天然水蛭素對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝臟結(jié)締組織生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)的影響

1、天然水蛭素對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝臟結(jié)締組織生長(zhǎng)因子 mRNA表達(dá)的影響 作者：賈彥 牛英才 張英博 周麗 董妙先【摘要】 目的觀察水蛭素對(duì)肝纖維化大鼠肝臟組織結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（Connective tissue growth factor, CTGF）mRNA表達(dá)的影響。方法SD大鼠60只隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組和水蛭素組共3組，每組20只，用40%四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）復(fù)制大鼠肝纖維化模型，水蛭素干預(yù)12周后處死大鼠，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠肝組織CTGF mRNA的表達(dá)。結(jié)果模型組CTGF mRNA 2-Ct值（3.59±0.5

2、2）顯著高于正常對(duì)照組（1.02±0.23）(P<0.05)，表明模型組CTGF mRNA表達(dá)上調(diào)。與模型組比較，水蛭素組CTGF mRNA 2-Ct值（1.83±0.34）顯著降低（P<0.05），表明CTGF mRNA表達(dá)下調(diào)。結(jié)論水蛭素可能通過(guò)下調(diào)CTGF mRNA的表達(dá)，抑制肝臟細(xì)胞外基質(zhì)異常增生發(fā)揮抗肝纖維化作用。 【關(guān)鍵詞】 水蛭素； 肝纖維化； 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子； 實(shí)時(shí)熒光定量PCRAbstract：ObjectiveTo observe the effect of hirudin on CTGF mRNA expression i

3、n rat liver in hepatic fibrogenesis induced by carbon tetrachloride (CCl4). MethodsStudies were conducted in 60 male Sprague-Dawley rats, and they were equally randomly divided into 3 groups with 20 in each, named as blank controls group, model group, and hirudin group. A hepatic fibrosis model on r

4、ats was set up with CCl4(40%). Hirudin were given to the hirudin group fibrotic rats (daily gavage), normal saline was given to the control group and model group rats. After 12 weeks, CTGF mRNA expression in hepatic tissue were detected by real-time quantitative reverse transcription-PCR. Results Th

5、e CTGF mRNA expression was up-regulated In model groups, in which CTGF mRNA 2-2 / 15Ct value were 3.59±0.52 , compared with the blank group (1.02±0.23，P<0.05). The CTGF mRNA expression in hirudin group (1.83±0.34) was down-regulated compared with the model group(P<0.05).

6、ConclusionHirudin may down-regulate expression of CTGF mRNA and Inhibit the abnormal hyperplasia of hepatic extracellular matrix, so it has the function of antihepaticfibrosis.Key words：Hirudin; Hepatic fibrosis; Connective tissue growth factor; Real-time quantitative reverse transcription-PCR 肝纖維化是

7、大多數(shù)慢性肝病向肝硬化發(fā)展的共同病理過(guò)程，成因相當(dāng)復(fù)雜，阻斷肝纖維化的繼續(xù)發(fā)展，是預(yù)防肝硬化的關(guān)鍵1。肝纖維化的特征是肝細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)聚集，并需轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1（TGF-1）參與，CTGF是TGF-1的下游效應(yīng)介質(zhì)，具有介導(dǎo)TGF-1促細(xì)胞外基質(zhì)沉積的作用，阻斷CTGF可抑制TGF-介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix, ECM）產(chǎn)生2。多數(shù)中醫(yī)醫(yī)家認(rèn)為肝血瘀阻是肝纖維化基本病機(jī)，因此用藥以活血化瘀為主。水蛭是經(jīng)典的破血逐瘀類中藥。作者利用SYBR Green 實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)，建立大鼠肝組織CTGF基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)方法，觀察了水蛭素干預(yù)對(duì)CCl4誘導(dǎo)的

8、大鼠肝纖維化肝臟組織中的CTGF基因的影響。1 材料與儀器1.1 藥物 水蛭素的提取3：先將寬體金線蛭干制品粉碎，然后加入10倍體積的80%預(yù)冷丙酮，4攪拌10 min，再加入氯化鈉和三氯乙酸，攪拌30 min，然后離心，棄上清液，沉淀中加入其體積1/3的80%冷丙酮，抽提2次，離心，收集上清液，合并兩次抽提液加入2倍體積的冷丙酮，靜置2h，再離心，棄上清液，收集沉淀，干燥得水蛭素粗品。四氯化碳（CCl4分析純）：北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司。1.2 動(dòng)物及分組 選用健康雄性清潔級(jí)SD大鼠60只，體重（200±10）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證編號(hào)SCXK（京

