《牛支原體的毒力、持續(xù)感染性和傳播特性》

1、獸醫(yī)微生物學(xué)牛支原體的毒力、持續(xù)感染性和傳播特性 摘要：牛支原體病是由牛支原體引起的牛的一種疾病，主要有肺炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、耳炎、生殖障礙及角膜結(jié)膜炎。牛支原體重要的研究特點主要包括表面脂蛋白的多樣性、粘附、入侵宿主細胞、宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、生物膜的形成、次級代謝物如過氧化氫的釋放以及與其他細菌病原體的協(xié)同感染。本文的目的是對當下牛支原體毒力的研究進展做一個總結(jié)，此外，還對有助于牛支原體在宿主體內(nèi)持續(xù)感染和傳播的因子進行了討論。1.引言牛支原體1961年在美國首次被分離，這種無細胞壁的細菌屬于柔膜體綱，引起牛的支原體病。被感染的牛會有多種多樣的臨床表現(xiàn)，大多數(shù)為長期性的，包括支氣管肺炎、耳炎

2、、乳腺炎、生殖器官疾病、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎以及角膜結(jié)膜炎。牛支原體能夠感染各種組織和器官，甚至能夠從健康的牛體內(nèi)分離，被認為是威脅家畜工業(yè)化生產(chǎn)國家的主要病原體之一。目前為止，并沒有有效的疫苗預(yù)防牛支原體的感染（2013），抗生素的治療幾乎無效且會增加菌株的耐藥性。現(xiàn)在對于支原體的致病性的分子機制的理解具有局限性。他們似乎是多遺傳因子的。治病的牛支原體相較與其他細菌，并不能通過有效的毒素產(chǎn)出將其鑒別。有極個別例外如肺炎支原體是可以通過ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行鑒別。直到現(xiàn)在，遺傳工具的缺少以及研究技術(shù)的局限性都阻礙著對牛支原體發(fā)病機理及毒力因子的研究，而對發(fā)病機理及毒力因子的研究又是開發(fā)治療及預(yù)防

3、措施應(yīng)對牛支原體病的基礎(chǔ)。運用轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)獲得牛支原體突變體以及新的質(zhì)粒，并由此對牛支原體內(nèi)染色體外的遺傳物質(zhì)進性復(fù)制擴增已經(jīng)被報道出來。隨著這些技術(shù)的可用性以及進一步的改善，很可能在不久的將來獲得牛支原體與宿主相互作用的詳細信息。本文對當前牛支原體致病機制進行了一個概述，主要對以下幾個方面進行了討論：1.與其他細菌或病毒的混合感染；2.抗原多樣性；3.粘附；4.牛細胞入侵；5.宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)；6.次級代謝物及菌膜形成。 2.與其他微生物的相互作用在自然感染的牛體內(nèi)，牛支原體經(jīng)常與其他病原微生物相作用，這種相互作用可能是在尸檢物的觀察中導(dǎo)致嚴重肺部損害的主要原因。與牛支原體最常關(guān)聯(lián)的致病

4、微生物有多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌、牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）、牛皰疹病毒1型（BHV1）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）以及副流感病毒3型。但是如下所述的一些研究卻產(chǎn)生了與此矛盾的結(jié)果。牛支原體的自然感染能夠造成滲出性支氣管肺炎并伴有廣泛的凝固性壞死病灶，然而實驗感染卻會導(dǎo)致亞臨床肺炎以及程度較輕的肺組織病變。因此，由牛支原體引起的嚴重肺部疾病被懷疑是由支原體與其他造成農(nóng)場管理問題的致病微生物的相互作用的結(jié)果。此外，個體動物的年齡及機體免疫狀態(tài)對病情的進展也至關(guān)重要。牛支原體的單獨感染只能在非常年幼的小牛體內(nèi)引起肺炎癥狀，因此與病毒或細菌的協(xié)同感染，對于引起飼養(yǎng)場中的成年

