hTSHR胞膜外區(qū)片段真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)

1、hTSHR胞膜外區(qū)片段真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)【摘要】 目的: 構(gòu)建人類促甲狀腺激素受體（hTSHR）胞膜外區(qū)氨基端的兩個片段hTSHRf（aa29100）、 hTSHRe（aa101278）的真核表達(dá)載體pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe, 并在CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。方法: RTPCR法從人甲狀腺正常組織的cDNA中擴(kuò)增hTSHRf和hTSHRe,定向插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(D)/V5HisTOPO中, 經(jīng)酶切、 PCR和測序鑒定后通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá), RTPCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)染細(xì)胞的cDNA、 Western blot分別鑒定hTSHR在CH

2、O細(xì)胞中mRNA和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果: RTPCR分別擴(kuò)增兩個片段的陽性克隆株, 所得片段大小與預(yù)期一致, 經(jīng)Western blot鑒定, 相對分子質(zhì)量（Mr）分別為11900、 23600左右, 與預(yù)期的大小相符。結(jié)論: 真核表達(dá)載體pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe構(gòu)建成功, RTPCR和Western blot檢測證實(shí)重組質(zhì)粒能在CHO細(xì)胞中高效表達(dá), 為進(jìn)一步研究pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe在體內(nèi)的基因表達(dá), 建立Graves'病的動物模型奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 TSH 受體 真核表達(dá) Graves病人TSHR是一種跨

3、膜性蛋白, 屬于G蛋白偶聯(lián)受體, 具有7次跨膜結(jié)構(gòu), 體內(nèi)主要分布在甲狀腺濾泡細(xì)胞膜上。hTSHR蛋白由764個氨基酸組成, 相對分子質(zhì)量（Mr）為84500, 分為膜內(nèi)區(qū)、 跨膜區(qū)以及膜外區(qū)3個部分1, 2, 編碼hTSHR膜外區(qū)的基因長度是1300 bp, 研究表明TSHR是許多自身免疫性甲狀腺疾?。╝utoimmune thyroid disease, AITD）中主要的自身抗原之一, TSHR膜外區(qū)（TSHR extracellular domain, TSHR2 / 19ECD）是其免疫原性區(qū)段, 抗TSHR的抗體大多結(jié)合于此段。本研究中克隆hTSHRECD氨基端的2個片段編碼序列（

4、188403 bp, 407904 bp）, 構(gòu)建其真核表達(dá)載體, 并轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)。1 材料和方法1.1 材料 CHO細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所藥理室熊東升研究員惠贈,酵母提取物、 胰蛋白胨購自O(shè)XOID公司, Hams F12、 G418、 OptiMEM無血清培養(yǎng)基購自Gibco公司; FBS和bTSH購自Sigma公司。真核表達(dá)載體pcDNA3.1(D)/V5HisTOPO和感受態(tài)E.coli TOP10 購自Invitrogen公司。DNA快速純化回收試劑盒、 限制性內(nèi)切酶Hind 以及Pyrobest DNA聚合酶購自TaKaRa公司; MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、

5、 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Promega公司; 質(zhì)?；厥占兓噭┖匈徸圆┐筇┛斯? TRIzol試劑、 脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 Reagent及小鼠AntiHis單克隆抗體（mAb）購自Invitrogen公司; 引物設(shè)計(jì)合成由上海英俊公司完成。1.2 方法1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的hTSHR cDNA序列（GenBank: 000369）序列分別設(shè)計(jì)片段188403 bp的引物F4: 5cac catg gag tgc cat cag gag ga g3, R4: 5act caa att gta gaa gga gtg tg3; 片段407

6、 bp940 bp的引物F5: 5cac catg gtg act cac ata gaa at3, R5: 5tgg gta aga aag gtc agc c3。上游引物的5端序列起始密碼子ATG前加人Kozak序列（劃線部分）以提高轉(zhuǎn)錄起始的效率3。1.2.2 組織材料獲取與總RNA的提取 人正常甲狀腺組織30 mg, 加入1 mL TRIzol, 勻漿后加入200 L氯仿, 搖勻, 室溫孵育23 min, 4, 11000 g離心15 min, 取上清水相至新離心管中; 加400 L異丙醇, 室溫孵育10 min, 4, 11000 g離心10 min; 棄上清, 用1 mL750 m

7、L/L乙醇洗滌1次, 4, 11000 g離心5 min; 棄上清,空氣中干燥10 min, 加RNasefree水溶解, 測RNA濃度, -70保存。1.2.3 RTPCR 將人甲狀腺正常組織RNA, 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以hTSHR cDNA為模板, 用Pyrobest DNA聚合酶PCR擴(kuò)增TSHR片段, 上下游引物分別1 L（10 mmol/L）, dNTP1 L（2.5 mmol/L）, 10×buffer2.5 L, Pyrobest DNA聚合酶0.30 L（1 U）, 模板2 L（約150 ng）, ddH2O17.2 L。反應(yīng)參數(shù): 95預(yù)變性2.5 min, 95

