生物復(fù)習(xí)資料

1、 第五章植物的花藥和花粉培養(yǎng)(一)、 概念及意義1概念花藥培養(yǎng)其外植體是植物雄性生殖器官的一部分，就培養(yǎng)方法和技術(shù)來(lái)講，屬于器官培養(yǎng)的范疇?；ǚ叟囵B(yǎng)的精確定義是：將處于一定發(fā)育階段的花粉從花藥中分離出來(lái)，再加以離體培養(yǎng)。有時(shí)花粉培養(yǎng)也稱(chēng)為小孢子培養(yǎng)(microspore culture)。從培養(yǎng)方法和技術(shù)方面來(lái)講，它屬于細(xì)胞培養(yǎng)的范疇。2單倍體植物的特點(diǎn)所謂單倍體(haploid)是指具有配子體染色體數(shù)的孢子體(植物個(gè)體)。單倍體植物有三個(gè)明顯的特點(diǎn)：· 體細(xì)胞染色體數(shù)減半；生長(zhǎng)發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減??；雌雄配子嚴(yán)重?cái)∮械纳踔敛荒苓M(jìn)入有性世代。3單倍體的應(yīng)用潛力·

2、 迅速獲得純合型材料，縮短育種年限· 獲得育種中間材料· 與誘變育種相結(jié)合可以提高誘變頻率· 與細(xì)胞融合相結(jié)合更具有實(shí)際應(yīng)用意義· 作為遺傳工程受體更為有效· 用作基礎(chǔ)遺傳研究的各個(gè)領(lǐng)域(二)、花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)的基本程序是：外植體選擇外植體(花蕾)預(yù)處理外植體消毒剝?nèi)』ㄋ幗臃N誘導(dǎo)培養(yǎng)分化培養(yǎng)(三)、花粉及小孢子培養(yǎng)1取材時(shí)期的確定2花粉或小孢子的分離3培養(yǎng)方法 ·花藥看護(hù)培養(yǎng) ·花粉懸浮培養(yǎng) ·雙層培養(yǎng)(四)、單倍體植株的鑒定與二倍化1鑒定方法：形態(tài)學(xué)鑒定 染色體分析2單倍體植株的二倍化：繼代加倍 創(chuàng)傷法加倍 秋水

3、仙素處理加倍第六章植物器官和組織培養(yǎng)器官培養(yǎng)（Organ culture ）植物某一器官的全部或部分或器官原基的離體培養(yǎng)，包括根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等。組織培養(yǎng)（Tissue culture）指形成層組織、分生組織、表皮組織、薄壁組織和各種器官組織以及愈傷組織的培養(yǎng)。一、莖的培養(yǎng)1、類(lèi)型莖尖培養(yǎng)：10-100mm的莖尖分生組織莖段培養(yǎng)：帶有腋(側(cè))芽或葉柄、長(zhǎng)幾厘米的莖節(jié)段進(jìn)行離體培養(yǎng)（快繁）嫩莖段常作為快速繁殖的外植體2、作用無(wú)性系快速繁殖；培養(yǎng)無(wú)病毒苗，品種改良；理論基礎(chǔ)研究。3、建立無(wú)菌材料及培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)表面消毒的莖段在無(wú)菌條件下，切成幾厘米長(zhǎng)帶節(jié)的節(jié)段，接種在固體培養(yǎng)基上。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后