5、動物肺內(nèi)典型的廣泛的干酪樣壞死性病變是必不可少的。更確切地說，牛支原體可能與H.somni、溶血性曼氏桿菌以及多殺性巴氏桿菌這些細菌性病原體相互作用。這在實驗的小牛體內(nèi)以牛支原體作為誘發(fā)因素，然后用多殺性巴氏桿菌進行二次感染，從而引發(fā)嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病癥狀的試驗中得到驗證。另外一些研究者認為，牛支原體在H.somni、溶血性曼氏桿菌以及多殺性巴氏桿菌引起組織病變的過程中起到了一個對組織進行預(yù)先破壞的中介作用。在這種情況下，牛支原體能夠起到抵抗抗生素或者宿主免疫系統(tǒng)對原發(fā)性感染的治療或者抵御的作用。在另一個研究中，牛支原體與H.somni重要的協(xié)同作用在飼養(yǎng)場的小牛體內(nèi)被檢測到。80%的H.so

6、mni病例顯示出牛支原體陽性，但是，并沒有明顯的證據(jù)表明牛支原體與牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）以及溶血性曼氏桿菌存在相互協(xié)同作用。牛支原體與牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）的混合感染會導(dǎo)致更嚴重的呼吸道疾病，這是由于病毒所引起的免疫抑制效應(yīng)造成的。然而，在飼養(yǎng)場的牛體內(nèi)，牛支原體與BVDV之間的協(xié)同作用卻存在著矛盾的數(shù)據(jù)，且這些數(shù)據(jù)在也是有效地。關(guān)于牛支原體與牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）的混合感染，相較于牛支原體的單獨感染，臨床癥狀的嚴重程度并沒有明顯增加。有趣的是，實驗條件下牛支原體與BHV-1的混合感染會產(chǎn)生牛支原體引起的典型的器官損傷相同的結(jié)果。的確是這樣，混合感染6-8個月的飼養(yǎng)場小牛會

7、引起典型的干酪樣壞死性支氣管肺炎，僅由支原體感染時并不會引起如此典型的癥狀。此外，更高的死亡率也揭示了牛支原體與BHV-1彼此之間存在的協(xié)同效應(yīng)。 3.抗原變異牛支原體具有抗原表位多樣性，也叫菌株多樣性。這種這種高頻率相位突變及細胞膜表面脂蛋白的形狀多樣性已經(jīng)在幾個其他支原體菌株中得到證實。牛支原體菌株的抗原多樣性與地理起源、器官隔離、由單一菌株的亞克隆體（誘導(dǎo)的疾病類型）無關(guān)。這種多樣性被證明是基于幾個顯著的雙親性的、含有交叉反應(yīng)抗原表位的完整的膜蛋白。高頻率抗原的突變被證明是受在體外牛支原體同源抗體存在的影響。此觀點支持了先前的假設(shè)，這種體系能夠維持牛支原體亞種群的多樣性，并以此來逃避宿主

8、的免疫系統(tǒng)。因此，宿主不能完全消除這種病原菌，造成支原體引起疾病癥狀的長期臨床表現(xiàn)。牛支原體模式菌株P(guān)G45亞克隆的抗原剖面圖顯示出抗原在表達以及分子量水平上的高度動態(tài)多樣性。這些抗原被證明屬于一個相位和形狀具有高度變異性的膜表面脂蛋白(VSPs）家族。在模式菌株P(guān)G45中，其VSPs家族由13個不同的、自我復(fù)制的VSP基因組成，這些基因位于一個集群染色體的VSP基因座中。這個基因座大約含有基因的長度為23kb，含有兩個額外的開放閱讀框（ORFs），此閱讀框與可變遺傳因子IS4和IS30具有高度的同源性。ORFs編碼vspA，vspB，vspC，vspE，vspF，vspG， vpsH，vsp

