宏基因組技術在開發(fā)未培養(yǎng)環(huán)境微生物基因資源中的應用

1、宏基因組技術在開發(fā)未培養(yǎng)環(huán)境微生物基因資源中的應用周雙摘要 ：環(huán)境微生物宏基因組是一個巨大的基因資源庫,而人類對自然環(huán)境中約 99% 的微生物不能用傳統(tǒng)的方法進行純培養(yǎng)，因此,未培養(yǎng)微生物的基因資源開發(fā)利用受到限制。宏基因組技術直接提取環(huán)境樣品總 DNA, 避開了微生物分離培養(yǎng)的問題 ,極大擴展了微生物資源的 利用空間。本文介紹了宏基因組的概念、研究方法包括 DNA 提取、文庫構建與篩選等及在 定向篩選抗生素產生菌方面的應用。關鍵詞 ：宏基 因組 ;未培養(yǎng)微生物；基因篩選Application of metagenomic technique in the exploring of uncul

2、turedEnvironmental microbial gene resourceZhou ShuangAbstract: Microbialmetagenome is the largest gene reservoir in environment. It is known that about 99% microorganisms in natural environment couldn t be obtained their pure culture by traditional culture methods. Therefore, exploring uncultured mi

3、crobial gene resource has been restricted. Metagenome libraries can be constructed by directly extracting DNA from environmental samples to avoid the limitations of culture dependent methods . Metagenomic technique has greatly enhanced the utilization of microbial resource. The notion and methods of

4、 study in m etagenome, including DNA extracting , libraries construction and screening, and application of metagenomic technique in the screening certain antibiotic microorganism producing strains were introduced in this paper.Keywords: Metagenome; Uncultured microorganisms; Gene screening微生物世界是分子多樣

5、性最大的天然資源庫， 基于菌株水平的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術為人們認識微生物多樣性提供了可能， 但是傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法限制了認識 微生物世界的視野。目前已知的微生物資源種類僅占實有總數(shù)的1% 10%，自然環(huán)境中超過 99%的微生物不能用傳統(tǒng)的方法進行純培養(yǎng) 1 ，因而也不能對它 們開展依賴于純培養(yǎng)的生物技術或基礎方面的研究。 近年來發(fā)展起來的宏基因組 學技術，它是通過直接提取特定環(huán)境中全部微生物的總基因組 DNA 并克隆到適 宜的微生物宿主中， 然后篩選出目的克隆與基因的方法。 利用分子生物學的研究 方法繞過純培養(yǎng)技術來研究微生物的多樣性及功能， 提供了一種探知微生物多樣 性結構和功能基因組的免培方法

6、，是一條尋找新基因及其產物的新途徑。微生物藥物合成菌的定向篩選是指從眾多的微生物菌種中篩選特定次生代 謝產物產生菌的篩選方法。 該方法目前多采用傳統(tǒng)的藥物篩選策略， 從產生菌的 種類、形態(tài)特征并結合目標化合物的活性進行篩選。 已有的研究證實微生物次級 代謝產物生物合成基因具有呈簇排列的特征，即與特定產物合成相關的結構基 因、調節(jié)基因、耐藥性基因和轉運蛋白等集中位于染色體的一段連續(xù)區(qū)域2 。經過科學家的努力， 大量各類抗生素合成基因簇也得到了深入的研究， 如聚酮類化 合物的聚酮類化合物合成酶(PKS)生物合成基因簇3，井岡霉素生物合成基因簇4 ，南昌霉素生物合成基因簇 4等等。這為微生物次級代謝

7、產物藥物的研究打下 了堅實的基礎。本研究結合土壤宏基因組技術和抗生素生物合成基因簇的研究結 果，建立了一種快速從土壤環(huán)境中篩選特定類型抗生素合成菌的現(xiàn)代分子生物學 篩選方法。1、宏基因組學的發(fā)展歷史宏基因組 ( metagenome) 是由 Handelsman 等5 提出的新名詞， 其定義為 the gen omes of the total microbiota fou nd in nature即生境中全部微小生物遺傳物質的 總和。它包含了可培養(yǎng)的和未可培養(yǎng)的微生物的基因， 避開了微生物分離培養(yǎng)的 問題，極大地擴展了微生物資源的利用空間。 目前主要指環(huán)境樣品中的細菌和真 菌的基因組總和，