4、，在莖段可直接發(fā)生不定芽，或先誘導(dǎo)形成愈傷組織，再脫分化形成再生苗。把再生苗進(jìn)行切割，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，便可得到完整的小植株。4、莖的培養(yǎng)發(fā)育方向腋芽萌發(fā)脫分化后產(chǎn)生胚狀體脫分化后直接產(chǎn)生不定器官脫分化后形成愈傷組織5、影響發(fā)育方向的因素外植體大?。何⑿瓮庵搀w或分生組織易產(chǎn)生愈傷組織培養(yǎng)條件：溫度，光照培養(yǎng)基生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)和濃度：細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的配比。二、根的培養(yǎng) 在離體根培養(yǎng)中，自然條件下生長(zhǎng)在土壤中的根要解決消毒問(wèn)題是非常困難的，常用無(wú)菌苗的根作為培養(yǎng)材料。根的培養(yǎng)過(guò)程：種子常規(guī)表面消毒，在無(wú)菌條件下在培養(yǎng)基上萌發(fā)。 從根尖一端切取10 mm長(zhǎng)接種于固體培養(yǎng)基中。 暗條件下培養(yǎng)側(cè)

5、根發(fā)生，可以切下側(cè)根的根尖作為新的培養(yǎng)材料再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。三、葉的培養(yǎng)很多植物的葉片具有很強(qiáng)的再生能力，可以作為外植體?；九囵B(yǎng)過(guò)程：取葉片 表面消毒 平放在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)大多植物的葉組織在離體培養(yǎng)條件下先形成愈傷組織，再分化出胚狀體、莖、葉和根。第七章 植物愈傷組織培養(yǎng)第一節(jié) 外植體的制備1.一般植物組織都能誘發(fā)愈傷組織。 材料必須完全無(wú)菌 外植體的大小第二節(jié) 愈傷組織的 培養(yǎng)一、培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基只有部分植物組織能夠培養(yǎng)和維持下去，大多數(shù)組織需要添加各種各樣的附加物，如維生素、氨基酸、糖醇，生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等。二、愈傷的培養(yǎng)方式：培養(yǎng)分為固體和液體培養(yǎng)兩大類(lèi)。三、培養(yǎng)條件l 1、光照：

6、愈傷組織的誘導(dǎo)需弱光或不需光，分化需光。繼代培養(yǎng)一般需光。l 2、溫度：一般采用2428的恒溫條件進(jìn)行。l 3、濕度：較大，以免引起培養(yǎng)基干縮。第三節(jié) 愈傷組織形態(tài)的發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)物在某些條件下，可以再分化產(chǎn)生不定芽或根的分生組織甚至是胚狀體，這些有結(jié)構(gòu)的組織發(fā)育成苗。一 、愈傷組織形態(tài)發(fā)生的途徑1.器官的形成 在分化時(shí)，愈傷組織的表層和內(nèi)部都可形成分生中心。芽多發(fā)生在愈傷組織的表層，屬外起源。 根發(fā)生在組織的深處，與整體植株發(fā)生類(lèi)似，是內(nèi)起源。2.體細(xì)胞胚的發(fā)生愈傷組織 體細(xì)胞胚 植株二、激素對(duì)愈傷組織分化的影響 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在分化過(guò)程中的作用是極為明顯的，合適的植物生長(zhǎng)物質(zhì)配比在器官

7、分化中起著重要的作用。器官分化的植物激素控制理論 大多數(shù)植物組織或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理論。 生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例小時(shí)則產(chǎn)生苗，比例大時(shí)則生根，而兩種激素的比例適中時(shí)，則產(chǎn)生無(wú)結(jié)構(gòu)的愈傷組織。第四節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)與分化一、 外植體形成愈傷組織的時(shí)期及特點(diǎn)。從外植體脫分化形成愈傷組織大致可分為三個(gè)時(shí)期：起動(dòng)期 （誘導(dǎo)期）、分裂期和分化期。 1. 誘導(dǎo)期: 誘導(dǎo)期是細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的時(shí)期，是愈傷組織形成起點(diǎn)。 特點(diǎn)：在誘導(dǎo)期，代謝活化了，細(xì)胞內(nèi)合成代謝迅速進(jìn)行，但是細(xì)胞的大小仍然和外植體時(shí)一樣，沒(méi)有多大改變。2.分裂期：外植體中已分化的活細(xì)胞在外源激素的作用下，外層細(xì)胞出現(xiàn)了

