宏基因組技術(shù)在開(kāi)發(fā)未培養(yǎng)環(huán)境微生物基因資源中的應(yīng)用

1、宏基因組技術(shù)在開(kāi)發(fā)未培養(yǎng)環(huán)境微生物基因資源中的應(yīng)用周雙摘要 ：環(huán)境微生物宏基因組是一個(gè)巨大的基因資源庫(kù),而人類對(duì)自然環(huán)境中約 99% 的微生物不能用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行純培養(yǎng)，因此,未培養(yǎng)微生物的基因資源開(kāi)發(fā)利用受到限制。宏基因組技術(shù)直接提取環(huán)境樣品總 DNA, 避開(kāi)了微生物分離培養(yǎng)的問(wèn)題 ,極大擴(kuò)展了微生物資源的 利用空間。本文介紹了宏基因組的概念、研究方法包括 DNA 提取、文庫(kù)構(gòu)建與篩選等及在 定向篩選抗生素產(chǎn)生菌方面的應(yīng)用。關(guān)鍵詞 ：宏基 因組 ;未培養(yǎng)微生物；基因篩選Application of metagenomic technique in the exploring of uncul

2、turedEnvironmental microbial gene resourceZhou ShuangAbstract: Microbialmetagenome is the largest gene reservoir in environment. It is known that about 99% microorganisms in natural environment couldn t be obtained their pure culture by traditional culture methods. Therefore, exploring uncultured mi

3、crobial gene resource has been restricted. Metagenome libraries can be constructed by directly extracting DNA from environmental samples to avoid the limitations of culture dependent methods . Metagenomic technique has greatly enhanced the utilization of microbial resource. The notion and methods of

4、 study in m etagenome, including DNA extracting , libraries construction and screening, and application of metagenomic technique in the screening certain antibiotic microorganism producing strains were introduced in this paper.Keywords: Metagenome; Uncultured microorganisms; Gene screening微生物世界是分子多樣

5、性最大的天然資源庫(kù)， 基于菌株水平的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)為人們認(rèn)識(shí)微生物多樣性提供了可能， 但是傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法限制了認(rèn)識(shí) 微生物世界的視野。目前已知的微生物資源種類僅占實(shí)有總數(shù)的1% 10%，自然環(huán)境中超過(guò) 99%的微生物不能用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行純培養(yǎng) 1 ，因而也不能對(duì)它 們開(kāi)展依賴于純培養(yǎng)的生物技術(shù)或基礎(chǔ)方面的研究。 近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的宏基因組 學(xué)技術(shù)，它是通過(guò)直接提取特定環(huán)境中全部微生物的總基因組 DNA 并克隆到適 宜的微生物宿主中， 然后篩選出目的克隆與基因的方法。 利用分子生物學(xué)的研究 方法繞過(guò)純培養(yǎng)技術(shù)來(lái)研究微生物的多樣性及功能， 提供了一種探知微生物多樣 性結(jié)構(gòu)和功能基因組的免培方法

6、，是一條尋找新基因及其產(chǎn)物的新途徑。微生物藥物合成菌的定向篩選是指從眾多的微生物菌種中篩選特定次生代 謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌的篩選方法。 該方法目前多采用傳統(tǒng)的藥物篩選策略， 從產(chǎn)生菌的 種類、形態(tài)特征并結(jié)合目標(biāo)化合物的活性進(jìn)行篩選。 已有的研究證實(shí)微生物次級(jí) 代謝產(chǎn)物生物合成基因具有呈簇排列的特征，即與特定產(chǎn)物合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基 因、調(diào)節(jié)基因、耐藥性基因和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等集中位于染色體的一段連續(xù)區(qū)域2 。經(jīng)過(guò)科學(xué)家的努力， 大量各類抗生素合成基因簇也得到了深入的研究， 如聚酮類化 合物的聚酮類化合物合成酶(PKS)生物合成基因簇3，井岡霉素生物合成基因簇4 ，南昌霉素生物合成基因簇 4等等。這為微生物次級(jí)代謝

7、產(chǎn)物藥物的研究打下 了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究結(jié)合土壤宏基因組技術(shù)和抗生素生物合成基因簇的研究結(jié) 果，建立了一種快速?gòu)耐寥拉h(huán)境中篩選特定類型抗生素合成菌的現(xiàn)代分子生物學(xué) 篩選方法。1、宏基因組學(xué)的發(fā)展歷史宏基因組 ( metagenome) 是由 Handelsman 等5 提出的新名詞， 其定義為 the gen omes of the total microbiota fou nd in nature即生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的 總和。它包含了可培養(yǎng)的和未可培養(yǎng)的微生物的基因， 避開(kāi)了微生物分離培養(yǎng)的 問(wèn)題，極大地?cái)U(kuò)展了微生物資源的利用空間。 目前主要指環(huán)境樣品中的細(xì)菌和真 菌的基因組總和，