8、也可指特定環(huán)境或共生體內所有生物遺傳物質的總和， 是一種 不依賴于人工培養(yǎng)的微生物基因組分析技術。 而所謂宏基因組學 ( metagenomics) 就是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象， 以功能基因篩選和測序 分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協(xié)作 關系及與環(huán)境之間的關系為研究目的的新的微生物研究方法。2、宏基因組技術研究方法2.1 環(huán)境樣品及目的基因 /基因組富集在宏基因組文庫篩選過程中， 目的基因僅占總 DNA 的一小部分， 對環(huán)境樣 品的預富集可以大大提高目的基因的檢出幾率。 預富集技術包括細胞水平富集和 基因/基因組水平富集。2.1.1 樣

9、品和培養(yǎng)物富集可以根據細胞大小不同的特性 ,采用過濾技術有效對宏基因組進行富集， 利用 選擇培養(yǎng)基對目的微生物進行富集培養(yǎng) , 也是有效的富集手段之一 ,其中最常用 的方法是底物選擇 ,此外還包括營養(yǎng)選擇以及物理化學指標選擇。但是,由于富集培養(yǎng)選擇性地富集了具有快速生長特性的菌群 , 因此導致大部分物種多樣性信 息丟失。通過先在嚴格脅迫條件下短期處理 ,然后改為較溫和的處理條件 , 可以從 一定程度上克服這種方法的局限性。2.1.2 基因組和基因的富集 通過基因組富集可以富集微生物種群中最活躍的部分，如穩(wěn)定同位素探針 技術、 抑制性消減雜交技術、差異顯示技術、用噬菌體展示6 、親和捕獲 7及

10、DNA 微陣列 8 等技術可以對基因 （組 ）進行預富集。2.2 樣品總 DNA 提取樣品總 DNA 的提取方法有直接提取法 9與間接提取法 10。直接提取法是將 樣品直接懸浮于裂解緩沖液中， 然后再提取。此方法簡便， 成本較低，但由于機 械損傷較大， 因而所獲得的片段較??； 間接提取法是采用較溫和的方法， 將分離 出來的菌體用低熔點瓊脂糖等包埋來進行 DNA 的提取。 該方法可以獲得片段 較大的 DNA ，但是成本高，可能會在微生物分離時有丟失的現(xiàn)象。2.3 宏基 因組 DNA/cDNA 文庫的構建2.3.1 載體的選擇載體選擇的原則是有利于目的基因的擴增、 表達及在篩選細胞毒類物質時表 達

11、量的調控等等。細菌人工染色體（BAC）和柯斯質粒（Cosmid）是目前構建宏基因 組文庫常用的載體，前者插入的片段大（可達350kb）,但克隆效率低，后者插入的片 段較?。s為2040kb）,但克隆效率較高。很多微生物活性物質是其次生代謝產 物，代謝途徑由多基因簇調控， 因此需要盡量插入大片段 DNA 以獲得完整的代 謝途徑。Fosmid載體的插入片段與 Cosmid相當?shù)獸osmid插入片段在E. coli中 的克隆效率和穩(wěn)定性更高 11。 BAC 和 Cosmid 載體在宿主細胞中的拷貝數(shù)低 ,基 因擴大表達存在一定困難，為了提高宏基因的表達,便于重組克隆子活性檢測 ,可 以直接利用表達載

