質粒DNA轉染注意事項

1、精華質粒DNA專染注意事項：聚焦轉染專輯終結篇（中）【字體：大 中 小】 時間：2005年08月19日來源：生物通一、質粒的構建：啟動子的選擇啟動子的選擇對丁轉染基因的有效表達是非常重要的。對丁轉染過程本 身雖然無甚影響，但是對轉染結果卻有著微妙的影響。啟動子可分為2大類：誘導型啟動子是比較精明的，平時歇著，一旦接 到誘導信號指示就馬上開工干活兒。而組成型啟動子比較老實的，就是從頭 到尾不停干活從不閑著的那種一一比如我們很熟悉的CMW動子啊，SV40I阿，pMC1阿，PGK0動子啊等等。獲得高轉染活性所需選擇的啟動子依賴丁選用的細胞系和要表達的蛋白。CM0動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活

2、性。在BHK-21中，CMV啟動子活性比其他啟動子如SV40和RSVO要高。但這三種病蠹啟動子在T細 胞來源的細胞系，如Jurkat中組成表達水平較低。轉染后在培養(yǎng)基中加入 PHA-L和PM/W以激活Jurkat細胞中CMW動子，而單PM堿足以激活KG1 和K562 （人骨髓瘤白細胞）中的 CM0動子。SV40啟動子的表達在含有大T 抗原（存在丁 COS-1和COS-7時會提高，因為大T抗原可以刺激染色體外 的合成。一個強悍的高表達組成型啟動子是我們做表達所求之不得的，但是對丁 轉染本身來說卻不一定好一一因為任何持續(xù)過高表達外源基因都可能帶來某 種程度的細胞蠹性，影響細胞生長 如果外源基因本身

3、對細胞生長有蠹， 那更完蛋了，你很可能篩不到轉染成功的細胞株，更別提穩(wěn)定轉染了一一因 為過量表達本身可能已經(jīng)害死了那個轉染了的細胞，沒轉染的細胞乂死丁篩 選壓力。這種時候一個不那么“能干”的啟動子可能更適合一些。如果你曾 經(jīng)遇到原因不明的轉染失敗案例，會不會是這個原因呢？過猶不及就是這個 道理咯。誘導型啟動子對于轉染來說，特別是穩(wěn)定轉染，可能是更好的選擇。它 使得目的基因的表達可以受到我們的調(diào)控一一轉染的時候不表達，篩選穩(wěn)定 表達株后再誘導表達，使得表達有蠹性的基因或者精確分析表達產(chǎn)物的生物 學效應成為可能。多數(shù)誘導型啟動子在接受某種信號后“打開開關”開始工 作，也有的相反，在缺失某種信號后打

4、開開關。Clontech還有個誘導系統(tǒng)是“劑量依賴的”，就是說不單表達開關可控，表達量多少也可以通過誘導劑 的量來調(diào)控。還有一種特殊的啟動子很好玩 具有時序性或者組織特異性（空間特異性），會受到特定的元件調(diào)控，在一定的時間或者特定組織細胞 中表達的，比如那個轉基因山羊奶里用的只在泌乳期的乳腺細胞中表達的啟 動子一一有人說這是組成型的，我覺得應該是誘導型的，只不過誘導的因素 我們不知道罷了，這類啟動子在不同的細胞中會有不同的表現(xiàn)，需要注意。 誘導系統(tǒng)的問題主要是本底表達，表達量有限，以及誘導劑本身對細胞的影 響和如何活除，不過這些都不關轉染的事，我們等生物通的表達專輯時再慢 慢說吧。轉染DN卸啟

