三個重復），各加入提取液2ml，對照管加蒸餾水2ml，然后各管再加入2ml 0.6 %硫代巴比妥

4、酸溶液。搖勻，混 合液在沸水浴中反應15min,迅速冷卻后再離心。取上清液分別在 532、600和 450nm波長下測定吸光度（A）值。五、丙二醛含量計算：由于蔗糖TBA反應產(chǎn)物的最大吸收波長為450nm毫摩爾吸收系數(shù)為85. 4X103，MD TBA反應產(chǎn)物在532nm的毫摩爾吸收系數(shù)分別是 7.4 X10 3和155 X103。532nm非特異性吸光值可以600nm波長處的吸光值代表。按雙組分分光光度法原理，建立方程組，解此方程組即可求出MDA及可溶性糖濃度。方程組:A 450= (85.4 X1O_3) C糖(A2 Aoo) = (155X10_3) CMd+ (7.4 X10_3) C

5、糖解得：A450C糖=11.71A 450 (mmolL)85.4 X1031CMd= 6.45 (A32 A500) 0.56A450- (mol L )公式中：A450在450nm波長下測得的吸光度值A532在532nm波長下測得的吸光度值A600在600nm波長下測得的吸光度值5* 1.55 X10為摩爾比吸收系數(shù)C糖、CMda分別是反應混合液中可溶性糖、MDA勺濃度1.按下式計算提取液中MDA濃度反應液體積(ml)CmdaX1000提取液中MDA濃度(mol ml1)=測定時提取液用量(ml)2.按下式計算樣品中MDA含量提取液中MDA度(ymol ml1)X提取液總量(ml)MDA含

6、量(mol g1 Fw)植物組織鮮重(g)方法二:一、原理丙二醛（MDA）是常用的膜脂過氧化指標，在酸性和高溫度條件下，可以 與硫代巴比妥酸（TBA）反應生成紅棕色的三甲川（3，5，5-三甲基惡唑- 2，4。二酮），其最大吸收波長在 532nm 。測定植物組織中MDA時受多種物質的干擾，其中最主要的是可溶性 糖，糖與TBA顯色反應產(chǎn)物的最大吸收波長在 450nm，但532nm處 也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時可溶性糖增加，因 此測定植物組織中MDA-TBA反應物質含量時一定要排除可溶性糖的干 擾。二、材料、儀器設備及試劑（一）材料：植物葉片（二）儀器設備：紫外可見分光光度計1臺

7、；離心機1臺；電子天平1臺；10ml離心管4支；研缽2套；試管4支；刻度吸管：10ml1支，2ml1支；剪刀1把。(三) 試劑：10 %三氯乙酸(TCA)；0 6 %硫代巴比妥酸：先加少量的氫氧化鈉(1mol -1)溶解，再用10 %的三氯 乙酸定容；三、實驗步驟1 實驗材料受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片或衰老的植物器官。2 . MDA的提取 稱取剪碎的試材1g，加入2mll0 % TCA和少量石英砂，研磨 至勻漿，再加8mlTCA進一步研磨，勻漿在 4000r min-1離心10min，上清 液為樣品提取液。3 .顯色反應和測定吸取離心的上清液2ml(對照加2ml蒸餾水)，加入2ml

8、0. 6 % TBA溶液，混勻物于沸水浴上反應 15min，迅速冷卻后再離心。取上清 液測定532、600和450nm波長下的消光度。4 .計算含量(1)直線方程法MDA與TBA顯色反應產(chǎn)物在450nm波長下的消光度值為零。不同濃度的蔗糖(0-25mmolL-1)與TBA顯色反應產(chǎn)物在450nm 的消光度值與532nm和600nm處的消光度值之差成正相關，配制一系列濃度的蔗糖與 TBA顯色反應 后，測定上述三個波長的消光度值，求其直線方程，可求算糖分在 532nm處的消光度值。UV-120型紫外可見分光光度計的直線方程為：Y532 = -0 . 00198 十 0 . 088D450(1)(2

9、)雙組分分光光度法據(jù)朗伯一比爾定律：D = kCL,當液層厚度為1cm時，kD/C, k稱為該物質 的比吸收系數(shù)。當某一溶液中有數(shù)種吸光物質時，某一波長下的消光度值等于 此混合液在該波長下各顯色物質消光度之和。已知蔗糖與TBA顯色反應產(chǎn)物在450nm和532nm波長下的比吸收系數(shù)分別 為85 . 40、7 . 40。MDA在450nm 波長下無吸收，故該波長的比吸收系數(shù) 為0 , 532nm波長下的比吸 系數(shù)為155，根據(jù)雙組分分光度計法建立方程 組，求解方程得計算公式：式中C1 = 11 . 71D450(2)C2 = 6 . 45(D532-D600)-0.56D450(3)C1-可溶性糖的濃度(mmol L-1)，C2-MDA 的濃度(umol L-1 )，D450、0532、D600分別代表450、532和600nm 波長下的消光度值。以直線方程法計算時，按公式(1)求出樣品中糖分在532nm處的消光度值 Y532，用實測532nm的消光度值減去6nm非特異吸收的消光度值再減去 Y532，其差值為測定樣品中 MDA-TBA反應產(chǎn)物在532nm的消光度值。按 MDA在532nm處的毫摩爾消光系