干旱脅迫對(duì)小麥幼苗生理生化指標(biāo)的影響

1、 干旱脅迫對(duì)小麥幼苗生理生化指標(biāo)的影響 摘要：以小麥幼苗為試驗(yàn)材料，研究干旱脅迫對(duì)小麥生理生化指標(biāo)脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸（ASA）的含量的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：在干旱脅迫下除發(fā)芽率下降外，小麥幼苗的脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽(GSH)的含量都比正常情況下小麥幼苗的含量多。關(guān)鍵詞：干旱脅迫 小麥幼苗 生理生化指標(biāo)引言：植物體生存在自然環(huán)境中，其水熱條件隨時(shí)都變化，對(duì)植物多少會(huì)產(chǎn)生一些影響。凡是對(duì)植物產(chǎn)生傷害的環(huán)境都被稱為逆境，也稱脅迫。干旱

2、也屬于逆境，水分在植物的生命活動(dòng)中占主導(dǎo)地位。大多數(shù)植物遭受干旱逆境后各個(gè)生理過(guò)程都會(huì)受到不同程度的影響。如生理生化指標(biāo)脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽(GSH)等發(fā)生變化。小麥的生長(zhǎng)不僅受到自身遺傳物質(zhì)的控制，還受到眾多環(huán)境因子的影響，如光、溫、水和土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等。世界上約有70%的小麥播種面積分布在干 旱、半干旱農(nóng)業(yè)區(qū)，干旱對(duì)小麥的生理、生化都產(chǎn)生重要的影響，進(jìn)而影響小麥的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，為了減小環(huán)境對(duì)小麥生產(chǎn)的影響，有必要從小麥的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)含量的變化，來(lái)研究干旱脅迫對(duì)小麥的影響。本次實(shí)驗(yàn)是研究吸脹12小時(shí)萌發(fā)

3、一周后，干旱處理一周的小麥其生理生化指標(biāo)脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸（ASA）含量的變化。一、材料與方法1、材料及處理將吸脹12小時(shí)的小麥種子在有6層濕潤(rùn)濾紙的帶蓋白磁盤(pán)（24cmX16cm）培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7天，7天后將其中一部分幼苗干旱生長(zhǎng)7天，7天后用相同的方法分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的小麥進(jìn)行脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸（ASA）的含量的測(cè)定。2、測(cè)定方法1(1)小麥種子發(fā)芽率的測(cè)定各取50粒吸脹的小麥種子沿胚的中心線切成兩

4、半（嚴(yán)格區(qū)分兩個(gè)半粒），進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)：其中50個(gè)半粒進(jìn)行TTC染色（30水浴 20 min） ，另50個(gè)半粒進(jìn)行曙紅染色（室溫染色10 min） 根據(jù)兩種方法的染色情況，分別計(jì)算發(fā)芽率。(2)脯氨酸(Pro)含量的測(cè)定脯氨酸(Pro)的提?。悍謩e取0.1g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的胚芽鞘加入3 mL 3%磺基水楊酸（SSA）和少許石英砂充分研磨用2 mL 3% SSA洗研缽5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 mL。 脯氨酸(Pro)的測(cè)定：上清液各2 mL 分別加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮試劑煮沸15 min冷卻后5000 rpm離心10 min（若沒(méi)沉淀可略此步驟） 分別測(cè)定A52

5、0,將測(cè)得的結(jié)果用公式Pro content = 計(jì)算出正常和干旱生長(zhǎng)小麥的胚芽鞘的脯氨酸含量。(3) 丙二醛(MDA)含量的測(cè)定丙二醛(MDA)的提取：分別取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組加入3 mL 10%TCA和少許石英砂充分研磨用2 mL 10%TCA洗研缽5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 mL。丙二醛(MDA)的測(cè)定：分別取上清液各2 mL 加入0.6%TBA（用10% TCA配制） 2 mL煮沸12 min冷卻后5000 rpm離心5 min 分別測(cè)定OD450和OD532將測(cè)得的OD450和OD532的數(shù)據(jù)帶入下列公式OD450=C1x 85.4 OD532 = C1

6、x 7.4+C2X155000C1：可溶性糖的濃度，C2：MDA的濃度 解方程計(jì)算出C1可溶性糖的濃度，C2MDA的濃度。(4) 過(guò)氧化氫(H2O2)含量的測(cè)定過(guò)氧化氫(H2O2)的提?。悍謩e取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組加入3 mL 50 mM PBS (pH=6.8，內(nèi)含1mM HA)和少許石英砂充分研磨用2 mL PBS洗研缽5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 mL。過(guò)氧化氫(H2O2) 含量的測(cè)定：分別取上清液各3 mL 加入0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2SO4配制 1 mL搖勻 5000 rpm離心10 min OD410將測(cè)得的OD410值帶入下列公式

