干旱脅迫對小麥幼苗生理生化指標的影響

1、 干旱脅迫對小麥幼苗生理生化指標的影響 摘要：以小麥幼苗為試驗材料，研究干旱脅迫對小麥生理生化指標脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸（ASA）的含量的影響。試驗結果表明：在干旱脅迫下除發(fā)芽率下降外，小麥幼苗的脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽(GSH)的含量都比正常情況下小麥幼苗的含量多。關鍵詞：干旱脅迫 小麥幼苗 生理生化指標引言：植物體生存在自然環(huán)境中，其水熱條件隨時都變化，對植物多少會產(chǎn)生一些影響。凡是對植物產(chǎn)生傷害的環(huán)境都被稱為逆境，也稱脅迫。干旱

2、也屬于逆境，水分在植物的生命活動中占主導地位。大多數(shù)植物遭受干旱逆境后各個生理過程都會受到不同程度的影響。如生理生化指標脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽(GSH)等發(fā)生變化。小麥的生長不僅受到自身遺傳物質的控制，還受到眾多環(huán)境因子的影響，如光、溫、水和土壤營養(yǎng)物質等。世界上約有70%的小麥播種面積分布在干 旱、半干旱農(nóng)業(yè)區(qū)，干旱對小麥的生理、生化都產(chǎn)生重要的影響，進而影響小麥的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質。因此，為了減小環(huán)境對小麥生產(chǎn)的影響，有必要從小麥的各項生理生化指標含量的變化，來研究干旱脅迫對小麥的影響。本次實驗是研究吸脹12小時萌發(fā)

3、一周后，干旱處理一周的小麥其生理生化指標脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸（ASA）含量的變化。一、材料與方法1、材料及處理將吸脹12小時的小麥種子在有6層濕潤濾紙的帶蓋白磁盤（24cmX16cm）培養(yǎng)基中生長7天，7天后將其中一部分幼苗干旱生長7天，7天后用相同的方法分別對實驗組和對照組的小麥進行脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸（ASA）的含量的測定。2、測定方法1(1)小麥種子發(fā)芽率的測定各取50粒吸脹的小麥種子沿胚的中心線切成兩

4、半（嚴格區(qū)分兩個半粒），進行下列實驗：其中50個半粒進行TTC染色（30水浴 20 min） ，另50個半粒進行曙紅染色（室溫染色10 min） 根據(jù)兩種方法的染色情況，分別計算發(fā)芽率。(2)脯氨酸(Pro)含量的測定脯氨酸(Pro)的提?。悍謩e取0.1g實驗組和對照組的胚芽鞘加入3 mL 3%磺基水楊酸（SSA）和少許石英砂充分研磨用2 mL 3% SSA洗研缽5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 mL。 脯氨酸(Pro)的測定：上清液各2 mL 分別加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮試劑煮沸15 min冷卻后5000 rpm離心10 min（若沒沉淀可略此步驟） 分別測定A52

5、0,將測得的結果用公式Pro content = 計算出正常和干旱生長小麥的胚芽鞘的脯氨酸含量。(3) 丙二醛(MDA)含量的測定丙二醛(MDA)的提取：分別取0.1 g實驗組和對照組加入3 mL 10%TCA和少許石英砂充分研磨用2 mL 10%TCA洗研缽5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 mL。丙二醛(MDA)的測定：分別取上清液各2 mL 加入0.6%TBA（用10% TCA配制） 2 mL煮沸12 min冷卻后5000 rpm離心5 min 分別測定OD450和OD532將測得的OD450和OD532的數(shù)據(jù)帶入下列公式OD450=C1x 85.4 OD532 = C1

6、x 7.4+C2X155000C1：可溶性糖的濃度，C2：MDA的濃度 解方程計算出C1可溶性糖的濃度，C2MDA的濃度。(4) 過氧化氫(H2O2)含量的測定過氧化氫(H2O2)的提?。悍謩e取0.1 g實驗組和對照組加入3 mL 50 mM PBS (pH=6.8，內含1mM HA)和少許石英砂充分研磨用2 mL PBS洗研缽5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 mL。過氧化氫(H2O2) 含量的測定：分別取上清液各3 mL 加入0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2SO4配制 1 mL搖勻 5000 rpm離心10 min OD410將測得的OD410值帶入下列公式

7、H2O2 content = （ mmol.g-1FW）計算出H2O2酶的含量。(5) 抗氧化酶（PPO、POD）的測定抗氧化酶（PPO、POD）的提取：分別取0.1g實驗材料加入少許石英砂和3 ml提取液（50mmol/L PBS, pH6.0,內含0.mmol/ LEDTA, 1%PVP） 充分研磨轉入離心管中用2 ml提取液洗研缽 5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 ml 用于測定POD和PPO酶活性或分裝后轉至-20或-80保存。POD測定：取POD反應混合液（10mmol/L愈創(chuàng)木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）2.95 ml，加入酶液50ul（空白調零用