8、變性45 s, hTSHRf62.7、 hTSHRe 54.1退火45 s, 72延伸45 s, 34個循環(huán); 72再延伸5 min。10 g/LTAE瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物。1.2.4 載體構(gòu)建與鑒定 將回收的hTSHRf、 hTSHRe分別與載體1.51混合進(jìn)行連接, 然后將重組體轉(zhuǎn)化E.coli TOP10, 冰上放置530 min, 42熱休克30 s后, 立即置于冰上, 加250 L 的S.O.C培基37搖床, 1 h; 鋪板于Amp+的瓊脂糖培養(yǎng)基上, 37溫箱孵育16 h; 挑取單個菌落于LB液體培養(yǎng)基中, 擴(kuò)大培養(yǎng), 小量提取質(zhì)粒DNA, 以質(zhì)粒DNA為模板, 分別以F4

9、R4和 F5R5為引物, Pyrobest DNA聚合酶擴(kuò)增hTSHR, 反應(yīng)條件同上; 經(jīng)Hind 酶切后15 g/L瓊脂糖凝膠電泳; 測序鑒定由上海英俊生物公司完成。1.2.5 CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染與陽性克隆篩選 (1)轉(zhuǎn)染用重組質(zhì)粒的制備及純化: 按照提取質(zhì)粒試劑盒說明大量提取重組質(zhì)粒, 并去除內(nèi)毒素, A260/A280在1.82.0之間, -20保存, 用于轉(zhuǎn)染。(2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染: CHO細(xì)胞用Hams F12完全培養(yǎng)液（含100 mL/L FBS, 10 mL/L HT, 5 mL/L雙抗）常規(guī)培養(yǎng), 傳代。轉(zhuǎn)染前先對CHO細(xì)胞進(jìn)行毒性篩選, 以確定其最小致死量, 將細(xì)胞鋪板于96孔板中

10、, 細(xì)胞密度為2×104/孔, G418毒性篩選后確定最小致死量為500 mg/L。轉(zhuǎn)染前1 d, 以2×104/孔CHO細(xì)胞接種于96孔板, 每孔加100 L不含抗生素的Hams F12培養(yǎng)基, 使其融合密度為90%, 用25 L OPTIMEMI培養(yǎng)基分別稀釋320 ng DNA和0.8 L脂質(zhì)體2000, 后者稀釋后室溫孵育5 min, 混合稀釋的DNA和脂質(zhì)體, 室溫保溫20 min; 然后直接將復(fù)合物加入到每孔中, 37、 50 mL/LCO2孵育45 h后更換生長培養(yǎng)基; 次日, 將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中, 48 h后加入500 mg/L G418篩選陽性克隆株

11、, 進(jìn)行23周的穩(wěn)定表達(dá)。1.2.6 目的基因在mRNA水平表達(dá) 分別提取轉(zhuǎn)染后和未經(jīng)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以cDNA為模板, F4R4和 F5R5為引物, PCR分別進(jìn)行擴(kuò)增, 反應(yīng)參數(shù)同上。1.2.7 目的基因蛋白水平的表達(dá) 用200 L細(xì)胞裂解液裂解穩(wěn)定表達(dá)的CHO細(xì)胞制備蛋白樣品4, 120 g/L的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后, 將凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡15 min, PVDF膜剪成凝膠大小在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡1015 min, 恒流0.8 mA/cm2, 轉(zhuǎn)膜12 h; 50 g/L脫脂奶粉的PBST 4 mL, 4封閉過夜, 次日, PBST洗膜, 5 m

12、in/次; 由于構(gòu)建的重組表達(dá)蛋白的羧基端有多聚組氨酸6×His的蛋白標(biāo)簽, 一抗用小鼠AntiHis mAb（18000） 4 mL, 37孵育2 h; 洗膜（同上）; 加HRP標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG（18000） 2 mL, 37孵育1 h; 洗膜（同上）。按照化學(xué)發(fā)光法說明書, 用發(fā)光檢測液浸泡PVDF膜后, 在暗室中曝光30 s, 顯影12 min, 定影5 min, 室溫干燥。2 結(jié)果2.1 目的基因的獲取 提取人正常甲狀腺組織RNA, 經(jīng)RTPCR后, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收后10 g/L瓊脂糖凝膠電泳, 分別可見約220 bp、 540 bp大小片段, 與預(yù)期相符。圖1 目的基

13、因RTPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析（略）Fig 1 Analysis of RTPCR product of hTSHR gene by agarose gel eletropheresisM: DNA marker DL 2000; 1: hTSHRf; 2: hTSHRe.2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定 pcDNA3.1D/V5HisTOPO為定向克隆載體, 2個片段均正向插入載體, hTSHR全長Hind 的酶切位點(diǎn)有3個: 272 bp、 784 bp和1236 bp, 載體的Hind 的酶切位點(diǎn)在T7啟動子附近, Hind 在T7和272 bp對pcDNA3.1hTSHRf進(jìn)行酶切,