7、H2O2 content = （ mmol.g-1FW）計(jì)算出H2O2酶的含量。(5) 抗氧化酶（PPO、POD）的測(cè)定抗氧化酶（PPO、POD）的提?。悍謩e取0.1g實(shí)驗(yàn)材料加入少許石英砂和3 ml提取液（50mmol/L PBS, pH6.0,內(nèi)含0.mmol/ LEDTA, 1%PVP） 充分研磨轉(zhuǎn)入離心管中用2 ml提取液洗研缽 5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 ml 用于測(cè)定POD和PPO酶活性或分裝后轉(zhuǎn)至-20或-80保存。POD測(cè)定：取POD反應(yīng)混合液（10mmol/L愈創(chuàng)木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）2.95 ml，加入酶液50ul（空白調(diào)零用

8、PBS取代），立即記時(shí)，搖勻，讀出反應(yīng)2 min時(shí)的A470。PPO測(cè)定：取PPO反應(yīng)混合液（ 20 mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解）2.9ml，加入酶液0.1 ml（空白調(diào)零用PBS取代），立即記時(shí)，搖勻，讀出反應(yīng) 2 min時(shí)的A410。將測(cè)得的A470和A410數(shù)據(jù)帶入公式POD activities=（umol.g-1FW）PPO activies=(U.g-1FW)計(jì)算出PPO和POD的值(6) 谷胱甘肽(GSH)含量的測(cè)定谷胱甘肽(GSH)的提取：分別取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的胚芽鞘加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂充分研磨用2 mL 5% TCA洗研缽 500

9、0 rpm離心10 min 上清液定容至5 mL。谷胱甘肽(GSH)含量的測(cè)定：上清液各1 mL 分別加入2 mL0.1M PBS (pH=7.7) 1 mL 2 mM DTNB 25 5 min測(cè)定A412將測(cè)得的A412值帶入公式GSH content= 用總顯VVVWLA´´´´e412 (umol.g-1FW)將GSH的值計(jì)算出來(lái)(7)、ASA含量的測(cè)定 ASA的提?。悍謩e取0.1g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的胚芽鞘加入3ml5%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂充分研磨用2ml5%三氯乙酸（TCA）洗研缽5000rpm離心10min上清液定容至5ml ASA的

10、測(cè)定：上清液各0.8ml（空白用5%TCA代替）分別加入0.8ml0.15MNaH2PO4（pH=7.4）和蒸餾水搖勻分別加入0.8ml5%TCA、44%磷酸和4%聯(lián)吡啶搖勻加入3%FeCl30.8ml3715min測(cè)定A525 將測(cè)得的A525值帶入公式GSH content= 用總顯VVVWLA´´´´e525 (umol.g-1FW)將ASA的值計(jì)算出來(lái)二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、小麥發(fā)芽率的結(jié)果兩種方法測(cè)得的小麥發(fā)芽率不同，TTC法測(cè)得的小麥種子成活26粒，發(fā)芽率為52%，而署紅法測(cè)得的小麥種子成活47粒，發(fā)芽率為94%。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是我們當(dāng)時(shí)在做實(shí)驗(yàn)

11、時(shí)不知道胚的具體位置，導(dǎo)致在切的時(shí)候沒(méi)有沿胚切成兩半，所以染色的結(jié)果剛開(kāi)始是錯(cuò)誤的。后面我們問(wèn)了老師胚的位置，所以用署紅法測(cè)得的結(jié)果基本接近實(shí)際?？赡芪覀?cè)跀?shù)的時(shí)候有的因染色的部位少?zèng)]有嚴(yán)格的區(qū)分導(dǎo)致結(jié)果沒(méi)有達(dá)到100%。但是從結(jié)果可以看出，小麥的發(fā)芽率還是很高的。2、干旱脅迫對(duì)小麥胚芽鞘脯氨酸（Pro）含量的影響和分析實(shí)驗(yàn)測(cè)得：正常生長(zhǎng)OD=0.006 干旱生長(zhǎng)OD=1.858從圖中可以看出，小麥在干旱脅迫下時(shí)的脯氨酸的含量很高，為正常植株中的脯氨酸含量的262倍，這說(shuō)明正常情況下小麥胚芽鞘內(nèi)脯氨酸含量較低，但當(dāng)遇到干旱脅迫時(shí)小麥胚芽鞘內(nèi)的含量可以增加數(shù)十倍甚至幾百倍。這一結(jié)果與山東農(nóng)業(yè)科學(xué)