8、分裂，細(xì)胞的體積縮小，逐漸回復(fù)到分生組織狀態(tài)，稱(chēng)為回復(fù)變化。在回復(fù)變化時(shí)，細(xì)胞通過(guò)脫分化的起動(dòng)期而進(jìn)入分裂，并開(kāi)始形成愈傷組織。特征：外層細(xì)胞進(jìn)行分裂，而中間的細(xì)胞不分裂。另外還有細(xì)胞數(shù)目增加，體積變小；細(xì)胞核和核仁增到最大等3.分化期特點(diǎn)：分化結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程加速，超過(guò)了回復(fù)變化。外層細(xì)胞的分裂逐漸減慢，甚至停止，為次生生長(zhǎng)所代替，大量次生結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。在這時(shí)期中細(xì)胞的伸展和分裂處于平衡，故細(xì)胞的平均大小往往沒(méi)有變化。二、 愈傷組織的質(zhì)地愈傷組織的質(zhì)地是有明顯差異的，有的堅(jiān)實(shí)，有的脆。脆的與愈傷組織是懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)的最合適的材料，容易使組織處于分散狀態(tài)。 第八章 植物細(xì)胞培養(yǎng)與次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)一、單

9、細(xì)胞的分離由完整的植物器官分離單細(xì)胞由培養(yǎng)組織中分離單細(xì)胞二、懸浮培養(yǎng)特點(diǎn)1. 細(xì)胞可以不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；2. 能夠提供大量較為均勻的細(xì)胞，為研究細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化創(chuàng)造方法和條件。懸浮培養(yǎng)中既有單細(xì)胞，也有細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢，最后增長(zhǎng)停止的細(xì)胞周期。細(xì)胞的生長(zhǎng)呈S型曲線(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn)：滯后期（延遲期）：細(xì)胞很少分裂，其長(zhǎng)短與接種量大小和繼代時(shí)原種細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期有關(guān)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞數(shù)目增加，增長(zhǎng)速率保持不變直線(xiàn)生長(zhǎng)期：細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育最明顯的時(shí)期緩慢期：生長(zhǎng)逐漸緩慢：培養(yǎng)液消耗

10、將盡，有毒代謝物質(zhì)增多，氧氣減少靜止期：生長(zhǎng)幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞數(shù)目增加極少，甚至開(kāi)始死亡。三、單細(xì)胞培養(yǎng)液體淺層培養(yǎng)法固體平板培養(yǎng)法看護(hù)培養(yǎng)法微室培養(yǎng)法1、液體淺層培養(yǎng)法將懸浮在培養(yǎng)液中的細(xì)胞過(guò)濾，得到游離單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)-培養(yǎng)在淺層液體培養(yǎng)基中用途：主要用來(lái)增殖細(xì)胞。特點(diǎn)：有利于有毒物質(zhì)的擴(kuò)散；有利于氣體交換；不利于定點(diǎn)觀(guān)察；單細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂后，難以得到單細(xì)胞系。2、固體平板培養(yǎng)法2-1 含義及用途：l 含義： 是將單個(gè)細(xì)胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合后平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)方法。該方法是Bergmann(1960年)首創(chuàng)。l 用途：是為了分離單細(xì)胞無(wú)性系，研究其生理、生化遺傳上的差

11、異而設(shè)計(jì)的一種單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、原生質(zhì)體及融合產(chǎn)物的培養(yǎng)。l 2-2 特點(diǎn)可以定點(diǎn)觀(guān)察；分離單細(xì)胞系比液體淺層培養(yǎng)容易；培養(yǎng)細(xì)胞氣體交換不暢。3、看護(hù)培養(yǎng)法3-1 看護(hù)培養(yǎng)的含義及用途含義：指用一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織來(lái)看護(hù)單個(gè)細(xì)胞，并使其生長(zhǎng)和增殖的方法。用途：誘導(dǎo)形成單細(xì)胞系。Muir(1954)首先用此法培養(yǎng)出煙草單細(xì)胞株。Sharp(1972)成功將此法用于番茄的花粉培養(yǎng)，誘導(dǎo)花粉形成單倍體細(xì)胞系。3-4 特點(diǎn)：v （1）效果好，易于成功。v （2）簡(jiǎn)便易行。v （3）不能在顯微鏡下直接觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程。 4、微室培養(yǎng)法4-1 微室培養(yǎng)的含義及用途v 含義：即將細(xì)胞培養(yǎng)在