14、T7啟動子與TOPO異構(gòu)酶的識別位點(diǎn)之間以及188 bp與272 bp之間片段長度約為130 bp; Hind 在T7和784 bp對pcDNA3.1hTSHRe酶切, T7啟動子與TOPO異構(gòu)酶的識別位點(diǎn)之間以及407 bp與784 bp之間片段長度約為430 bp, 證實(shí)重組質(zhì)粒的大小及插入方向是正確的（圖2）; 測序結(jié)果與GenBank中hTSHR的相應(yīng)片段序列相同。以質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別約為220 bp、 540 bp, 與預(yù)期大小相符。圖2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1hTSHRf 和pcDNA3.1hTSHRe 經(jīng)Hind 酶切鑒定（略）Fig 2 Restriction

15、endonuclease Hind analysis of the recombinant plamids pcDNA3.1hTSHRf and pcDNA3.1hTSHReM: DNA marker DL 2000; 1: pcDNA3.1hTSHRf; 2: pcDNA3.1hTSHRe.2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中hTSHR mRNA表達(dá)鑒定RTPCR鑒定陽性克隆細(xì)胞, 擴(kuò)增產(chǎn)物分別約為220 bp、 540 bp, 證明hTSHRf和hTSHRe已經(jīng)成功整合在CHO細(xì)胞基因組中, 并能夠轉(zhuǎn)錄, 而未經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未擴(kuò)增出任何條帶（圖3）。圖3 RT PCR檢測目的基因的表達(dá)（略）Fig 3 R

16、TPCR amplifying cDNA of CHO cells transfected by recombinant plamids pcDNA3.1hTSHRf and pcDNA3.1hTSHReM: DNA marker DL 2000; 1: RTPCR amplifying cDNA of CHO cells nontransfected; 2: pcDNA3.1hTSHRf; 3: pcDNA3.1hTSHRe.2.4 Western blot鑒定TSHR蛋白水平的表達(dá) 裂解陽性細(xì)胞株, 經(jīng)SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜, 與小鼠AntiHis mAb結(jié)合, HRP標(biāo)記的

17、羊抗小鼠 IgG作為二抗, ECL法顯色, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子量計(jì)算后, 特異條帶的Mr約為11900、 23600, 與預(yù)期相符（圖4）。圖4 Western blot檢測目的基因的表達(dá)（略）Fig 4 Western blot of hTSHRf and hTSHRe3 討論 GD是一種常見的AITD, 其自身抗體TSAb可模擬TSH功能, 興奮TSHR, 通過多種途徑調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞的生長、 分化, 激素的合成和分泌, 最終導(dǎo)致GD的發(fā)生。建立合適的GD動物模型是人們一直以來研究的熱點(diǎn), 目前, 報(bào)道的建立GD動物模型的方法包括TSHR真核表達(dá)質(zhì)粒免疫、 表達(dá)TSHR的腺病毒免疫5、 表達(dá)TSH

18、R的成纖維細(xì)胞或M12細(xì)胞免疫 6、 外源性注入TSHR活化T細(xì)胞以及TSAb轉(zhuǎn)基因動物模型等, 最近有報(bào)道在體內(nèi)電穿孔法注射DNATSHR復(fù)合物建立GD模型7, TSHR核酸免疫被認(rèn)為是目前建立GD等AITD動物模型的最有希望的一種方法。Kim等8證明18.5%的GD患者體內(nèi)有TSAb和TBAb兩種抗體, 但主要是TSAb占優(yōu)勢, 95%以上未經(jīng)治療的GD患者血循環(huán)中均可檢測出TSAb。研究表明, TSHRECD是TSH以及TSHR自身抗體的主要作用部位, 并擁有多個TSH的結(jié)合位點(diǎn)、 自身抗體的結(jié)合表位以及特異的免疫原肽9, 因此, 研究TSHRECD功能對于了解GD發(fā)病的分子機(jī)制方面尤為

19、重要。研究發(fā)現(xiàn)TSAb大多數(shù)表位是位于TSHR ECD的氨基端（aa3437、 4045及525610）, Schwarz 等11研究證實(shí), 建立GD模型不論是用表達(dá)TSHR的腺病毒免疫還是用TSHR的DNA免疫, TSHR的顯性表位都位于其氨基端的富含半胱氨酸的殘基aa2141。 報(bào)道的真核表達(dá)載體大多是用hTSHR全長構(gòu)建的, 在前期的研究中, 我們針對性地用hTSHRECD氨基端的753 bp成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒12, 為了進(jìn)一步研究片段的功能, 我們又將其分成2個片段（aa29100, aa101278）, 分別構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe

20、, 因該載體具有定向克隆功能, 保證了片段與載體正確定向的連接, 簡化了克隆的過程和篩選的步驟, 并能使重組蛋白在CHO細(xì)胞中高效表達(dá)。結(jié)果顯示, RTPCR擴(kuò)增陽性克隆細(xì)胞株, 證實(shí)了hTSHR在mRNA水平的表達(dá); Western blot證明hTSHR在蛋白水平有表達(dá), 為進(jìn)一步研究pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe在體內(nèi)的基因表達(dá), 建立GD動物模型奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Rocchi R. Clinical utility of autoantibodies directed against TSHRJ. MLO Med Lab Obs, 2005,

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