8、PBS取代），立即記時，搖勻，讀出反應2 min時的A470。PPO測定：取PPO反應混合液（ 20 mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解）2.9ml，加入酶液0.1 ml（空白調零用PBS取代），立即記時，搖勻，讀出反應 2 min時的A410。將測得的A470和A410數(shù)據(jù)帶入公式POD activities=（umol.g-1FW）PPO activies=(U.g-1FW)計算出PPO和POD的值(6) 谷胱甘肽(GSH)含量的測定谷胱甘肽(GSH)的提?。悍謩e取0.1 g實驗組和對照組的胚芽鞘加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂充分研磨用2 mL 5% TCA洗研缽 500

9、0 rpm離心10 min 上清液定容至5 mL。谷胱甘肽(GSH)含量的測定：上清液各1 mL 分別加入2 mL0.1M PBS (pH=7.7) 1 mL 2 mM DTNB 25 5 min測定A412將測得的A412值帶入公式GSH content= 用總顯VVVWLA´´´´e412 (umol.g-1FW)將GSH的值計算出來(7)、ASA含量的測定 ASA的提?。悍謩e取0.1g實驗組和對照組的胚芽鞘加入3ml5%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂充分研磨用2ml5%三氯乙酸（TCA）洗研缽5000rpm離心10min上清液定容至5ml ASA的

10、測定：上清液各0.8ml（空白用5%TCA代替）分別加入0.8ml0.15MNaH2PO4（pH=7.4）和蒸餾水搖勻分別加入0.8ml5%TCA、44%磷酸和4%聯(lián)吡啶搖勻加入3%FeCl30.8ml3715min測定A525 將測得的A525值帶入公式GSH content= 用總顯VVVWLA´´´´e525 (umol.g-1FW)將ASA的值計算出來二、實驗結果1、小麥發(fā)芽率的結果兩種方法測得的小麥發(fā)芽率不同，TTC法測得的小麥種子成活26粒，發(fā)芽率為52%，而署紅法測得的小麥種子成活47粒，發(fā)芽率為94%。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是我們當時在做實驗

11、時不知道胚的具體位置，導致在切的時候沒有沿胚切成兩半，所以染色的結果剛開始是錯誤的。后面我們問了老師胚的位置，所以用署紅法測得的結果基本接近實際?？赡芪覀冊跀?shù)的時候有的因染色的部位少沒有嚴格的區(qū)分導致結果沒有達到100%。但是從結果可以看出，小麥的發(fā)芽率還是很高的。2、干旱脅迫對小麥胚芽鞘脯氨酸（Pro）含量的影響和分析實驗測得：正常生長OD=0.006 干旱生長OD=1.858從圖中可以看出，小麥在干旱脅迫下時的脯氨酸的含量很高，為正常植株中的脯氨酸含量的262倍，這說明正常情況下小麥胚芽鞘內脯氨酸含量較低，但當遇到干旱脅迫時小麥胚芽鞘內的含量可以增加數(shù)十倍甚至幾百倍。這一結果與山東農(nóng)業(yè)科學

12、洪法水 李樊和在研究自然干旱脅迫下小麥品種游離脯氨酸與抗旱性的關系所得到的結果一致2。3、干旱脅迫對小麥胚芽鞘丙二醛（MDA）含量影響實驗測得：正常生長OD450=0.045 OD532=0.028 干旱生長OD450=0.401 OD532=0.291 小麥MDA含量可溶性糖含量正常生長0.1554umol/L0.52695 umol/L干旱生長 1.65239umol/L 4.69571 umol/L由表格可以看出干旱脅迫下生長的小麥胚芽鞘內所含的可溶性糖和MDA量比正常生長的小麥所含量高。這一結果與山東農(nóng)業(yè)大學研究生吳耀領再做抗旱性與豐產(chǎn)型小麥對干旱脅迫的響應所得到得結果一致3。4、干旱

13、脅迫對小麥胚芽鞘過氧化氫（H2O2）含量影響。實驗測得：正常生長OD410= 0.098 干旱生長OD410=0.414 從圖中可以看出干旱情況下的含量為98.57umol .g-1FW,正常情況下的為23.33umol .g-1FW，可以看出來干旱下的含量是正常生長的4倍多，這一結果與高方勝所作的土壤水分對番茄植物體內過氧化氫酶含量的含量變化相符，在干旱脅迫下植物體內的氧化酶含量升高相一致4。5、干旱脅迫對抗氧化酶（PPO、POD）含量的影響實驗測得：POD正常生長A470=0.256 干旱生長A470=0.972 PPO正常生長A410=0.081 干旱生長A410=0.151 POD含量