9、）2002-0003。經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和水蛭素組共3組。1.3 試劑和儀器SYBR ExScriptTMRT-PCR kit（Perfect Real Time）為T(mén)AKARA公司產(chǎn)品，2700型PCR System擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品，UV-2550型紫外分光光度計(jì)為日本島津產(chǎn)品，ABI 7300熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。2 方法2.1 肝纖維化模型的建立4和藥物干預(yù) 大鼠皮下注射體積比為40%的CCl4和橄欖油混合液0.2 ml/100 g，每周2次，連續(xù)12周。正常組用等量生理鹽水皮下注射，水蛭素組在造模同時(shí)按6

10、0mg·kg-1，1次/d，灌胃給藥，連續(xù)12周，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，治療結(jié)束后第2天，剖取動(dòng)物肝臟。2.2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)大鼠肝臟組織CTGF mRNA表達(dá)2.2.1 抽提總RNA 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（12周末）在戊巴比妥鈉麻醉?xiàng)l件下隨機(jī)每組取5只大鼠處死，取肝臟組織100mg，用RNAiso Reagent（TaKaRa公司）提取總RNA，按RNAiso Reagent操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的RNA質(zhì)量由OD260/OD280比值和2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2.2.2 引物序列 CTGF引物序列: forward，5-CACCCGGGTTACCAATGACAA-3；r

11、everse, 5-AGCCCGGTAGGTCTTCACACTG-3。GAPDH引物序列：forward，5- GACAACTTTGGCATCGTGGA-3；reverse，5- ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3。2.2.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 在2700型PCR System擴(kuò)增儀上按SYBRExScriptTMRT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成，反應(yīng)參數(shù)為：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42 15 min，反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)95 2 min。2.2.4 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time) kit試劑，在ABI 7300熒

12、光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）上進(jìn)行PCR反應(yīng)。設(shè)置檢測(cè)文件，反應(yīng)條件如下：第一步是預(yù)變性，95預(yù)變性10 s，共1個(gè)循環(huán)。第二步是PCR反應(yīng)，95變性5 s，60退火31 s，共40個(gè)循環(huán)。整個(gè)過(guò)程中收集熒光，反應(yīng)結(jié)束后，使用Sequence Detection software version 1.2.3軟件（Applied Biosystems公司）分析PCR過(guò)程各檢測(cè)樣本的Ct（Threshold cycle）值，Ct值隨模板濃度增大而減少。由熔解曲線判斷PCR反應(yīng)的特異性。2.3 統(tǒng)計(jì)方法 計(jì)量資料用±s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。多組間差異的顯著性分析用單

13、因素方差分析，組間兩兩比較用SNK檢驗(yàn)。3 結(jié)果3.1 產(chǎn)物鑒定 實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物2%凝膠電泳圖見(jiàn)圖1。圖1 2%凝膠電泳圖分析real time PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（略） 各產(chǎn)物的熔解曲線僅有1個(gè)峰，說(shuō)明為單一片段擴(kuò)增，熔解溫度分別為GAPDH 86.9，CTGF84.8。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳，紫外線下掃描分析，GAPDH為120150bp，CTGF為180-200bp。符合設(shè)計(jì)的片斷長(zhǎng)度。3.2 擴(kuò)增效率分析5將一只大鼠肝臟組織的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并以2倍梯度稀釋，相對(duì)濃度為1，0.5，0.25，0.125，以其為實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增模板，實(shí)驗(yàn)中每樣本均做2個(gè)復(fù)孔。另加3個(gè)無(wú)模板的

14、陰性對(duì)照，所有計(jì)算采用每個(gè)樣本所得的平均循環(huán)數(shù)值，且樣本復(fù)孔的Ct值之間差異小于1個(gè)循環(huán)。以GAPDH和CTGF的Ct值與對(duì)應(yīng)的相對(duì)濃度對(duì)數(shù)值作圖（圖2），GAPDH和CTGF對(duì)應(yīng)的直線相關(guān)系數(shù)R2分別為0.998 2和0.999 8，斜率分別為為-3.2791和-3.2525，擴(kuò)增效率根據(jù)E=10(-1/alope)計(jì)算，EGAPDH為2.0182，ECTGF為2.0298。結(jié)果表明GAPDH和CTGF擴(kuò)增效率一致，2-Ct相對(duì)定量方法適合于本試驗(yàn)。3.3 水蛭素肝纖維化大鼠肝臟組織CTGF mRNA表達(dá)的影響 結(jié)果見(jiàn)圖3和表1。分別擴(kuò)增GAPGH和CTGF，每樣本作2復(fù)孔，得到兩組Ct平均