12、很少量的培養(yǎng)基中。v 用途：主要用來(lái)觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、形成細(xì)胞團(tuán)的過(guò)程。4-2 微室培養(yǎng)特點(diǎn)：在培養(yǎng)過(guò)程中可以連續(xù)進(jìn)行顯微觀(guān)察，將一個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和形成細(xì)胞團(tuán)的全部過(guò)程記錄下來(lái)。六、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)與次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)（一）、概述 植物次生代謝產(chǎn)物是指植物中一大類(lèi)并非植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長(zhǎng)發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過(guò)程稱(chēng)為次生代謝。1 植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類(lèi)型植物次生產(chǎn)物種類(lèi)繁多（據(jù)保守估計(jì)已超過(guò)2萬(wàn)種），如酚類(lèi)化合物、醌 類(lèi)、生物堿、胺類(lèi)、有機(jī)酸等植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。 李時(shí)珍（1

13、593）在本草綱目中所開(kāi)列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25的法定藥品來(lái)自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來(lái)源，可以用于殺蟲(chóng)、殺菌，而對(duì)環(huán)境和人畜無(wú)害，是理想的環(huán)保產(chǎn)品。3規(guī)?；?xì)胞培養(yǎng)是生產(chǎn)植物次生產(chǎn)物的理想途徑·保護(hù)生態(tài)環(huán)境· 提高生產(chǎn)效率· 發(fā)展新型生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)第十一章 植物體細(xì)胞突變體的篩選離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點(diǎn)體細(xì)胞變異的細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)體細(xì)胞變異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)體細(xì)胞無(wú)性系變異的誘導(dǎo)與選擇一、 離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點(diǎn)（一）、離體培養(yǎng)中的遺傳穩(wěn)定性離體培

14、養(yǎng)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)是有絲分裂。有絲分裂的DNA半保留復(fù)制和染色體均等分裂機(jī)制，從理論上可以保證離體培養(yǎng)物在一般情況下的遺傳穩(wěn)定性。（二）、離體培養(yǎng)條件下遺傳變異的特點(diǎn)1.普遍性：變異可發(fā)生在各種培養(yǎng)類(lèi)型中；變異發(fā)生在各種植物的培養(yǎng)中；變異發(fā)生與培養(yǎng)類(lèi)型有關(guān)。2.局限性：從表型上看，在不同植物類(lèi)型中經(jīng)常發(fā)生的體細(xì)胞變異主要是植株形態(tài)（株高、葉形、葉色等）、生長(zhǎng)勢(shì)、育性、某些抗性等性狀的變異。從生理生化特性上看，容易出現(xiàn)同功酶譜、次生代謝的消長(zhǎng)等變異。3.嵌合性：嵌合性是指同一有機(jī)體中同時(shí)存在有遺傳組成不同的細(xì)胞，它是組織培養(yǎng)中常見(jiàn)的現(xiàn)象二、 體細(xì)胞變異的細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ) （一）、DNA核內(nèi)重復(fù)復(fù)制（二