8、也可指特定環(huán)境或共生體內(nèi)所有生物遺傳物質(zhì)的總和， 是一種 不依賴于人工培養(yǎng)的微生物基因組分析技術(shù)。 而所謂宏基因組學(xué) ( metagenomics) 就是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象， 以功能基因篩選和測(cè)序 分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作 關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法。2、宏基因組技術(shù)研究方法2.1 環(huán)境樣品及目的基因 /基因組富集在宏基因組文庫(kù)篩選過(guò)程中， 目的基因僅占總 DNA 的一小部分， 對(duì)環(huán)境樣 品的預(yù)富集可以大大提高目的基因的檢出幾率。 預(yù)富集技術(shù)包括細(xì)胞水平富集和 基因/基因組水平富集。2.1.1 樣

9、品和培養(yǎng)物富集可以根據(jù)細(xì)胞大小不同的特性 ,采用過(guò)濾技術(shù)有效對(duì)宏基因組進(jìn)行富集， 利用 選擇培養(yǎng)基對(duì)目的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng) , 也是有效的富集手段之一 ,其中最常用 的方法是底物選擇 ,此外還包括營(yíng)養(yǎng)選擇以及物理化學(xué)指標(biāo)選擇。但是,由于富集培養(yǎng)選擇性地富集了具有快速生長(zhǎng)特性的菌群 , 因此導(dǎo)致大部分物種多樣性信 息丟失。通過(guò)先在嚴(yán)格脅迫條件下短期處理 ,然后改為較溫和的處理?xiàng)l件 , 可以從 一定程度上克服這種方法的局限性。2.1.2 基因組和基因的富集 通過(guò)基因組富集可以富集微生物種群中最活躍的部分，如穩(wěn)定同位素探針 技術(shù)、 抑制性消減雜交技術(shù)、差異顯示技術(shù)、用噬菌體展示6 、親和捕獲 7及

10、DNA 微陣列 8 等技術(shù)可以對(duì)基因 （組 ）進(jìn)行預(yù)富集。2.2 樣品總 DNA 提取樣品總 DNA 的提取方法有直接提取法 9與間接提取法 10。直接提取法是將 樣品直接懸浮于裂解緩沖液中， 然后再提取。此方法簡(jiǎn)便， 成本較低，但由于機(jī) 械損傷較大， 因而所獲得的片段較?。?間接提取法是采用較溫和的方法， 將分離 出來(lái)的菌體用低熔點(diǎn)瓊脂糖等包埋來(lái)進(jìn)行 DNA 的提取。 該方法可以獲得片段 較大的 DNA ，但是成本高，可能會(huì)在微生物分離時(shí)有丟失的現(xiàn)象。2.3 宏基 因組 DNA/cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建2.3.1 載體的選擇載體選擇的原則是有利于目的基因的擴(kuò)增、 表達(dá)及在篩選細(xì)胞毒類物質(zhì)時(shí)表 達(dá)

11、量的調(diào)控等等。細(xì)菌人工染色體（BAC）和柯斯質(zhì)粒（Cosmid）是目前構(gòu)建宏基因 組文庫(kù)常用的載體，前者插入的片段大（可達(dá)350kb）,但克隆效率低，后者插入的片 段較?。s為2040kb）,但克隆效率較高。很多微生物活性物質(zhì)是其次生代謝產(chǎn) 物，代謝途徑由多基因簇調(diào)控， 因此需要盡量插入大片段 DNA 以獲得完整的代 謝途徑。Fosmid載體的插入片段與 Cosmid相當(dāng)?shù)獸osmid插入片段在E. coli中 的克隆效率和穩(wěn)定性更高 11。 BAC 和 Cosmid 載體在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)低 ,基 因擴(kuò)大表達(dá)存在一定困難，為了提高宏基因的表達(dá),便于重組克隆子活性檢測(cè) ,可 以直接利用表達(dá)載

12、體構(gòu)建宏基因組文庫(kù)。 表達(dá)載體可插入的宏基因片段一般小于10 kb,適合于篩選單基因或小操縱子產(chǎn)物。2.3.2 宿主的選擇宿主菌株的選擇主要考慮轉(zhuǎn)化效率、 重組載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性、 宏基 因的表達(dá)、 目標(biāo)性狀 （如抗菌性 ） 及缺陷型等因素。 E.coli 是最為常用的宿主,此 外,鏈霉菌和假單胞菌也可以作為構(gòu)建文庫(kù)的宿主 1214 。研究經(jīng)驗(yàn)表明 ,不同微 生物種類所產(chǎn)生的活性物質(zhì)有明顯差異,不同的研究目標(biāo)應(yīng)選擇不同的宿主菌 株。2.3.2 宏基 因組 cDNA 文庫(kù) （轉(zhuǎn)錄庫(kù) ）構(gòu)建一直以來(lái),對(duì) cDNA 克隆文庫(kù)的大規(guī)模測(cè)序是發(fā)現(xiàn)新真核基因的一種快速 方法,但由于真核生物基因組存在

