香菇菌絲原生質(zhì)體制備與融合條件的研究

1、香菇菌絲原生質(zhì)體制備及融合條件的研究李蕤， 馬守能，劉群， 吳克， 劉斌， 潘仁瑞（合肥聯(lián)合大學(xué)化學(xué)與生物工程系， 安徽 合肥230022 ）摘要： 討論不同菌齡、 酶解時(shí)間、酶解溫度、 滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)香菇原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響。結(jié)果表明，香菇菌絲制備原生質(zhì)體時(shí)最適菌齡為6天， 酶解時(shí)間為3h， 酶解溫度為34c， 滲透壓穩(wěn)定劑用0. 6moi /l甘露醇為最佳。在此基礎(chǔ)上， 以 35%的 peg為融合誘導(dǎo)劑進(jìn)行香菇b01、 l26 種間原生質(zhì)體融合， 并用顯微鏡觀察到融合子的形成。關(guān)鍵詞：香菇； 原生質(zhì)體；融合中圖分類號(hào)：s646文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：a文章編號(hào)：1000- 2162 （2001） 03-

2、 0099- 05!引言目前我國(guó)香菇占有50%以上的國(guó)際市場(chǎng)， 具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此，通過(guò)育種方法提高香菇產(chǎn)量和質(zhì)量是必要的。近30 年來(lái)， 我國(guó)進(jìn)行香菇育種的主要途徑是自然選育和雜交育種。細(xì)胞融合 （即原生質(zhì)體融合） 尚在試驗(yàn)探討階段， 并被證明是一種行之有效的育種新方法1 - 3。優(yōu)良原生質(zhì)體制備條件的選擇是開(kāi)展以原生質(zhì)體為材料育種工作的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)對(duì)香菇原生質(zhì)體制備、融合的影響條件進(jìn)行了研究，為香菇原生質(zhì)體融合育種提供了試驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法 .材料1.1.1供試菌種香菇 b01 菌株、 香菇 l26菌株，均由安徽合肥九0 一食用菌廠提供。1.1.2培養(yǎng)基4、5母種培養(yǎng)基pda： 馬鈴薯

3、 200g； 葡萄糖 20g； 瓊脂 20g ； 水 1000ml液體擴(kuò)大培養(yǎng)基pd：pda去掉瓊脂 .#溶液的配制61.2. 1穩(wěn)定劑0. 6moi /l 甘露醇滲透壓穩(wěn)定劑；0. 6moi /l 蔗糖滲透壓穩(wěn)定劑；0. 6moi /lmgso4滲透壓穩(wěn)定劑。1.2.2緩沖液0. 1moi/l 的檸檬酸溶液； 0. 2moi/l 的 na2hpo4溶液； ph 為 5. 6 的檸檬酸 - na2hpo4緩沖液。1.2.3酶制劑的配制溶壁酶 （ lywaiizyme ）（由廣東微生物研究所生產(chǎn)）： 用 0. 6moi/l 的上述滲透壓穩(wěn)定劑和ph 為 5.6 的檸檬酸- na2hpo4緩沖液等

4、比例混合，配制成濃度為1. 5%收稿日期：2000- 12- 18基金項(xiàng)目：合肥聯(lián)合大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目（200012 ）作者簡(jiǎn)介：李蕤 （1959- ） ， 女， 安徽合肥人，合肥聯(lián)合大學(xué)講師.2001年 9 月第 25卷 第 3 期安徽大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版）journai ofanhui universitynaturaiscienceeditionseptember 2001voi.25 no.3的高滲酶解液， 再用 0.45!m 微孔膜過(guò)濾除菌。1.2.4助 融 劑 的 配 制分 別 稱 取 聚 乙 二 醇 （ peg， 平 均 分 子 量 4000） 3. 5g 和 分 析 純ca