12、洪法水 李樊和在研究自然干旱脅迫下小麥品種游離脯氨酸與抗旱性的關(guān)系所得到的結(jié)果一致2。3、干旱脅迫對(duì)小麥胚芽鞘丙二醛（MDA）含量影響實(shí)驗(yàn)測(cè)得：正常生長(zhǎng)OD450=0.045 OD532=0.028 干旱生長(zhǎng)OD450=0.401 OD532=0.291 小麥MDA含量可溶性糖含量正常生長(zhǎng)0.1554umol/L0.52695 umol/L干旱生長(zhǎng) 1.65239umol/L 4.69571 umol/L由表格可以看出干旱脅迫下生長(zhǎng)的小麥胚芽鞘內(nèi)所含的可溶性糖和MDA量比正常生長(zhǎng)的小麥所含量高。這一結(jié)果與山東農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生吳耀領(lǐng)再做抗旱性與豐產(chǎn)型小麥對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)所得到得結(jié)果一致3。4、干旱

13、脅迫對(duì)小麥胚芽鞘過(guò)氧化氫（H2O2）含量影響。實(shí)驗(yàn)測(cè)得：正常生長(zhǎng)OD410= 0.098 干旱生長(zhǎng)OD410=0.414 從圖中可以看出干旱情況下的含量為98.57umol .g-1FW,正常情況下的為23.33umol .g-1FW，可以看出來(lái)干旱下的含量是正常生長(zhǎng)的4倍多，這一結(jié)果與高方勝所作的土壤水分對(duì)番茄植物體內(nèi)過(guò)氧化氫酶含量的含量變化相符，在干旱脅迫下植物體內(nèi)的氧化酶含量升高相一致4。5、干旱脅迫對(duì)抗氧化酶（PPO、POD）含量的影響實(shí)驗(yàn)測(cè)得：POD正常生長(zhǎng)A470=0.256 干旱生長(zhǎng)A470=0.972 PPO正常生長(zhǎng)A410=0.081 干旱生長(zhǎng)A410=0.151 POD含量

14、 PPO含量干旱生長(zhǎng) 正常生長(zhǎng) 干旱生長(zhǎng)正常生長(zhǎng)0.93umol.g-1FWmin-10.24umol.g-1FWmin-1130.17umol.g-1FWmin-169.83umol.g-1FWmin-1結(jié)果表明，在干旱生長(zhǎng)下的過(guò)氧化酶的含量比正常生長(zhǎng)下要高很多，說(shuō)明干旱脅迫下的POD和PPO活性比正常水平的POD和PPO活性強(qiáng)，從而在干旱生長(zhǎng)時(shí)過(guò)氧化酶大量積累。 6、干旱脅迫對(duì)谷胱甘肽（GSH）含量的影響和分析實(shí)驗(yàn)測(cè)得：正常生長(zhǎng)OD412=0.096 干旱生長(zhǎng)OD412=0.183 從圖中可以看出，實(shí)驗(yàn)組GSH含量2.69umol.g-1FW,對(duì)照組含量1.41umol.g-1FW，實(shí)驗(yàn)組

15、和對(duì)照組的含量存在差異，實(shí)驗(yàn)組GSH含量遠(yuǎn)比對(duì)照組的高。說(shuō)明干旱脅迫使GSH含量升高。7、干旱脅迫對(duì)抗壞血酸（ASA）含量的影響和分析 實(shí)驗(yàn)測(cè)得：正常生長(zhǎng)OD525=0.007 干旱生長(zhǎng)OD525=0.021 從圖中可以看出，干旱生長(zhǎng)下抗壞血酸（ASA）的含量比正常生長(zhǎng)下抗壞血酸的含量高很多，說(shuō)明小麥在正常情況下ASA的含量很低，但是當(dāng)遇到干旱脅迫時(shí)，植株的ASA大量積累。三、結(jié)果分析與討論 本實(shí)驗(yàn)表明: 在干旱脅迫下, 小麥幼苗生長(zhǎng)受到一定抑制作用,生理生化指標(biāo)發(fā)生一系列變化,具體表現(xiàn)為：小麥幼苗胚芽鞘中脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)、抗氧化酶（PPO、POD）、谷

