常用PCR技術(shù)復(fù)習(xí)進(jìn)程

1、常用PCR技術(shù)常用PCR技術(shù)Hot start PCR:熱啟動PCR,是提高PCR特異性和可信度的最好的方法之一。通過阻止溫度升 高到變性溫度前的PCR反應(yīng)的發(fā)生而阻止引物與基因組 DNA上潛在的高同源 性區(qū)域結(jié)合引起的錯誤引發(fā)（mispriming）。同時熱啟動還使引物通過互補區(qū) 域堿基配對而擴(kuò)增產(chǎn)生的引物二聚體量大大降低。熱啟動PCR可通過三種方式實現(xiàn)：1）手動熱啟動：配置反應(yīng)液時忽略一種關(guān)鍵成分（聚合酶、 Mg離子或dNTP）,當(dāng)反應(yīng)液升溫到80 C以上或變性溫度時再加入。手動熱啟動操作繁瑣，而且因為增加了一次開蓋操作，增加了污染的機會，同時由于管與管間的加樣誤差，可能使平行樣品間擴(kuò)增結(jié)

2、果產(chǎn)生差異；更簡單的手動熱啟動是在冰上配置反應(yīng)液，待熱蓋升溫到變性溫度，按下擴(kuò)增儀的暫停鍵，立即將反應(yīng)管放在儀器上開始反應(yīng)，當(dāng)然這種方法的可信度也最低2）將聚合酶用石蠟珠裹（或在反應(yīng)液上部滴一滴融化的石蠟，待其凝固后，將 聚合酶加到石蠟層的上部）使其與反應(yīng)液的其它成分分開，直到反應(yīng)液升溫融 化石蠟后，酶才進(jìn)入反應(yīng)液中。3）使用熱啟動DNA聚合酶，這種酶通過化學(xué)修飾或與抗體結(jié)合，常溫下沒有活 性，而只有當(dāng)反應(yīng)液加熱到變性溫度一段時間后，酶的活性才被釋放。使用熱 啟動DNA聚合酶相比手動熱啟動操作簡便，缺點是用熱啟動DNA聚合酶的價格較高。Touchdown PCR:降落PCR,是另一種簡單的降低

3、非特異性擴(kuò)增的方法，可規(guī)避對PCR循環(huán)條件進(jìn)行耗時的優(yōu)化實驗。降落PCR過程中，首輪循環(huán)的退火溫度設(shè)置在比引物的 解鏈溫度高出幾度，使每個后續(xù)循環(huán)的退火溫度逐漸降到，直到退火溫度降到 等于引物的解鏈溫度或比引物的解鏈溫度低幾度，后續(xù)的循環(huán)在此較低的退火 溫度下完成，整個程序的退火溫度可降低 10-15C。在最初幾個循環(huán)內(nèi)，高溫使 引物的非特異性結(jié)合難以發(fā)生，只有同引物互補程度最大的模板序列（很可能 這一序列就是我們感興趣的序列）才能發(fā)生退火事件，因此保證靶序列得到優(yōu) 先擴(kuò)增。后續(xù)循環(huán)降低退火溫度可保證擴(kuò)增效率，盡管最終的退火溫度降低到 足以使非特異性產(chǎn)物有效擴(kuò)增的溫度，由于靶分子已經(jīng)開始指數(shù)期

4、擴(kuò)增，因此 抑制非特異性產(chǎn)物的進(jìn)一步形成。Nested PCR巢式PCR,通過使用兩套引物來進(jìn)行兩次連續(xù)的反應(yīng)，用來增加 DNA擴(kuò)增的 特異性。在第一次反應(yīng)中產(chǎn)生的產(chǎn)物可能包含非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，然后使用兩 個新的、結(jié)合位點位于原引物內(nèi)部的引物進(jìn)行第二次反應(yīng)。第二套引物的使用可提高反應(yīng)的特異性，增大單一產(chǎn)物產(chǎn)生的可能性。巢式PCR在提高特異性的同時，也增加了檢測的靈敏度。Multiplex-PCR :多重PCR,指在一個PCR管中使用多對引物同時擴(kuò)增超過一個的靶基因。同時分析單拷貝基因組的多個基因可避免分別擴(kuò)增這些靶基造成對試劑和模板的浪費。使用多重PCR檢測引起遺傳疾病的基因突變時，可以同時擴(kuò)