5、ci21.5g于燒杯中，溶解后移入100ml 容量瓶定容， 再用 0. 2moi/l 的三 （羥甲基） 氨基甲烷溶液滴定至p7.0 。1.3方法1. 3.1菌絲的培養(yǎng)和純化用 pda作為母種培養(yǎng)基， 液體擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)， 在 250ml 三角瓶中到入 80mlpd培養(yǎng)基，接種后，在 25c 恒溫培養(yǎng)箱中靜至恒溫培養(yǎng)。用滅過(guò)菌的紗布過(guò)濾收集菌絲，先后用無(wú)菌水、 0. 6moi/l 的滲透壓穩(wěn)定劑多次洗滌，4000r/min 離心 15min， 棄去上清液， 用吸水紙將水分吸干。1.3.2原生質(zhì)體的制備和純化加酶量按菌絲體 （g） 1酶 （ ml）= 118 置于直徑5cm的無(wú)熒光平皿中，輕輕搖散菌絲

6、， 在恒溫培養(yǎng)箱中28 - 34c 酶解 2- 5h， 每 30min 取樣一次， 在倒置顯微鏡下檢查原生質(zhì)體的數(shù)量，最后加入滲透壓穩(wěn)定劑終止反應(yīng)。酶解結(jié)束后， 用 g2沙芯漏斗過(guò)濾脫去殘留的菌絲斷片，濾液 3000r/min 離心 10min。沉淀的原生質(zhì)體用滲透壓穩(wěn)定劑清洗離心兩次以后，并懸浮于高滲營(yíng)養(yǎng)液中，即得純化的原生質(zhì)體， 并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。1.3.3原生質(zhì)體的融合與再生將香菇b01 菌株和l26 菌株的原生質(zhì)體以一定的濃度（至少 1x106個(gè) /ml） 等量混合3000r/min 離心 10min， 去上清液， 并加入35% 的助溶劑， 于25c 保溫 30min， 再離心去掉上

7、清液， 沉淀用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌幾次以除去peg.最后的沉淀經(jīng)適當(dāng)稀釋后， 置再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 使融合子得以再生。!實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論! .香菇菌絲菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備率的影響實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)香菇菌絲菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備率的影響較大。其結(jié)果如圖1 所示，從圖 1 中可見(jiàn)，香菇 b01 菌株培養(yǎng) 6d 的菌絲菌齡， 其原生質(zhì)體釋放率最高，而香菇 l26 菌株培養(yǎng) 5d 的菌齡最佳。因此， 在原生質(zhì)體的制備過(guò)程中菌絲菌齡過(guò)大或過(guò)小都將影響原生質(zhì)體的制備量。一般以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的幼嫩菌絲酶解制備原生質(zhì)體效果最好。圖 1香菇菌絲菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備率的影響注： 以上數(shù)據(jù)均是在34c ， p5.6 ， 以 0.6moi

8、 /l 甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑，1.5% 溶壁酶，酶解 2.5h 所得結(jié)果。001安徽大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）第 25 卷! .!酶解時(shí)間對(duì)香菇原生質(zhì)體制備率的影響將菌絲放在直徑5cm的無(wú)熒光平皿中， 做酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備率的影響，并置于倒置顯微鏡下觀察， 并隨時(shí)測(cè)原生質(zhì)體數(shù)。如圖2 所示。圖2酶解時(shí)間對(duì)香菇原生質(zhì)體制備率的影響注： 在 34c ， ph5.6 下， o.6moi/l 甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑，l. 5% 溶壁酶，在不同酶解時(shí)間所測(cè)得的原生質(zhì)體數(shù)。圖2中結(jié)果表明， 香菇bol原生質(zhì)體制備率3h達(dá)最大值；l26菌株2. 5h即達(dá)最大值。之后隨時(shí)間的增加原生質(zhì)體制備率皆不增加。這是香菇