15、）、染色體斷裂與重組（三）、非正常有絲分裂三、 體細(xì)胞變異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)（一）、堿基突變（二）、DNA序列的選擇性擴(kuò)增與丟失（三）、轉(zhuǎn)座子活化 ( 四 ) 、DNA甲基化四、 體細(xì)胞無(wú)性系變異的誘導(dǎo)與選擇1直接篩選法 2間接篩選法舉例 茄子抗冷細(xì)胞變異系的選育第十二章 人工種子人工種子的概念繁殖體類(lèi)型及生產(chǎn)化人工種子包被人工種子的發(fā)展和應(yīng)用前景一、 人工種子的概念及類(lèi)型 1.人工種子（artificial seeds）又稱(chēng)合成種子（synthetic seeds）或體細(xì)胞種子（somatic seeds）。任何一種繁殖體，無(wú)論是在涂膜膠囊中包裹的、裸露的或經(jīng)過(guò)干燥的，只要能夠發(fā)育成完整的植株

16、，均可稱(chēng)之為人工種子。 2. .人工種子根據(jù)包被的需要程度可分為三類(lèi)：·第一類(lèi)是裸露的或休眠的繁殖體·第二類(lèi)為人工種皮包被的繁殖體·第三類(lèi)是水凝膠包埋再包被人工種皮的繁殖體3.人工種子具有以下優(yōu)點(diǎn)：·其一，在無(wú)性繁殖植物中，有可能建立一種高效快速的繁殖方法；·其二，可以對(duì)優(yōu)異雜種種子不通過(guò)有性制種而快速獲得大量種子，特別是對(duì)于那些制種困難的植物更具有重要的實(shí)用意義；·其三，對(duì)于一些不能正常產(chǎn)生種子的特殊植物材料如三倍體、非整倍體、基因工程植物等，有可能通過(guò)人工種子在短期內(nèi)加大繁殖應(yīng)用；·其四，與田間制種相比，可以節(jié)省制種用地

17、，且不受季節(jié)限制，可以實(shí)現(xiàn)工廠(chǎng)化生產(chǎn)；·其五，與利用試管苗相比，可以避免移栽困難，且可以實(shí)現(xiàn)機(jī)械化操作，同時(shí)還便于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸。二 、 繁殖體的類(lèi)型及其生產(chǎn)化(一)、繁殖體的類(lèi)型·體細(xì)胞胚·微芽·微型變態(tài)器官 (二)、繁殖體的生產(chǎn)1體細(xì)胞胚的規(guī)?；a(chǎn)2微型營(yíng)養(yǎng)變態(tài)器官繁殖體的培養(yǎng)3芽繁殖體的培養(yǎng)二、 人工種子包被 （一）、繁殖體的預(yù)處理·體細(xì)胞胚適度脫水干燥和強(qiáng)制休眠； ·微型變態(tài)器官繁殖體表面消毒處理；·芽為繁殖體的老化處理。（二）、繁殖體的包埋·海藻酸鈉作包埋介質(zhì)的操作程序是：在配制好的海藻酸鈉溶液中，按一定比

18、例加入繁殖體并混勻，然后將其逐滴滴入2.0%2.5%的CaCl2溶液中，經(jīng)2030 min的離子交換作用，即能形成含有繁殖體并具有一定剛性的小球珠（bead），再用水漂洗20 min以終止反應(yīng)。此時(shí)的人工種子是一種膠囊狀結(jié)構(gòu)，將其晾干后可貯存或播種。三、 人工種子的發(fā)展和應(yīng)用前景 ·1.人工種子可以貯藏，可以周年生產(chǎn)，避免了試管苗應(yīng)用中由于季節(jié)性生產(chǎn)而帶來(lái)的諸多矛盾。·2.人工種子可以直接播種，減少了試管苗移栽在操作和管理上的困難，可以實(shí)現(xiàn)機(jī)械化操作和常規(guī)的田間管理。·3.由于可以長(zhǎng)距離運(yùn)輸，因此，人工種子可以建立相對(duì)集中的大型生產(chǎn)企業(yè)，實(shí)現(xiàn)資源和技術(shù)優(yōu)化。第十三