5、增6個以上的靶點，也可同時檢測食品中多種病原菌的存在。在多重 PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification（MLPA ,多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)）使用單對引物即可完成對多個靶基因的擴(kuò)增，避免了多重PCR耗時的優(yōu)化步驟。Long PCR （Long distance PCR, Long range PCR :長距離PCR,普通的Taq聚合酶一般只能擴(kuò)增不超過 3-5kb的片段，通過使用特定的聚合酶和緩沖液成分，來擴(kuò)增較長的DNA鏈（10-40kb以上）。長距離PCR時經(jīng)常會在10-15個循環(huán)后，使每個循環(huán)的延伸時間都比上一循環(huán)的時

6、間增加10秒左右，以補償聚合酶活性的損失。Clony PCR:菌落PCR,通過PCR手段來迅速篩選陽性克隆子。使用滅菌的牙簽將菌落直接挑到反應(yīng)混合液中，通過PCR預(yù)變性步驟的高溫使細(xì)菌的基因組釋放作為PCR反應(yīng)的模板。菌落PCR中使用的引物定位在插入位點外側(cè)的載體區(qū)，因此盡管插入的序列各不相同，也不影響擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。RT-PCR （Reverse Transcription PCR :逆轉(zhuǎn)錄PCR,是用來擴(kuò)增、分離和鑒定細(xì)胞或組織的信使RNA (mRNA)的技術(shù)。反應(yīng)由兩個階段組成：1 .使用逆轉(zhuǎn)錄酶，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) "R僑成與RNA互補的cDNA(complementary DN

7、A)2 .使用PCR擴(kuò)增特異性的cDNA。由于PCR的預(yù)變性步驟可以用來失活逆轉(zhuǎn)錄酶，所以兩個階段可在同一管內(nèi)完成。一些DNA聚合酶如Tth也有RT活性，因此可以單獨使用這種酶來完成兩步反應(yīng)。RT-PCR可廣泛用于表達(dá)圖譜分析(用來確定基因的表達(dá))；鑒定 RNA轉(zhuǎn)錄子的序列，當(dāng)相關(guān)的基因序列已知時，還可進(jìn)一步知道基因組上外顯 子和內(nèi)含子的位置；檢測病毒例如 HIV、引起麻疹和腮腺炎的病毒。RACE-PCR (rapid amplification of cDNA ends):一種RT-PCR方法，當(dāng)對DNA序列信息了解較少時，使用單個特異性引物加一 個接頭引物來擴(kuò)增cDNA的5'端(對

8、應(yīng)轉(zhuǎn)錄的起始位點)或 3'端從而產(chǎn)生新的 cDNA,重疊的RACE產(chǎn)物可結(jié)合起來產(chǎn)生全長的cDNA片段。DD-PCR (differential display):差異顯示技術(shù)，用來鑒定不同組織中差異表達(dá)的基因。將不同組織的 RT-PCR 產(chǎn)物用短的、非特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后在凝膠上比對來源于不同組織的條 帶，只在某種組織中才出現(xiàn)的條帶被認(rèn)為是差異表達(dá)的。Asymmetric PCR:不對稱PCR,可選擇性白擴(kuò)增出靶DNA的一條鏈，從而用于測序反應(yīng)或制備 單鏈雜交探針。反應(yīng)中限制一個引物的加入量，隨著這一引物的用盡，后續(xù)的 擴(kuò)增中另一引物延伸的產(chǎn)物量大大過量。這一技術(shù)的關(guān)鍵是使用的限