9、菌絲在一定時(shí)間內(nèi)已得到充分酶解， 而繼續(xù)酶解， 不但不能增加原生質(zhì)體的數(shù)目，反而造成原生質(zhì)體的溶解，使原生質(zhì)體數(shù)目減少。從圖3、 圖 4 中可見(jiàn)，酶解 lh 的菌絲體酶解液中已產(chǎn)生一定量的原生質(zhì)體，但酶解液中仍有許多未被酶解的菌絲。當(dāng)酶解3h 后的原生質(zhì)體數(shù)量明顯增多，此時(shí)經(jīng)純化得大量原生質(zhì)體。圖 4香菇菌絲原生質(zhì)體圖 3酶解中的香菇菌絲! .酶解溫度對(duì)香菇原生質(zhì)體制備率的影響為了便于對(duì)酶解的觀察，同時(shí)對(duì)原生質(zhì)體數(shù)量進(jìn)行測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)在直徑5cm的無(wú)熒光平皿中進(jìn)行。因此用恒溫培養(yǎng)箱來(lái)對(duì)溫度進(jìn)行控制。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表l 所示。l ol第 3 期李蕤， 等： 香茹菌絲原生質(zhì)體制備及融合條件的研究表 i酶

10、解溫度對(duì)香菇原生質(zhì)體制備率的影響數(shù)據(jù)表（單位： i07個(gè) /ml）菌株28c30c32c34c36cb0i3.756.036.647.7i4.32l264.456.788.387.354.70實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 香菇 b0i 菌株在 34c 時(shí)酶解制得原生質(zhì)體數(shù)最多，l26菌株在 32c 時(shí)酶解制備最高。另外從表i 數(shù)據(jù)中可以看出酶解溫度控制在30 - 34c 對(duì)香菇 b0i、 l26 菌株制備原生質(zhì)體的影響不太大。! .滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)香菇原生質(zhì)制備率的影響滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)細(xì)胞壁溶解酶活性有調(diào)節(jié)作用，另外對(duì)生成的原生質(zhì)體有一種穩(wěn)定和保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)分別稱取0. 075g溶壁酶，配制成三種不同的高滲酶

11、解液，在34c，ph為5.6 下， 酶解 2.5h， 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2。表 2滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)香菇原生質(zhì)制備得率的影響（單位： i07個(gè) /ml）菌株0.6moi/l 甘露醇0.6moi/l 硫酸鎂0.6moi/l 蔗糖b0i2.6i3.55i.27l264.322.23i.i5從表 2 的結(jié)果可以看出， 0.6moi/l 的蔗糖滲透壓穩(wěn)定劑在制備香菇原生質(zhì)體時(shí)不適合，香菇 b0i 、 l26 菌株菌絲制備原生質(zhì)體時(shí)分別用0.6moi/l 硫酸鎂和甘露醇作滲透壓穩(wěn)定劑，其制備率最高。! .#香菇原生質(zhì)體融合顯微觀察用 i.3.3方法進(jìn)行香菇b0i 菌株與 l26 菌株原生質(zhì)體種間的融合；對(duì)融合子形

12、成進(jìn)行顯微觀察，其顯微照片如圖5 所示。圖 5香菇原生質(zhì)體的種間融合子從圖 5 中可見(jiàn)，香菇種間原生質(zhì)體經(jīng)peg促融后，在 ca2+存在下，香菇 b0i、 l26的原生質(zhì)體倆倆吸附、 融合、 形成八字形， 最終形成融合子。20i安徽大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）第 25 卷參考文獻(xiàn)：1 劉振岳 . 平菇與香菇融合子的綜合鑒定j . 食用菌， 1994 ， （4） ： 5 - 6.2 劉振欽 .平菇和榆黃蘑原生質(zhì)體分離與融合的研究j .食用菌，1996 ， （1） ： 13- 14.3 賀建超 .側(cè)耳屬種間原生質(zhì)體融合的研究j .食用菌，1995 ，（2） ： 11- 12.4 楊新美 . 食用菌研究法