9、I，vspJ，vspK，vspL，vspM，vspN and vspO (圖1) 。VSP基因座中的成員轉(zhuǎn)錄翻譯為脂蛋白，這些脂蛋白與脂肪酸和半胱氨酸殘基一樣具有雙親性。VSP基因含有一個保守的5端非編碼序列，可分為兩個基因盒，基因盒1（cassette1）在所有VSP基因中具有99%的同源性，編碼一個核糖體結(jié)合位點，基因盒2（cassette2）位于基因盒1的上游，具有高變形。5端非編碼序列后是一個有N-端區(qū)域開放閱讀框，這個N端區(qū)域在所有的菌株中具有98%-99%的同源性，并包有前脂蛋白信號肽酶，膜表面脂蛋白的C端區(qū)域表面是裸露的。幾種膜表面脂蛋白的混合表達會使得牛支原體表面具有不同的特殊

10、結(jié)構(gòu)以及抗原特性。膜表面脂蛋白基因的混合表達僅局限于兩個彼此隔離的基因之間，此時其余的VSP基因保持轉(zhuǎn)錄沉默。必須指出的是，vspA與vspO的基因重組事件會產(chǎn)生vspC，這解釋了缺乏vspA與vspC基因的混合表達會導(dǎo)致菌株中vspC的缺乏，以及vspA與vspC在結(jié)構(gòu)上的相似性。嵌合體vspC具有來自于vspO的高度保守的基因盒1的N-端，還具有來自于vspA高變的基因盒2的C-端，由于vspC也具有相位和大小的多樣性，這也增加了抗原的多樣性。而且，當vspA，vspM，vspN，vspO缺失時，也會造成vspC遺傳信息的丟失。因此，體外實驗中幸存的vspC變異體所隱匿的截短了的vsp基因

11、座是有問題的?？乖儺惏ㄔ谔囟ㄖ貜?fù)區(qū)域（高頻的形狀變異）通過插入或者缺失造成條帶的改變，結(jié)果導(dǎo)致vspA，vspB，vspC在10-，9-以及5-區(qū)域的不同程度的變異。在支原體模式菌株P(guān)G45所有的vsp基因中發(fā)現(xiàn)了18個不同的重復(fù)區(qū)塊。從它們的N端到C端，具有不同的大小和氨基酸結(jié)構(gòu)。這些區(qū)塊中的一些只存在于一個基因中，一些存在于幾個不同的Vsps中，形成一個串聯(lián)的不同重復(fù)域，負責(zé)編碼80%的蛋白質(zhì)（圖2）。這些重復(fù)序列與特定的vsp倒置序列一起位于保守的基因盒1中，是重組事件導(dǎo)致區(qū)域復(fù)制、染色體倒位、缺失的完美目標。此外，保守的基因盒2能夠作為某幾個Vsps的活性啟動原件以及調(diào)節(jié)下游基因的

12、表達。抗原表達中的高頻率相位變異會導(dǎo)致由于染色體重組而造成表面抗原的獲得或者缺失。在體外試驗中，這些事件在每個細胞每一代發(fā)生的頻率為10-2到10-3。在基因水平，通過染色體DNA限制性內(nèi)切酶切割能夠顯示出明顯的重排跡象，VspA和VspC各自不同的變異體會產(chǎn)生不同長度的片段。Vsps在表達和大小方面的變異在被感染呼吸道的小牛體內(nèi)得到證實。此外，在250個野生型菌株中有98.5%表達Vsps，這是依據(jù)單克隆抗體測驗的，這種單抗能夠結(jié)合與VspA，VspB和VspC蛋白質(zhì)的一個重復(fù)的區(qū)域（圖2中的深綠色區(qū)域）。不同的vsp基因組模式以及不同的Vsps抗原表現(xiàn)型似乎是極其復(fù)雜的，盡管一項關(guān)于vsp