19、章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理和方法1 動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)l 無(wú)細(xì)胞壁l 倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢l 需氧量少，對(duì)攪拌敏感l(wèi) 聚集體形成l 原代細(xì)胞培養(yǎng)50代即開(kāi)始退化2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)定義 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動(dòng)物體內(nèi)取出細(xì)胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無(wú)菌、適溫和豐富的營(yíng)養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或者組織生存、生長(zhǎng)并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門(mén)技術(shù)。3 生長(zhǎng)特性l 貼附生長(zhǎng)型 如神經(jīng)細(xì)胞l 懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞 如血液白細(xì)胞，淋巴組織細(xì)胞等4. 體外培養(yǎng)條件1.溫度 溫度過(guò)低細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢甚至不生長(zhǎng)，過(guò)高導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這主要是由酶和蛋白質(zhì)所需的最適溫度決定的。2.pH 過(guò)酸過(guò)堿導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這主要與蛋白質(zhì)的變性和細(xì)胞膜的

20、結(jié)構(gòu)有關(guān)。 3.滲透壓 細(xì)胞內(nèi)外可溶于水的物質(zhì)比例和種類(lèi)決定細(xì)胞的膨脹與收縮程度。當(dāng)某一種極溶于水的物質(zhì)在細(xì)胞外濃度過(guò)大時(shí)，有可能導(dǎo)致細(xì)胞干癟死亡。4.營(yíng)養(yǎng)物 和水一起，又叫細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中含有細(xì)胞增殖或生長(zhǎng)所需各種物質(zhì)。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括：N源、C源，這些物質(zhì)與能量提供有關(guān)；無(wú)機(jī)鹽、維生素、激素。5.水 水是細(xì)胞需要數(shù)量最大的物質(zhì)。6.無(wú)菌條件 體外細(xì)胞培養(yǎng)僅僅是對(duì)所需的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，但環(huán)境(如空氣)中有各種其它微生物，必須對(duì)所需細(xì)胞進(jìn)行無(wú)雜菌的隔離培養(yǎng)。5.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式 一種是群體培養(yǎng)，將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層； 另一種是克隆培養(yǎng)，將

21、高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個(gè)細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)增殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱(chēng)為克隆（clone）。第十四章干細(xì)胞研究及其應(yīng)用1、 干細(xì)胞的概念與分類(lèi)細(xì)胞的分化過(guò)程中，細(xì)胞往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最終衰老死亡。機(jī)體在發(fā)展適應(yīng)過(guò)程中為了禰補(bǔ)這一不足，保留了一部分未分化的原始細(xì)胞，稱(chēng)之為干細(xì)胞（stem cell）。一旦生理需要，這些干細(xì)胞可按照發(fā)育途徑通過(guò)分裂而產(chǎn)生分化細(xì)胞。干細(xì)胞有以下特點(diǎn)：l （1）干細(xì)胞本身不是處于分化途徑的終端。l （2）干細(xì)胞能無(wú)限的增殖分裂。l （3）干細(xì)胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)。l （4）干細(xì)胞通

22、過(guò)兩種方式生長(zhǎng) ，一種是對(duì)稱(chēng)分裂-形成兩個(gè)相同的干細(xì)胞，另一種是非對(duì)稱(chēng)分裂-由于細(xì)胞質(zhì)中的調(diào)節(jié)分化蛋白不均勻地分配，使得一個(gè)子細(xì)胞不可逆的走向分化的終端成為功能專(zhuān)一的分化細(xì)胞；另一個(gè)保持親代的特征，仍作為干細(xì)胞保留下來(lái)。分化細(xì)胞的數(shù)目受分化前干細(xì)胞的數(shù)目和分裂次數(shù)控制。按分化潛能的大小 ，干細(xì)胞可分為三種類(lèi)型：l 全能性干細(xì)胞，它具有形成完整個(gè)體的分化潛能。如胚胎干細(xì)胞，具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征和很強(qiáng)的分化能力，可以無(wú)限增殖并分化成為全身200多種細(xì)胞類(lèi)型，進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織、器官。l 多能性干細(xì)胞，這種干細(xì)胞具有分化出多種細(xì)胞組織的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，發(fā)育潛能