15、值。Ct干預(yù)組=Ct干預(yù)組CTGF-Ct干預(yù)組GAPDH，Ct空白組=Ct空白組CTGF-Ct空白組GAPDH，Ct=Ct 干預(yù)組-Ct空白組，CTGF mRNA表達(dá)差別倍數(shù)以2-Ct表示。圖2 GAPDH和CTGF擴(kuò)增效率計(jì)算圖（略）圖3 各組樣本CTGF mRNA的擴(kuò)增曲線（略）表1 各組大鼠肝臟組織CTGF基因表達(dá)相對(duì)值比較（略）空白對(duì)照組比較：*P0.05；與模型對(duì)照組比較：#P0.05；n=54 討論 在我國(guó)肝纖維化是一種常見(jiàn)病癥，該病變的繼續(xù)發(fā)展將導(dǎo)致肝硬化，甚至可能發(fā)生癌變，因此，尋找一種安全有效的藥物是其防治的當(dāng)務(wù)之急，從傳統(tǒng)中藥中尋找抗肝纖維化的活性物質(zhì)越來(lái)越受人們的關(guān)注6。

16、肝纖維化屬中醫(yī)“積聚”范疇，在臨床雖然可表現(xiàn)為各種不同證候，但血瘀證幾乎伴隨著其整個(gè)病程，肝絡(luò)瘀阻是病變發(fā)展的重要病理環(huán)節(jié)，常伴有局部或全身的血液循環(huán)障礙7。水蛭素是存在于水蛭唾液中的一種酸性多肽類物質(zhì)，由于重組水蛭素C端63位的Tyr不能像天然產(chǎn)品那樣被硫酸酯化從而嚴(yán)重影響了其生物活性，因此提取天然水蛭素更具有臨床應(yīng)用的價(jià)值8。我們經(jīng)過(guò)丙酮、三氯乙酸的沉淀和抽提除去水蛭所含的脂肪、核酸和大量雜蛋白，得到水蛭素并觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝臟組織CTGF mRNA表達(dá)的影響。 CTGF是一種C端富含半胱氨酸的分泌多肽，屬即刻早期基因CCN家族，是一重要的促組織纖維化蛋白，具有有絲分裂原效應(yīng)，促

17、進(jìn)血管平滑肌等細(xì)胞增殖；在其他細(xì)胞因子的協(xié)同作用下刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成，抑制其降解，導(dǎo)致ECM的聚集及結(jié)構(gòu)改建，表達(dá)細(xì)胞粘附分子。TGF是導(dǎo)致組織纖維化形成的最重要的細(xì)胞因子之一，CTGF為其下游效應(yīng)介質(zhì)，TGF-作用于CTGF的啟動(dòng)子區(qū)域刺激CTGF的合成分泌，CTGF則通過(guò)直接作用星狀膠質(zhì)細(xì)胞和結(jié)締組織刺激細(xì)胞外基質(zhì)的分泌介導(dǎo)TGF-致纖維化的作用9。TGF作用復(fù)雜，單純抑制其活性可能引起許多難以預(yù)料的副作用。而CTGF作為它的下游效應(yīng)介質(zhì)，作用較單一，在正常狀態(tài)下表達(dá)水平很低，因此成為治療肝纖維化有效靶點(diǎn)。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR是近年發(fā)展起來(lái)的基因定量方法，具有準(zhǔn)確、敏感和簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。檢測(cè)

18、基因表達(dá)變化有絕對(duì)定量和相對(duì)定量?jī)煞N方法，在本研究中，我們關(guān)注的不是CTGF基因的拷貝數(shù)，而是它在水蛭素干預(yù)后基因表達(dá)的改變情況，所以我們采用相對(duì)定量方法2-Ct法，并引入看家基因GAPH作參照。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝纖維化模型組大鼠肝組織CTGF mRNA表達(dá)較正常組明顯增加（P<0.05），而水蛭素干預(yù)可使肝纖維化模型大鼠肝組織CTGF mRNA表達(dá)水平下調(diào)（P<0.05），提示水蛭素可能通過(guò)下調(diào)CTGF mRNA轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)抗肝纖維化作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 劉克洲，侯 偉. 肝纖維化的治療策略J. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26（1）：8.2 Qi W, Che

19、n X, Twigg S, et al. Tranilast attenuates connective tissue growth factor-induced extracellular matrix accumulation in renal cellsJ. Kidney Int. 2006, 69(6): 989.3 陳 曦，劉光明，胡 強(qiáng)，等. 天然水蛭素的提取和純化J. 華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，2：104.4 劉 鶯，劉 平，胡義揚(yáng)，等. 纖維化大鼠肝組織與物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化及扶正化瘀方的調(diào)節(jié)作用J. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26（3）：224.5 Liva