5、動子-增強子如果不被宿主細胞識別也會產(chǎn)生無法表達的“悲劇”，這是實驗設計時需要注意的問題。不過現(xiàn)在利用現(xiàn)成試劑盒或者 模擬國外已經(jīng)成功的實驗的居多，獨立構建表達系統(tǒng)的極少，因而這種問題 遇到的幾率也幾乎可以忽略不計。目的基因：這個對于研究人員來說是目的，因而沒有選擇的余地。如果你的 目的基因正好會影響選定細胞株的生長，甚至有蠹，那最好選擇一個誘導型 的啟動子，不然你可能總是轉染不了。但是通常在實驗之前我們不活楚我們 研究的基因產(chǎn)物是否對選定的細胞有蠹，所以正負對照很重要。當排除其他 原因后轉染總是失敗，應當從根本上考慮原因。二、質粒的大小和質量線性化還是超螺旋會影響轉染結果：超螺旋質粒的轉染效

6、率比線性DNA®得多，特別是瞬時轉染。而線性化 DNA專染的整合幾 率高。質粒太大了轉染會困難一些。畢竟，相對致密、較小的外源異物被細 胞內(nèi)吞的幾率要大一些。如果你的質粒正好比較大，乂沒有經(jīng)驗，選擇特別 注明可以轉大質粒的轉染試劑成功幾率會高一些。有的轉染試劑還會提供一 些促進DN堿聚的成分，使得DN戒成轉染復合物時更致密一些，更容易轉 染一些。純化質粒的質量無疑會影響轉染效率。哺乳動物細胞總歸是比大腸桿菌嬌氣， 轉染難度高些，因而要求的DNA屯度要更高些。早年要做轉染真是大陣仗啊， 光是提質粒做超離就令人皺眉。最令人頭疼的是內(nèi)蠹素了。內(nèi)蠹素是革蘭氏 陰性菌細胞壁上特有的成分，主要是

7、脂多糖中的類脂A（lipopolysaccharides ）,在細菌被裂解時被釋放出來，由于其化學結構和 特性，在質粒提取的過程中內(nèi)蠹素很容易混入質粒DNA中共同純化出來。內(nèi)蠹素的存在會嚴重地影響轉染效率，此外內(nèi)蠹素可能會激活造血細胞（例如 B細胞、巨嗜細胞等）的非特異免疫反應，造成實驗中的假陽性。所以質粒 DNA專染時應盡量采用無內(nèi)蠹素污染的超純質粒。幸好技術的進步令復雜的 操作成為過去，多數(shù)實驗室會選擇使用轉染級別的質粒純化試劑盒純化的質 粒來轉染。對于一些“耐受性高、容易操作的”細胞株，普通的 Kit已經(jīng)夠 了。對于一些對內(nèi)蠹素特別敏感的細胞， 就要用“去內(nèi)蠹素”的質粒純化 Kit 了o

8、 Qiagen的Endofree系歹0可以得到相當于2次CsCl超速離心純度的質粒， 同時特別設計去除內(nèi)蠹素，專為最嬌氣的細胞系轉染和體內(nèi) DNAffilS而設計。 此外現(xiàn)在Invitrogen 和Stratagene都有一些快速純化質粒同時也去內(nèi)蠹素 的Kit ,使得去除質粒中的內(nèi)蠹素更為簡便（參考生物通質粒純化專輯）。質粒DNA勺濃度和量：既然質粒純化已經(jīng)不成問題，初學者通常都不會在乎 甚至愿意多加點DNA但是要注意的是，DNA*過少固然轉染效率不高，DNA 量過多同樣會降低轉染效率。有的初學者習慣按照說明書123地去操作而不求其解，你“知其然”是否還“知其所以然”呢？DNA轉染試劑的比例的優(yōu)化是非常重要的，特別是對于陽離子脂質體、多胺等帶電荷的轉染試劑來說， DNA轉染復合物所帶的凈電荷是由轉染試劑和 DNA勺比例決定的，而轉染復合物是否能更好地結合到帶負電的細胞膜上，很大程度取決于這個凈電荷。所以預實驗需要按照說明書的要求，按一定比例混合適量的質粒DN府日轉染試劑。有的轉染試劑要求DNA勺量多些，有的轉染試劑效率高只要很少DNA比如Effectene只需要常規(guī)五分之一的 DNA所以轉染前最