16、胱甘肽(GSH)、抗壞血酸（ASA）的含量在干旱脅迫下含量較正常情況下的明顯升高。 1、干旱脅迫下脯氨酸（Pro）含量的變化： 干旱脅迫下脯氨酸增加的原因?yàn)? 脯氨酸脫氫酶活性降低, 使脯氨酸氧化減弱; 干旱抑制了蛋白質(zhì)的合成, 脯氨酸的利用降低, 使其在植物體內(nèi)積累增加。脯氨酸的分解代謝開(kāi)始于它的氧化分解，執(zhí)行此功能的酶稱為Pro脫氫酶(PDH)，它以FAD為輔因子將Pro降解為P5C，后者在P5C還原酶(P5CR)的作用下又重新合成谷氨酸，完成Pro代謝的循環(huán)過(guò)程。所以，在Pro的降解過(guò)程中PDH是Pro降解的關(guān)鍵酶。在逆境脅迫過(guò)程中，PDH的活性往往受到不同程度的限制，從而削弱了Pro的

17、降解過(guò)程，因此越來(lái)越多的脯氨酸被積累。在正常情況下，脯氨酸含量總是很低。但一旦遇到干旱，脯氨酸的含量可增加數(shù)十倍甚至上百倍。脯氨酸含量的增高能夠降低葉片細(xì)胞的滲透勢(shì), 防止細(xì)胞脫水。脯氨酸親水性極強(qiáng)，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過(guò)程，是最有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，是由谷氨酸通過(guò)吡咯啉5羧酸形成的，存在于胞質(zhì)溶膠中。脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，用于保持胞質(zhì)溶膠與環(huán)境的滲透平衡，防止水分散失。同時(shí)脯氨酸能夠保持膜結(jié)構(gòu)的完整性，脯氨酸具有很高的水溶性, 可以保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)5。因此，脯氨酸的積累是植物適應(yīng)持久干旱所必需的。2、干旱脅迫下丙二醛（MDA）含量的變化：植物在干旱脅迫下的質(zhì)膜傷害與膜透性的增加是

18、干旱傷害的本質(zhì)之一。丙二醛是膜脂過(guò)氧化物作用的主要產(chǎn)物之一，是膜系統(tǒng)受傷害的重要標(biāo)志，膜脂過(guò)氧化作用愈強(qiáng), MDA 含量愈高, 膜被傷害程度愈重。MDA對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞中的許多生物功能分子均有很強(qiáng)的破壞作用。它能與膜上的蛋白質(zhì)氨基酸殘基或核酸反應(yīng)生成shiff堿，降低膜的穩(wěn)定性，加大膜透性，促進(jìn)膜的滲漏，使細(xì)胞器膜的結(jié)構(gòu)、功能紊亂，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)證明了在干旱脅迫下丙二醛大量積累。梁新華等6 在研究干旱對(duì)甘草幼苗根系的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)甘草根系MDA 的含量隨干旱脅迫程度的增強(qiáng)而升高, 受旱時(shí)甘草幼苗根系產(chǎn)生了膜脂過(guò)氧化作用。李明等7 在研究干旱對(duì)甘草幼苗的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),

19、 甘草幼苗MDA 含量呈增加趨勢(shì)。3、干旱脅迫下過(guò)氧化氫（H2O2）含量的變化：過(guò)氧化氫酶大量分布于動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)，屬于活性氧清除劑，對(duì)H2O2和羥自由基有清除能力，是一種細(xì)胞保護(hù)酶。水分脅迫等逆境條件使細(xì)胞活性氧代謝失調(diào)，超氧物陰離子自由基和H2O2等活性氧累積并超過(guò)膜傷害閾值，從而導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化作用加劇。SOD引發(fā)細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，將導(dǎo)致膜脂的分解，破壞膜的結(jié)構(gòu)，此外，SOD對(duì)蛋白質(zhì)和核酸亦產(chǎn)生破壞作用。在保護(hù)酶系中，SOD能將超氧物陰離子自由基清除為過(guò)氧化氫，而CAT等保護(hù)酶的協(xié)調(diào)作用可進(jìn)一步將H202，轉(zhuǎn)變?yōu)樗℉20），從而使活性氧維持于一個(gè)較低水平8 9 。過(guò)氧