13、m .北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 1998 ， 200 217.5 崔文留 . 香菇的原生質(zhì)體融合育種技術(shù)j .食用菌， 2000，（1） ： 11- 12.6 李 剛 . 靈芝原生質(zhì)體分離與再生研究j . 菌物系統(tǒng)，1999 ， 18 （1） ： 79- 88.studies on the preparation and fusionof protoplast from lentinula edodeshyphaeli rui， ma shou- neng， liu oun， wu ke， liu bin， pan ren- rui（the chemistryandbiotechnoiogyd

14、epartmentofhefei unionuniversity ，hefei230022 ， china ）abstract： the infiuence ofdifferent ceii age ，enzymoiysis time，temperatureandosmotic pressurestabiiizeronproductiverate ofprotopiast fromlentinula edodeswerediscussedin this paper. it is thebestconditions ofpreparingprotopiast with lentinula edo

15、des hyphaethatceii agewas6 days ，thaten-zymoiysis time was3 hours ，that enzymoiysis temperaturewas34c and that concentration ofmannitoias osmotic pressurestabiiizerwas0.6moi/i. in addition ，the protopiast fromlentinula edodes b01andl26 werefusedwith 35% poiyetiyienegiycoi（peg）soiution asfusioninduce

16、rand formation offusantwasobserved underthe microscope.key words： lentinula edodes ； protopiast； fusion301第 3 期李蕤， 等： 香茹菌絲原生質(zhì)體制備及融合條件的研究香菇菌絲原生質(zhì)體制備及融合條件的研究作者：李蕤， 馬守能， 劉群， 吳克， 劉斌， 潘仁瑞作者單位：合肥聯(lián)合大學(xué)刊名：安徽大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)英文刊名：journal of anhui university年，卷(期)：2001,25(3)被引用次數(shù)：4次參考文獻(xiàn)(6條)1. 劉振岳 平菇與香菇融合子的綜合鑒定 1994(0

17、4)2. 劉振欽 平菇和榆黃蘑原生質(zhì)體分離與融合的研究 1996(01)3. 賀建超 側(cè)耳屬種間原生質(zhì)體融合的研究 1995(02)4. 楊新美 食用菌研究法 19985. 崔文留 香菇的原生質(zhì)體融合育種技術(shù) 2000(01)6. 李剛 靈芝原生質(zhì)體分離與再生研究 1999(01)本文讀者也讀過(guò)(10條)1. 焦海濤 . 楊先新 . 周偉. 王群. 張順凱 . 羅信昌 香菇原生質(zhì)體單核體雜交方法試驗(yàn)期刊論文-中國(guó)食用菌 2002,21(6)2. 楊土鳳 . 王立洪 . 楊濤. 龍章富. yang tu-feng . wang li-hong . yang tao . long zhang-fu

18、平菇與香菇原生質(zhì)體融合新菌株的生物學(xué)特性研究期刊論文-四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）2010,47(1)3. 鮑大鵬 . 譚琦. 吳國(guó)富. 潘迎捷 香菇孢子單核體原生質(zhì)體的制備和再生的研究期刊論文-中國(guó)食用菌2000,19(6)4. 甘炳成 . 唐家蓉 . 彭衛(wèi)紅. 郭勇. 謝麗源. 肖在勤. gan bing-cheng. tang jia-rong . peng wei-hong .guo yong . xie li-yuan . xiao zai-qin香菇單核原生質(zhì)體雜交菌株 jw 系列的選育研究期刊論文-西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2006,19(3)5. 付成 香菇優(yōu)良雜交菌株初步篩選及其雜交群體遺傳分析學(xué)位論文20096. 王澄澈 . 梁枝榮 . 苗艷芳. wang cheng-che . liang zhi-rong . miao yan-fang香菇原生質(zhì)體誘變育種初報(bào) 期刊論文-西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2