14、 PPO含量干旱生長 正常生長 干旱生長正常生長0.93umol.g-1FWmin-10.24umol.g-1FWmin-1130.17umol.g-1FWmin-169.83umol.g-1FWmin-1結果表明，在干旱生長下的過氧化酶的含量比正常生長下要高很多，說明干旱脅迫下的POD和PPO活性比正常水平的POD和PPO活性強，從而在干旱生長時過氧化酶大量積累。 6、干旱脅迫對谷胱甘肽（GSH）含量的影響和分析實驗測得：正常生長OD412=0.096 干旱生長OD412=0.183 從圖中可以看出，實驗組GSH含量2.69umol.g-1FW,對照組含量1.41umol.g-1FW，實驗組

15、和對照組的含量存在差異，實驗組GSH含量遠比對照組的高。說明干旱脅迫使GSH含量升高。7、干旱脅迫對抗壞血酸（ASA）含量的影響和分析 實驗測得：正常生長OD525=0.007 干旱生長OD525=0.021 從圖中可以看出，干旱生長下抗壞血酸（ASA）的含量比正常生長下抗壞血酸的含量高很多，說明小麥在正常情況下ASA的含量很低，但是當遇到干旱脅迫時，植株的ASA大量積累。三、結果分析與討論 本實驗表明: 在干旱脅迫下, 小麥幼苗生長受到一定抑制作用,生理生化指標發(fā)生一系列變化,具體表現(xiàn)為：小麥幼苗胚芽鞘中脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、抗氧化酶（PPO、POD）、谷

16、胱甘肽(GSH)、抗壞血酸（ASA）的含量在干旱脅迫下含量較正常情況下的明顯升高。 1、干旱脅迫下脯氨酸（Pro）含量的變化： 干旱脅迫下脯氨酸增加的原因為: 脯氨酸脫氫酶活性降低, 使脯氨酸氧化減弱; 干旱抑制了蛋白質的合成, 脯氨酸的利用降低, 使其在植物體內積累增加。脯氨酸的分解代謝開始于它的氧化分解，執(zhí)行此功能的酶稱為Pro脫氫酶(PDH)，它以FAD為輔因子將Pro降解為P5C，后者在P5C還原酶(P5CR)的作用下又重新合成谷氨酸，完成Pro代謝的循環(huán)過程。所以，在Pro的降解過程中PDH是Pro降解的關鍵酶。在逆境脅迫過程中，PDH的活性往往受到不同程度的限制，從而削弱了Pro的

17、降解過程，因此越來越多的脯氨酸被積累。在正常情況下，脯氨酸含量總是很低。但一旦遇到干旱，脯氨酸的含量可增加數(shù)十倍甚至上百倍。脯氨酸含量的增高能夠降低葉片細胞的滲透勢, 防止細胞脫水。脯氨酸親水性極強，能穩(wěn)定原生質膠體及組織內的代謝過程，是最有效的滲透調節(jié)物質之一，是由谷氨酸通過吡咯啉5羧酸形成的，存在于胞質溶膠中。脯氨酸作為滲透調節(jié)物質，用于保持胞質溶膠與環(huán)境的滲透平衡，防止水分散失。同時脯氨酸能夠保持膜結構的完整性，脯氨酸具有很高的水溶性, 可以保護細胞膜系統(tǒng)5。因此，脯氨酸的積累是植物適應持久干旱所必需的。2、干旱脅迫下丙二醛（MDA）含量的變化：植物在干旱脅迫下的質膜傷害與膜透性的增加是

18、干旱傷害的本質之一。丙二醛是膜脂過氧化物作用的主要產(chǎn)物之一，是膜系統(tǒng)受傷害的重要標志，膜脂過氧化作用愈強, MDA 含量愈高, 膜被傷害程度愈重。MDA對細胞質膜和細胞中的許多生物功能分子均有很強的破壞作用。它能與膜上的蛋白質氨基酸殘基或核酸反應生成shiff堿，降低膜的穩(wěn)定性，加大膜透性，促進膜的滲漏，使細胞器膜的結構、功能紊亂，嚴重時導致細胞死亡。本實驗證明了在干旱脅迫下丙二醛大量積累。梁新華等6 在研究干旱對甘草幼苗根系的影響時發(fā)現(xiàn)甘草根系MDA 的含量隨干旱脅迫程度的增強而升高, 受旱時甘草幼苗根系產(chǎn)生了膜脂過氧化作用。李明等7 在研究干旱對甘草幼苗的影響時也發(fā)現(xiàn)隨干旱脅迫時間的延長,