20、化氫是植物代謝中產(chǎn)生的一種產(chǎn)物，其積累對(duì)細(xì)胞具有氧化破壞作用?？筛鶕?jù)其含量的變化，來(lái)了解組織的破壞程度。4、干旱脅迫下抗氧化酶（POD和PPO）含量的變化：PPO和 POD 均為植物內(nèi)源自由基清除劑, 屬保護(hù)酶系統(tǒng)10 。植物機(jī)體內(nèi)存在抗氧化防御系統(tǒng)，而過(guò)氧化酶（POD）則是該系統(tǒng)的主要物質(zhì)之一。逆境脅迫下，活性氧自由基增加，使植物細(xì)胞遭受氧活化脅迫。而POD對(duì)于消除細(xì)胞的活性氧對(duì)細(xì)胞膜的傷害，減少膜脂質(zhì)過(guò)氧化，穩(wěn)定膜的穩(wěn)定性起到重要作用。多酚氧化酶（PPO）是存在于胞質(zhì)溶膠和微體中的一種末端氧化酶，其活力很強(qiáng)，當(dāng)細(xì)胞受輕微破壞、組織衰老、逆境下細(xì)胞活力降低，細(xì)胞結(jié)構(gòu)有些解體時(shí)，PPO和酚接觸

21、，發(fā)生反應(yīng)，可將酚氧化成棕褐色的醌，醌對(duì)微生物有毒，可防止植物感染。在水分脅迫時(shí), 胚芽鞘PPO 和 POD 活性逐漸增強(qiáng) 。這說(shuō)明在干旱脅迫下, 小麥胚芽鞘通過(guò)增強(qiáng) PPO 和 POD 活性來(lái)抵御干旱逆境對(duì)其所造成的傷害, 從而使小麥胚芽鞘可能獲得較高的抗旱性 。5、干旱脅迫下谷胱甘肽(GSH)含量的變化：在植物體內(nèi)活性氧的清除包括酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)，而谷胱甘肽（GSH）則是非酶系統(tǒng)中活性氧清除的重要抗氧化劑之一。谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸組成的天然三肽是一種含硫基的化合物。GSH不僅可以直接清除H2O2，在葉綠體中還可以與抗壞血酸協(xié)同作用清除H2O2。GSH值升高，說(shuō)明GSH 的

22、親核活性來(lái)消除活性氧和重金屬等對(duì)細(xì)胞的傷害，在抗性作用中有重要作用116、干旱脅迫下抗壞血酸(ASA)含量的變化：ASA是天然的非酶自由基清除劑12，本實(shí)驗(yàn)中，ASA的含量增加，說(shuō)明抗壞血酸對(duì)小麥的抗旱有著重要作用。ASA可以提高保護(hù)酶的活性，降低水分虧缺下超氧物陰離子自由基的產(chǎn)生，從而保護(hù)了膜系統(tǒng)，緩解了水分虧缺下葉綠素和蛋白質(zhì)的分解破壞。提高了相對(duì)含水量，改善了水分狀況，具有明顯提高小麥抗旱性的生理效應(yīng)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在干旱脅迫下，小麥幼苗的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)均有顯著的變化， 脯氨酸、過(guò)氧化氫 、谷胱甘肽、抗壞血酸、丙二醛和可溶性糖濃度含量均明顯增多， POP和POD活性也明顯增強(qiáng)，說(shuō)明干

23、旱脅迫對(duì)植物有很大的影響。 干旱對(duì)植物的傷害主要表現(xiàn)在一下幾個(gè)方面：（1）各部位間水分重新分配。水分不同時(shí)，不同器官不同組織間的水分，按各部位的水勢(shì)大小重新分配。水勢(shì)高的部位的水分流向水勢(shì)低的部位。 （2）膜受損傷。缺水時(shí)，正常的膜雙層結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)孔隙，會(huì)滲出大量溶質(zhì)。脂質(zhì)雙層缺水時(shí)也會(huì)替換膜蛋白，與溶質(zhì)一起滲漏，所以喪失選擇透性，破壞細(xì)胞區(qū)室化，膜上酶的活性也喪失。（3）光合作用減弱。光合作用對(duì)缺水特別敏感。水分虧缺時(shí)，氣孔開(kāi)度減少甚至完全關(guān)閉，影響CO2的吸收，光合速率就下降。（4）滲透調(diào)節(jié)。植物缺水時(shí)另一個(gè)顯著效應(yīng)是由于溶質(zhì)積累，而使?jié)B透勢(shì)下降。征對(duì)以上干旱對(duì)植物造成的傷害，所以我們應(yīng)該采取相應(yīng)的措