脂聯(lián)素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞CD55和CD59表達的影響

1、脂聯(lián)素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞CD55和CD59表達的影響【摘要】 目的 觀察脂聯(lián)素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞補體調(diào)節(jié)蛋白CD55和CD59表達的影響。方法 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞；分為空白對照組、C反應(yīng)蛋白（CRP）組和脂聯(lián)素組，人臍靜脈內(nèi)皮細胞分別與50 g/ml的CRP和25 g/ml的脂聯(lián)素共同孵育48 h，流式細胞儀檢測CD55和CD59的表達。結(jié)果 CRP刺激后CD55平均熒光強度、CD59平均熒光強度和CD55陽性百分率較空白對照組升高（3.84±0.21比2.81±0.06，P0.001；69.72±4.48比51.15±7.86，P0.01；98.

2、30±1.13比93.57±1.18，P0.001)；脂聯(lián)素刺激后CD59平均熒光強度和CD55陽性百分率較空白對照組升高（63.02±4.90比51.15±7.86，P0.05；96.55±0.66比93.57±1.18，P0.01）。結(jié)論 脂聯(lián)素是人臍靜脈內(nèi)皮細胞CD55和CD59表達的上調(diào)因素，并可能通過上調(diào)內(nèi)皮細胞CD55和CD59的表達發(fā)揮抗炎、抗動脈粥樣硬化作用。 【關(guān)鍵詞】 脂聯(lián)素；補體調(diào)節(jié)蛋白；動脈粥樣硬化脂聯(lián)素是脂肪細胞分泌的特異性脂肪細胞因子，有調(diào)解糖脂代謝及抗動脈粥樣硬化特性。C反應(yīng)蛋白(CRP)可激活補體經(jīng)典路

3、徑并有促動脈粥樣硬化作用。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥患者外周血淋巴細胞 CD55、CD59 表達下調(diào)1；CD55 陽性淋巴細胞平均熒光強度與腰圍、腰臀比和 CRP 負相關(guān)2，與脂聯(lián)素正相關(guān)3，這提示脂肪細胞因子和炎癥狀態(tài)很可能影響補體調(diào)節(jié)蛋白表達。本研究通過體外實驗揭示 CRP 和脂聯(lián)素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞株（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）補體調(diào)節(jié)蛋白表達的影響，探討補體調(diào)節(jié)蛋白表達的調(diào)節(jié)機制及脂聯(lián)素抗動脈粥樣硬化的新機制。2 / 101 材料與方法1.1 材料HUVECs購自中南大學(xué)湘雅細胞庫；重組人脂聯(lián)素球形結(jié)構(gòu)域購自 Bioven

4、dor公司；CRP 購自 Chemicon公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；RPMI1640 購自 Gibco公司；胰酶購自Sigma公司；流式細胞儀為美國Coulter.EPICS.XL；PE標記的CD55單抗購自Ebioscience公司，批號為E025933；PE標記的CD59單抗購自Caltag公司,批號為1380842C。1.2 方法1.2.1 細胞培養(yǎng)HUVECs培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天換液一次，每23天用0.25%的胰酶消化傳代。生長至85%融合時用0.25%胰酶消化、細胞計數(shù)板計數(shù)后均勻接種于24孔細胞培養(yǎng)

5、板備用，接種細胞密度為5×104個/ml。1.2.2 CRP對HUVECsCD55和CD59表達的影響實驗分組：待細胞貼壁后改用含8%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液；按照隨機化原則CRP組重復(fù)5孔，空白對照組重復(fù)5孔；根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果CRP組每孔加入濃度為50 g/ml的CRP，用含5%胎牛血清的RPMI 1640調(diào)至相同體積；兩組細胞在37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進行流式細胞儀檢測。HUVECs CD55和CD59表達的檢測：0.25%胰酶消化后吹打成均勻單細胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄去上清；加入PBS液2 ml，1 500

6、r/min離心5 min，棄上清，如此洗滌2次；留取細胞沉淀加入1 ml PBS液吹打成均勻單細胞懸液；陰性對照管分別加入鼠抗人IgG1和鼠抗人IgG2a 10 l及細胞懸液100 l,標號的樣品管分別加入PE標記的CD55單抗和CD59單抗各10 l及細胞懸液100 l；室溫避光孵育15 min后用2 ml PBS重懸細胞；流式細胞儀分析5 000個細胞，SYSTEM TM軟件分析。1.2.3 脂聯(lián)素對HUVECs CD55和CD59表達的影響實驗分組：待細胞貼壁后改用含8%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液；按照隨機化原則脂聯(lián)素組重復(fù)5孔，空白對照組重復(fù)5孔；根據(jù)預(yù)

7、實驗結(jié)果脂聯(lián)素組每孔加入濃度為25 g/ml的脂聯(lián)素，用含5%胎牛血清的RPMI 1640調(diào)至相同體積；兩組細胞在37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進行流式細胞儀檢測。HUVECs CD55和CD59表達的檢測同上。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS13.0 軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較用單因素方差分析。2 結(jié) 果2.1 CRP對HUVECs CD55和CD59表達的影響50 g/ml的CRP孵育48 h后，HUVECs CD55百分率和空白對照組比較顯著升高(P0.01)；CD59百分率和空白對照組比較統(tǒng)計學(xué)差異無顯著性；CD55平均熒光強度與空白對照組比較顯著升高(P0.0