13、基因的多態(tài)性以及表達圖譜相關(guān)性的研究表明所有的野生型菌株都具有一定的相關(guān)性，擁有一個共同的祖先。比較模式菌株P(guān)G45與牛支原體野生型菌株，顯示出在菌株特異性重復(fù)序列與vsp重復(fù)序列之間存在巨大的差異。這可以揭示特定菌株的個體抗原特性，擴展vsp的類型。特殊的例子是支原體野生型菌株2610，它編碼一個vsp家族的新成員，這個成員起到粘附素的作用，中國菌株湖北一號表達可變的表面脂蛋白A（VpmaX），缺少在PG45中存在的蛋白質(zhì)N端區(qū)域以及保守的上游DNA序列，但是卻表現(xiàn)出粘附特性。盡管N端和C端是保守的，在PG45（13個vsp相關(guān)ORFs）與中國菌株HB0801（6個vsp相關(guān)ORFs）的vs

14、p基因座中vsp基因的成員差異是顯著的。這種vsp基因的高變性可能是由于個體菌株在宿主體內(nèi)所遇到的選擇壓力的結(jié)果，也由此增加了牛支原體種群的多樣性。圖1.牛支原體模式菌株P(guān)G45的vsp基因座。圖片用SnapGene1 Viewer 2.3.2軟件根據(jù)公布的PG45全基因組序列生成。（公布序列在Wish et al.（2011）。 ps 圖2.牛支原體模式菌株P(guān)G45中的vspA，vspB，vspO基因簡化后的結(jié)構(gòu)特點。白色區(qū)塊（P）代表著位于ATG密碼子上游的長度為150bp的高度保守的5非編碼區(qū)域。第一個（基因盒1），包含有核糖體結(jié)合位點，而第二個（基因盒2）在vspA中是一般的活性促進子

15、。長度為75bp的高度同源的DNA序列編碼編碼vsp的信號肽，在圖中為灰色區(qū)塊（s），緊隨其后的是黑色標記第三區(qū)塊，在所有vsp基因中是保守的。有色區(qū)塊為重復(fù)的編碼序列，從N端延伸到C端，這些重復(fù)的區(qū)域能夠被分配到不同的vsp基因中（藍色，紅色以及深綠色），或者具有vsp特異性（亮綠色、黃色區(qū)塊）。 4.粘附粘附是支原體感染的第一步，由于粘附素直接與宿主細胞接觸，因此支原體細胞膜上的粘附素表達是相當重要的。因為支原體缺乏一連串的基因，而這些基因組參與重要的生物合成途徑，支原體必須從宿主體內(nèi)獲得一些重要的物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、脂肪酸。因此支原體與宿主細胞的親密接觸對于支原體的生存是重要的。牛支

16、原體與宿主細胞膜的融合是為了允許交換膜和細胞內(nèi)部的一些組分。有趣的是，并沒有證據(jù)表明在牛支原體內(nèi)存在一個提示器，它能作為為支原體肺炎主要粘附素積累的結(jié)構(gòu)，牛支原體的粘附素可能是以膜蛋白的形式分布于細胞表面。在體外試驗中，牛支原體菌株P(guān)G45粘附胚胎型牛肺細胞（EBL）受溫度的影響，37為最大粘附溫度。細胞受體的結(jié)合能力具有飽和度的限制，在EBL細胞內(nèi)感染復(fù)數(shù)（MOI）為225:1，在牛支器官上皮細胞（BBE）內(nèi)為100:1。細胞黏連率（3.4-19.1%）的大的變化與分離的器官無關(guān)卻受宿主細胞類型影響。在相較于致病菌株的低致病或者非致病菌株中，粘附率顯著地降低。而且，相較于上皮細胞系的粘連率，

17、成纖維細胞顯得低一些而在支氣管上皮細胞（BBE）顯得高一些。此外，在體外連續(xù)傳代后，牛支原體似乎失去了粘附能力。牛支原體的粘附是蛋白質(zhì)的相互作用，這在通過用蛋白酶處理牛支原體導(dǎo)致粘附能力的降低的試驗中到證實。此外，支原體蛋白質(zhì)中的唾液酸殘基被認為在細胞粘著中起著重要的作用。在特殊蛋白質(zhì)的水平，分子量為32千道爾頓的膜表面裸露蛋白P26被認為在牛支原體感染胚胎型牛肺細胞（EBL）中起主要的粘附作用。但是，用單克隆抗體處理P26后并不能顯著地減少牛支原體對BBE細胞的粘附。另一個牛支原體的粘附相關(guān)因子膜相關(guān)糖酵解酶-烯醇酶，因為它通過結(jié)合纖溶酶原誘導(dǎo)支原體粘附EBI細胞。實際上，用纖溶酶原增強物預(yù)