19、 甘草幼苗MDA 含量呈增加趨勢。3、干旱脅迫下過氧化氫（H2O2）含量的變化：過氧化氫酶大量分布于動植物細胞內，屬于活性氧清除劑，對H2O2和羥自由基有清除能力，是一種細胞保護酶。水分脅迫等逆境條件使細胞活性氧代謝失調，超氧物陰離子自由基和H2O2等活性氧累積并超過膜傷害閾值，從而導致膜脂過氧化作用加劇。SOD引發(fā)細胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生膜脂過氧化作用，將導致膜脂的分解，破壞膜的結構，此外，SOD對蛋白質和核酸亦產(chǎn)生破壞作用。在保護酶系中，SOD能將超氧物陰離子自由基清除為過氧化氫，而CAT等保護酶的協(xié)調作用可進一步將H202，轉變?yōu)樗℉20），從而使活性氧維持于一個較低水平8 9 。過氧

20、化氫是植物代謝中產(chǎn)生的一種產(chǎn)物，其積累對細胞具有氧化破壞作用?？筛鶕?jù)其含量的變化，來了解組織的破壞程度。4、干旱脅迫下抗氧化酶（POD和PPO）含量的變化：PPO和 POD 均為植物內源自由基清除劑, 屬保護酶系統(tǒng)10 。植物機體內存在抗氧化防御系統(tǒng)，而過氧化酶（POD）則是該系統(tǒng)的主要物質之一。逆境脅迫下，活性氧自由基增加，使植物細胞遭受氧活化脅迫。而POD對于消除細胞的活性氧對細胞膜的傷害，減少膜脂質過氧化，穩(wěn)定膜的穩(wěn)定性起到重要作用。多酚氧化酶（PPO）是存在于胞質溶膠和微體中的一種末端氧化酶，其活力很強，當細胞受輕微破壞、組織衰老、逆境下細胞活力降低，細胞結構有些解體時，PPO和酚接觸

21、，發(fā)生反應，可將酚氧化成棕褐色的醌，醌對微生物有毒，可防止植物感染。在水分脅迫時, 胚芽鞘PPO 和 POD 活性逐漸增強 。這說明在干旱脅迫下, 小麥胚芽鞘通過增強 PPO 和 POD 活性來抵御干旱逆境對其所造成的傷害, 從而使小麥胚芽鞘可能獲得較高的抗旱性 。5、干旱脅迫下谷胱甘肽(GSH)含量的變化：在植物體內活性氧的清除包括酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)，而谷胱甘肽（GSH）則是非酶系統(tǒng)中活性氧清除的重要抗氧化劑之一。谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸組成的天然三肽是一種含硫基的化合物。GSH不僅可以直接清除H2O2，在葉綠體中還可以與抗壞血酸協(xié)同作用清除H2O2。GSH值升高，說明GSH 的

22、親核活性來消除活性氧和重金屬等對細胞的傷害，在抗性作用中有重要作用116、干旱脅迫下抗壞血酸(ASA)含量的變化：ASA是天然的非酶自由基清除劑12，本實驗中，ASA的含量增加，說明抗壞血酸對小麥的抗旱有著重要作用。ASA可以提高保護酶的活性，降低水分虧缺下超氧物陰離子自由基的產(chǎn)生，從而保護了膜系統(tǒng)，緩解了水分虧缺下葉綠素和蛋白質的分解破壞。提高了相對含水量，改善了水分狀況，具有明顯提高小麥抗旱性的生理效應。由實驗結果可知，在干旱脅迫下，小麥幼苗的各項生理生化指標均有顯著的變化， 脯氨酸、過氧化氫 、谷胱甘肽、抗壞血酸、丙二醛和可溶性糖濃度含量均明顯增多， POP和POD活性也明顯增強，說明干

23、旱脅迫對植物有很大的影響。 干旱對植物的傷害主要表現(xiàn)在一下幾個方面：（1）各部位間水分重新分配。水分不同時，不同器官不同組織間的水分，按各部位的水勢大小重新分配。水勢高的部位的水分流向水勢低的部位。 （2）膜受損傷。缺水時，正常的膜雙層結構被破壞，出現(xiàn)孔隙，會滲出大量溶質。脂質雙層缺水時也會替換膜蛋白，與溶質一起滲漏，所以喪失選擇透性，破壞細胞區(qū)室化，膜上酶的活性也喪失。（3）光合作用減弱。光合作用對缺水特別敏感。水分虧缺時，氣孔開度減少甚至完全關閉，影響CO2的吸收，光合速率就下降。（4）滲透調節(jié)。植物缺水時另一個顯著效應是由于溶質積累，而使?jié)B透勢下降。征對以上干旱對植物造成的傷害，所以我們應該采取相應的措