9、制引物的 量要合適，引物量過多，則產(chǎn)物主要是雙鏈DNA;引物量過少，在前幾輪循環(huán)就被耗盡，結(jié)果導(dǎo)致單鏈的產(chǎn)量減少。在不對稱PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展出Linear-After-The-Exponential-PCR （LATE-PCR ,線性指數(shù) PCR）,使數(shù)量限制的引物比 過量的引物的解鏈溫度更高，從而維持較高的反應(yīng)效率。Assembly PCR（也稱作 Polymerase Cycling Assembly或 PCA）：通過使用多個具有短重疊區(qū)的長的寡核甘酸來合成長的DNA鏈的方法。通過寡核甘酸產(chǎn)生一條條正向或反向 DNA鏈，而寡核甘酸的重疊區(qū)則確定鏈組裝 的順序，因此可有選擇性的產(chǎn)生最終的長鏈

10、DNA分子。Methylation-specific PCR （MSP）:甲基化特異性的PCR,用于研究基因組CpG島的甲基化模式。首先是用亞硫酸 氫鈉處理靶DNA,使未甲基化的胞喀呢堿基轉(zhuǎn)化成尿喀呢，尿喀噬可被引物識 別成胸腺喀呢，然后分別用能區(qū)分修飾和非修飾模板的不同的引物來擴(kuò)增（一 對可識別胞喀噬引物擴(kuò)增原來甲基化的模板，令一對可識別尿喀噬或胸腺喀呢 的引物擴(kuò)增非甲基化的模板）。結(jié)合定量 PCR,可以對甲基化程度進(jìn)行定量。Ligation-mediated PCR: 連接介導(dǎo)PCR,首先使用小的寡核甘酸接頭連接靶 DNA片段，然后選擇與接 頭結(jié)合的PCR引物來擴(kuò)增未知的靶片段。這一技術(shù)主

11、要用在 DNA測序、染色 體步移技術(shù)(genome walking)和DNA指紋圖譜等。AFLP (Amplified fragment length polymorphism ):擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，通過擴(kuò)增使不同生物基因組呈現(xiàn)不同長度的片段。AP-PCR (arbitrary primed)/RAPD (random amplified polymorphic DNA):機擴(kuò)增多態(tài)性DNA,使用隨機寡核甘酸片段來擴(kuò)增序列未知的靶基因，形成基 因組指紋圖譜，用來分析物種的相關(guān)性。Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列PCR

12、,使引物定位在具有長度多態(tài)性的靶基因區(qū)，通過 在凝膠電泳后對產(chǎn)物的大小進(jìn)行分析來研究基因分型。Allele-specific PCR :等位基因特異性PCR,設(shè)計引物時選擇在基因組的多態(tài)性區(qū)域，使等位基因的 突變定位在(或接近)引物的3'端，在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆磻?yīng)條件下，存在錯配堿基的引 物不能起始復(fù)制，而只有完全匹配的引物才能起始復(fù)制，產(chǎn)生的產(chǎn)物因此顯示 不同的基因型。InterSequence-Specific PCR(ISSR-PCR)一種DNA指紋圖譜技術(shù)，所選的引物定位在基因組的片段重復(fù)區(qū)（如 Alu族），擴(kuò)增后產(chǎn)生基于不同產(chǎn)物長度的唯一的指紋圖譜。Inverse PCR反向PCR,允許擴(kuò)增已知序列側(cè)翼的 DNA區(qū)。首先將靶DNA用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行多輪消化，然后連接被消化的片段構(gòu)建環(huán)狀的分子，引物設(shè)計成可從序列已知的區(qū)域向外側(cè)延伸，結(jié)果擴(kuò)增出環(huán)狀分子上剩余的序列。Quantitative PCR（Q-PCR）:定量PCR,用來測定樣本中的靶 DNA的量。最初的定量PCR主要是指Competitive PCR （競爭定量PCR）。競爭定量PCR:在反應(yīng)混合物中加入起始拷貝數(shù)已知的內(nèi)部對照，對照具有同靶序列相同的引物結(jié)合位點，但產(chǎn)生的產(chǎn)物長度與靶序列產(chǎn)生的產(chǎn)物長度不同，在PCR過程中對照與靶基因競爭相同的引物。反