18、處理EBL細胞會使牛支原體的年富能力增強11.9%，用低濃度胰蛋白酶預(yù)處理牛支原體增加其蛋白水解活性以及對EBL細胞的粘附率，表明其他一些被低劑量胰蛋白酶激酶切活的蛋白水解酶也能夠參與粘附。Vsps也在牛支原體粘附中發(fā)揮作用，這在宿主細胞結(jié)合被免疫印跡標記的Vsps中得到證實。此外，在細胞粘附實驗中，添加純化的Vsps減少牛支原體的細胞粘附，Vsps被保留在宿主細胞層中。這在牛支原體粘附EBL細胞中在使用Vsps重復(fù)區(qū)域的寡肽對其進行局部細胞粘附抑制中得到證實。牛支原體特異性單克隆抗體1E5和4D7（二者都可以識別VspA，VspB，VspC的共同表位），2A8（抗VspC）和9F1（抗Vsp

19、F）被用于驗證支原體的Vsps接觸位點對抗體是否敏感。結(jié)果顯示，牛支原體菌株P(guān)G45余0435的部分粘附區(qū)域都可以被特異的單克隆抗體識別，而這些位點也是Vsps的粘附部分。然而，粘附的抑制是依賴于細胞系的使用。重復(fù)區(qū)塊的插入或者缺失導(dǎo)致表面抗原的改變，使Vsps生成新的抗原表位或者移除一些抗原表位造成細胞粘附作用的增加或者減少，也會導(dǎo)致大小范圍不一配體結(jié)合。5.細胞入侵在用牛支原體對小牛進行感染中，支原體被發(fā)現(xiàn)在各種類型的細胞質(zhì)中，如巨噬細胞、中性粒細胞、肝細胞、膽管上皮細胞、腎小管上皮細胞或者表面神經(jīng)的軸突。牛支原體抗原還會進一步在單核細胞、淋巴結(jié)、偶爾還在細支氣管上皮細胞中被發(fā)現(xiàn)。牛支原體

20、在吞噬細胞中持續(xù)的存活可能是由于在被吞噬的過程中，牛支原體可能改變了吞噬后的某一步驟來實現(xiàn)的。在一個體外實驗中，牛支原體菌株Mb1被發(fā)現(xiàn)在各種牛外周血單核細胞（PBMC）亞群中持續(xù)存在，如T細胞、輔助T細胞、B細胞、單核細胞、細胞毒T細胞、自然殺傷性細胞、樹狀細胞以及牛紅細胞。依據(jù)細胞的類型及感染的時間，牛支原體在細胞內(nèi)的不同位置信息能夠被確定。牛支原體與細胞膜一側(cè)的細胞質(zhì)基質(zhì)相關(guān)聯(lián)，呈彌散性分布于液泡樣結(jié)構(gòu)。牛支原體對不同細胞類型及牛外周血單核細胞（PBMC）亞群的入侵存在不同的程度和效率，可能是由于牛支原體對不同細胞的粘附或入侵的受體不同或者是牛支原體針對不同的細胞產(chǎn)生不通的差分信號。有趣