23、受到一定的限制，骨髓多能造血干細(xì)胞是典型的例子，它可分化出至少十二種血細(xì)胞，但不能分化出造血系統(tǒng)以外的其它細(xì)胞。l 單能干細(xì)胞（也稱(chēng)專(zhuān)能、偏能干細(xì)胞），這類(lèi)干細(xì)胞只能向一種類(lèi)型或密切相關(guān)的兩種類(lèi)型的細(xì)胞分化，如上皮組織基底層的干細(xì)胞、肌肉中的成肌細(xì)胞。2、 干細(xì)胞應(yīng)用隨著基因工程、胚胎工程、細(xì)胞工程等各種生物技術(shù)的快速發(fā)展，按照一定的目的，在體外人工分離、培養(yǎng)干細(xì)胞已成為可能，利用干細(xì)胞構(gòu)建各種細(xì)胞、組織、器官作為移植器官的來(lái)源，這將成為干細(xì)胞應(yīng)用的主要方向。第十五章 動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體第一節(jié) 細(xì)胞融合概述一、細(xì)胞融合的定義細(xì)胞融合（cell fusion)，又稱(chēng)體細(xì)胞雜交，是指兩個(gè)或更

24、多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過(guò)膜 融合形成單個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。二、動(dòng)物細(xì)胞融合的意義u 理論上任何細(xì)胞都有可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而實(shí)現(xiàn)基因交流。u 融合過(guò)程不存在有性雜交過(guò)程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。u 體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來(lái)自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，雙親的細(xì)胞器亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新 的核外遺傳系統(tǒng)。第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞融合的常用方法一、仙臺(tái)病毒法仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段：兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4條件下病毒附著在細(xì)胞膜上。并使兩細(xì)胞相互凝聚；在37中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時(shí)需 要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2；細(xì)胞膜

25、連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時(shí)需Ca2+和ATP；融合成巨大細(xì)胞，仍需ATP 。二、聚乙二醇（PEG）法u 優(yōu)點(diǎn)是用法簡(jiǎn)單，融合效果穩(wěn)定。u 通常用分子量低于1000的PEG作融合劑較好。u PEG溶液在pH6.0時(shí)細(xì)胞融合率較高。PEG的作用機(jī)理： Kao等認(rèn)為，由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另外，PEG能增加類(lèi)脂膜的流動(dòng)性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。 三、電融合法電融合法的優(yōu)點(diǎn)：u 融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞傷害??；u 裝置精巧、方法簡(jiǎn)單、可在

26、顯微鏡下觀(guān)察或錄像觀(guān)察融合過(guò)程；u 免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程、誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。電融合的基本過(guò)程：細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場(chǎng)通電后，電流即通過(guò)原生質(zhì)體而不是通過(guò)溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。 第三節(jié) 雜種細(xì)胞的篩選根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細(xì)胞中所含有核的類(lèi)型，可將其分為以下幾種類(lèi)型：異核細(xì)胞：非同源細(xì)胞的融合體。同核細(xì)胞：兩個(gè)相同細(xì)胞的融合體。多核細(xì)胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。常用的雜種細(xì)胞篩選方法：

27、u 基于藥物抗性所建立的雜種篩選u 基于營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選u 基于物理特性的篩選第四節(jié) 細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體一、單克隆抗體的概念 只針對(duì)某一抗原決定簇的抗體分子稱(chēng)為單克隆抗體。二、單克隆抗體的應(yīng)用Ø 單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可用于疾病診斷，提高疾病診斷的準(zhǔn)確性。Ø 利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成本，同時(shí)也增加了疫苗的安全性。Ø 單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類(lèi)戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛在技術(shù)。Ø 單克隆抗體技術(shù)還可廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，從而推動(dòng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展。 第十六章 核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