13、內(nèi)含子序列, 因此宏基因組表達(dá)庫(kù)技術(shù)往往并 不適合開(kāi)發(fā)真核基因資源 15 。此外,在操作上也存在一些需要解決的問(wèn)題,首 先,完整宏基因組 mRNA 的提取十分困難；其次,由于宏基因組 cDNA 文庫(kù)不 包括非表達(dá)基因，因此所包含的信息不如基因組文庫(kù)全面；此外， RT-PCR擴(kuò)增 限制了插入子的大小,并且使文庫(kù)具有較強(qiáng)的序列偏倚性 16 。2.4 宏基因組文庫(kù)測(cè)序和拼接純培養(yǎng)微生物基因組 DNA 的測(cè)序分析技術(shù)已比較成熟，為完整宏基因組測(cè) 序和最終開(kāi)發(fā)新的基因資源奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ) 16,17。近年來(lái) ,隨著自動(dòng)化高通量 測(cè)序設(shè)備和強(qiáng)大序列分析軟件的開(kāi)發(fā)，使完整宏基因組測(cè)序具備了技術(shù)可行性。 但是

14、，完整宏基因組測(cè)序任務(wù)仍十分繁雜，因此 ,昂貴的費(fèi)用和繁冗的工作成為 限制宏基因組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用的主要原因。2.5 宏基 因組文庫(kù)的篩選由于環(huán)境樣品中微生物種類繁多， 宏基因組文庫(kù)容量一般較大， 活性克隆子 的篩選成為開(kāi)發(fā)新活性物質(zhì)資源的瓶頸。近年來(lái)，根據(jù)研究目的不同 ,相繼報(bào)道 了各種宏基因組文庫(kù)篩選方法。 根據(jù)是否依賴已知序列信息， 大致可以分為兩大 類，即序列依賴性篩選和非序列依賴性篩選。如我們常見(jiàn)的反轉(zhuǎn)錄 P C R、 DNA 微陣技術(shù)、親和捕獲等技術(shù)的應(yīng)用3、宏基因組技術(shù)在定向篩選抗生素產(chǎn)生菌方面的應(yīng)用自從1991年P(guān)ace等首次構(gòu)建了海洋微小浮游生物環(huán)境 DNA文庫(kù)以來(lái)，目 前已構(gòu)建

15、了土壤、 海洋、人唾液、 堆肥樣品等環(huán)境樣品的宏基因組文庫(kù)。 為了快 速?gòu)耐寥乐卸ㄏ蚝Y選抗生素產(chǎn)生菌， 利用宏基因組技術(shù)進(jìn)行了土壤中抗生素產(chǎn)生菌快速篩選方法的探索。如要得到土壤中 Herbimycin 產(chǎn)生菌時(shí)，可根據(jù)微生物 抗生素 Herbimycin 合成基因簇設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，從而快速定向篩選土壤 中 Herbimycin 抗生素產(chǎn)生菌。并從陽(yáng)性土樣中分離純化該產(chǎn)生菌并進(jìn)行培養(yǎng) , 通過(guò)對(duì)該菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜分析從而最終確認(rèn)特定抗生素產(chǎn)生菌。 不 同抗生素的產(chǎn)生菌的篩選其要旨就是根據(jù)不同微生物抗生素合成基因簇設(shè)計(jì)不 同的引物而其篩選方法基本一致。4、結(jié)語(yǔ)宏基因組克隆充分

16、運(yùn)用前沿分子生物學(xué)技術(shù)， 不依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法發(fā)掘豐 富的微生物資源 , 同時(shí)也是一種基因資源的保存形式。但是，正如上文所述，宏 基因組技術(shù)還存在諸多問(wèn)題亟待解決。 不管怎樣， 隨著研究方法的不斷進(jìn)步和創(chuàng) 新 , 宏基因組技術(shù)在微生物資源的開(kāi)發(fā)利用上無(wú)疑能夠發(fā)揮巨大的潛力。我國(guó)地域遼闊，蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源 ,但是應(yīng)用宏基因組技術(shù)開(kāi)發(fā)環(huán)境微生物資源 的研究才剛剛起步 18,19，許多新的技術(shù)方法還有待建立和不斷完善。參考文獻(xiàn)1 Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. Phylogenetic identification and in situ detection

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