21、的是，在乳房上皮細胞內(nèi)并沒有發(fā)現(xiàn)牛支原體的存在。然而，我們在最近的體外實驗中使用熒光和透射電子顯微鏡在初級胚胎小牛鼻甲骨細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個牛支原體胞內(nèi)強毒株（圖3）?？傊Ｖгw對上皮細胞以及免疫細胞的入侵有助于牛支原體傳播進入宿主不同的感染位置，抗生素的治療能夠有效控制牛支原體的損害。但是，對牛支原體在不同細胞內(nèi)的持續(xù)存在的分子機制的進一步研究是必須的。 圖3：牛支原體菌株JF4278感染6小時后的初級胚胎小牛鼻甲細胞差分熒光顯微鏡圖像，感染復(fù)數(shù)（MOI）為3400:1，細胞核為藍色標記，纖維狀肌動蛋白為紅色標記。圖A：未受感染的鼻甲骨細胞。圖B：細胞內(nèi)的支原體被染成綠色，細胞外的支原體以及

22、附著在細胞上的支原體被染成深黃色到橙色。600倍放大后的合并圖片。 6.宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)支原體膜蛋白是很重要的，因為他們直接與宿主免疫系統(tǒng)接觸，牛支原體-宿主細胞相互作用似乎取決于細胞類型或外周血單核細胞（PBMCs）子集。Vander Merwe和合作伙伴觀察到在T細胞、輔助T細胞、細胞毒素T細胞、自然殺傷性細胞及T細胞中存在FN-誘導(dǎo)，而在單核細胞、樹狀細胞、B細胞并不存在IFN-誘導(dǎo)。關(guān)于牛支原體引誘外周血單核細胞（PBMCs）的細胞凋亡也一直存在爭議。在實驗條件下，牛支原體誘導(dǎo)淋巴細胞細胞凋亡已被報道。然而在另一項研究中，牛支原體感染牛單核細胞后延遲細胞凋亡過程也被發(fā)現(xiàn)。此外，有報道

23、指出牛支原體既能夠刺激也能夠抑制宿主免疫系統(tǒng)。免疫刺激似乎是通過巨噬細胞、T細胞、補體激活及細胞因子表達來上調(diào)免疫反應(yīng)。免疫抑制可能是由抗炎性細胞因子的表達或者趨化因子如白介素10（IL-10）以及抑制促炎性細胞因子的表達如IFN-或者IFN-。IL10之后調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)生輔助性T細胞Th2，導(dǎo)致產(chǎn)生大量的IgG1，起到免疫調(diào)理和免疫反應(yīng)的作用。作為一種替代途徑，抑制宿主免疫應(yīng)答也可以通過抑制淋巴細胞增殖、支原體淋巴細胞抑制性蛋白的生成、干擾淋巴細胞增殖對植物凝集素的反應(yīng)來實現(xiàn)的。因此抑制宿主免疫系統(tǒng)是通過下調(diào)淋巴細胞的增殖，他們的細胞因子表達并沒有改變。牛支原體限制宿主免疫應(yīng)答的另一個

24、方法是結(jié)合中性粒細胞，從而抑制它們的呼吸爆炸。在感染的小牛體內(nèi)，能夠觀察到宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)隨著牛支原體在宿主體內(nèi)長期生存與全身擴散而改變。7.菌膜的生成以及次級代謝物菌膜有助于細菌在環(huán)境中持續(xù)的生存以及在宿主體內(nèi)造成慢性長期的疾病，此外，菌膜也能夠在吞噬細胞被吸引募集并釋放溶酶體酶、活性氧以及形態(tài)氮（ROS和RNS）后增加對宿主組織的傷害，而且吞噬細胞在這種條件下效率也非常低下。幾種支原體包括牛支原體在內(nèi)所產(chǎn)生的菌膜獨立于它們的致病性之外。支原體被觀察到粘附到載玻片上之后首先生成菌膜，這顯示出支原體粘附宿主細胞是必要的。不同的支原體菌膜的生長程度也有所差異，這與不同的分子類型及Vsp結(jié)構(gòu)相關(guān)。由于Vsps參與粘附，某一Vsp模型可能具有不同的粘附能力，導(dǎo)致生成菌膜的能力多樣。菌膜的生成有助于細菌抵抗環(huán)境因素及宿主的防御系統(tǒng)。的確，牛支原體菌膜的生成有助于提高他們對高溫和干燥的耐受能力，增加它們對環(huán)