12、體構建宏基因組文庫。 表達載體可插入的宏基因片段一般小于10 kb,適合于篩選單基因或小操縱子產物。2.3.2 宿主的選擇宿主菌株的選擇主要考慮轉化效率、 重組載體在宿主細胞中的穩(wěn)定性、 宏基 因的表達、 目標性狀 （如抗菌性 ） 及缺陷型等因素。 E.coli 是最為常用的宿主,此 外,鏈霉菌和假單胞菌也可以作為構建文庫的宿主 1214 。研究經驗表明 ,不同微 生物種類所產生的活性物質有明顯差異,不同的研究目標應選擇不同的宿主菌 株。2.3.2 宏基 因組 cDNA 文庫 （轉錄庫 ）構建一直以來,對 cDNA 克隆文庫的大規(guī)模測序是發(fā)現(xiàn)新真核基因的一種快速 方法,但由于真核生物基因組存在

13、內含子序列, 因此宏基因組表達庫技術往往并 不適合開發(fā)真核基因資源 15 。此外,在操作上也存在一些需要解決的問題,首 先,完整宏基因組 mRNA 的提取十分困難；其次,由于宏基因組 cDNA 文庫不 包括非表達基因，因此所包含的信息不如基因組文庫全面；此外， RT-PCR擴增 限制了插入子的大小,并且使文庫具有較強的序列偏倚性 16 。2.4 宏基因組文庫測序和拼接純培養(yǎng)微生物基因組 DNA 的測序分析技術已比較成熟，為完整宏基因組測 序和最終開發(fā)新的基因資源奠定了堅實的基礎 16,17。近年來 ,隨著自動化高通量 測序設備和強大序列分析軟件的開發(fā)，使完整宏基因組測序具備了技術可行性。 但是

14、，完整宏基因組測序任務仍十分繁雜，因此 ,昂貴的費用和繁冗的工作成為 限制宏基因組測序技術應用的主要原因。2.5 宏基 因組文庫的篩選由于環(huán)境樣品中微生物種類繁多， 宏基因組文庫容量一般較大， 活性克隆子 的篩選成為開發(fā)新活性物質資源的瓶頸。近年來，根據研究目的不同 ,相繼報道 了各種宏基因組文庫篩選方法。 根據是否依賴已知序列信息， 大致可以分為兩大 類，即序列依賴性篩選和非序列依賴性篩選。如我們常見的反轉錄 P C R、 DNA 微陣技術、親和捕獲等技術的應用3、宏基因組技術在定向篩選抗生素產生菌方面的應用自從1991年Pace等首次構建了海洋微小浮游生物環(huán)境 DNA文庫以來，目 前已構建

15、了土壤、 海洋、人唾液、 堆肥樣品等環(huán)境樣品的宏基因組文庫。 為了快 速從土壤中定向篩選抗生素產生菌， 利用宏基因組技術進行了土壤中抗生素產生菌快速篩選方法的探索。如要得到土壤中 Herbimycin 產生菌時，可根據微生物 抗生素 Herbimycin 合成基因簇設計引物進行 PCR 擴增，從而快速定向篩選土壤 中 Herbimycin 抗生素產生菌。并從陽性土樣中分離純化該產生菌并進行培養(yǎng) , 通過對該菌代謝產物進行高效液相色譜分析從而最終確認特定抗生素產生菌。 不 同抗生素的產生菌的篩選其要旨就是根據不同微生物抗生素合成基因簇設計不 同的引物而其篩選方法基本一致。4、結語宏基因組克隆充分

16、運用前沿分子生物學技術， 不依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法發(fā)掘豐 富的微生物資源 , 同時也是一種基因資源的保存形式。但是，正如上文所述，宏 基因組技術還存在諸多問題亟待解決。 不管怎樣， 隨著研究方法的不斷進步和創(chuàng) 新 , 宏基因組技術在微生物資源的開發(fā)利用上無疑能夠發(fā)揮巨大的潛力。我國地域遼闊，蘊藏著豐富的微生物資源 ,但是應用宏基因組技術開發(fā)環(huán)境微生物資源 的研究才剛剛起步 18,19，許多新的技術方法還有待建立和不斷完善。參考文獻1 Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. Phylogenetic identification and in situ detection

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