8、1)；CD59平均熒光強度與空白對照組比較顯著升高(P0.01)，見表1。2.2 脂聯(lián)素對HUVECs CD55和CD59表達的影響25 g/ml的脂聯(lián)素孵育48 h后，HUVECs CD55百分率和空白對照組比較顯著升高(P0.01)；CD59百分率和空白對照組比較統(tǒng)計學(xué)差異無顯著性；CD55平均熒光強度與空白對照組比較統(tǒng)計學(xué)差異無顯著性；CD59平均熒光強度與空白對照組比較顯著升高(P0.05)，見表1。表1 CRP和脂聯(lián)素對HUVEC表面CD55和CD59表達的影響(略)3 討論 CRP是一種主要由肝細胞分泌的炎癥標志物，通過在血管粥樣硬化損傷處趨化單核細胞、誘導(dǎo)單核細胞產(chǎn)生組織因子、誘

9、導(dǎo)內(nèi)皮細胞產(chǎn)生黏附因子及刺激血管平滑肌增生和遷移等多種生物學(xué)作用加速動脈粥樣硬化病灶進展；CRP也通過與C1q的結(jié)合激活經(jīng)典補體活化路徑,產(chǎn)生大量終末復(fù)合物造成血管內(nèi)皮損傷。然而，與它的促炎作用相反，在體外實驗中CRP顯著上調(diào)HUVECs CD55和CD59表達強度及CD55表達百分率，這一上調(diào)作用減少了補體介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞溶解損傷4，提示CRP除了促炎特性外在炎癥反應(yīng)中也維持了血管完整性。CRP在血管壁上促動脈粥樣硬化和抗動脈粥樣硬化的平衡也許對于動脈粥樣硬化的發(fā)展有重要意義。CRP既可以激活補體系統(tǒng)，又通過上調(diào)補體調(diào)節(jié)蛋白表達抑制補體活化，表明CRP對補體活化具有雙向調(diào)節(jié)作用。 脂聯(lián)素能促進

10、脂肪酸氧化和外周葡萄糖攝取及抑制肝糖異生，增加胰島素敏感性；下調(diào)內(nèi)皮細胞黏附分子表達；抑制巨噬細胞吞噬活性及A型清道夫受體表達；調(diào)控內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)。動物實驗發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素基因敲除小鼠動脈受損后內(nèi)膜增生是野生型小鼠的2倍,補充脂聯(lián)素后損傷血管新內(nèi)膜的形成明顯受到抑制5，這些表明脂聯(lián)素有抗動脈粥樣硬化的有益作用。近年研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥患者外周血CD55陽性淋巴細胞表達強度與腰圍、腰臀比呈負相關(guān)2；腰圍、腰臀比反映的是肥胖，肥胖的實質(zhì)是脂肪細胞數(shù)量和/或體積的增加；脂聯(lián)素是脂肪細胞分泌的細胞因子，肥胖患者中其血漿水平降低，并且高脂血癥患者中脂聯(lián)素血漿水平與外周血CD55陽性淋巴細胞表達強度呈正相關(guān)3，提

11、示脂聯(lián)素很可能影響了補體調(diào)節(jié)蛋白的表達。本研究從體外實驗證實了脂聯(lián)素刺激后，HUVECs CD59表達強度和CD55陽性百分率顯著升高；CD55表達強度有上升趨勢，但統(tǒng)計學(xué)差異無顯著性，可能與CD55在細胞膜表面表達后脫落時間比CD59脫落時間早有關(guān)6。脂聯(lián)素在體外直接上調(diào)HUVECs CD59和CD55表達表明脂聯(lián)素是補體調(diào)節(jié)蛋白表達的一個上調(diào)因素。它是否能調(diào)節(jié)其他補體調(diào)節(jié)蛋白表達、其他脂肪細胞因子是否影響補體調(diào)節(jié)蛋白表達及通過哪條信號路徑等問題仍有待于進一步深入研究。脂聯(lián)素對內(nèi)皮細胞CD55和CD59的上調(diào)保護了血管內(nèi)皮免于補體活化介導(dǎo)的損傷，從而產(chǎn)生抗炎、抗動脈粥樣硬化作用，這可能是脂聯(lián)

12、素多種已知抗動脈粥樣硬化特性之外又一抗動脈粥樣硬化的新機制。肥胖是動脈粥樣硬化的危險因素之一，與動脈粥樣硬化之間的具體聯(lián)系仍未闡明，本研究也提示脂肪組織通過補體系統(tǒng)影響了動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。 總之，補體參與了AS的發(fā)生和發(fā)展，補體調(diào)節(jié)蛋白可以抑制補體活化，脂聯(lián)素對CD59表達強度和CD55陽性百分率的上調(diào)表明脂聯(lián)素是CD59和CD55的直接上調(diào)因素，并且這一作用可能是脂聯(lián)素抗炎、抗AS的新機制，這也提示在AS的治療中脂聯(lián)素可能成為一個新的干預(yù)措施。【參考文獻】 1 劉艷英，劉永銘，楊京港，等.高脂血癥患者血清補體C3、C4、備解素和白細胞補體調(diào)節(jié)蛋白CD35、CD55、CD59 的表達J

13、.中國循環(huán)雜志，2005；20(1)：1769.2 劉永銘，何津春，楊京港，等.阿托伐他汀對高脂血癥患者補體調(diào)節(jié)蛋白CD55、CD59 表達的影響J.中華心血管病雜志，2005；33:10759.3 楊正芳，劉永銘，趙 麗，等.高脂血癥中脂聯(lián)素水平與CD55、CD59表達的關(guān)系研究J.中華內(nèi)科雜志，2007；46：490.4 ShuHong Li，Paul E.Richard D,et al.CReactive protein upregulates complementinhibitory factors in endothelial cellsJ.Circulation，2004；109:8336.5 Kubota N，Terauchi Y，Yamauchi T,et al.Disruption of adiponectin causes insulin resistance and neointimal formationJ.J Biol Chem，2002；227:25