血液分析儀五分類技術(shù)原理

1、血液分析儀五分類技術(shù)原理隨著電子技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、激光技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)和新熒光化學(xué)物質(zhì)等各種高 新技術(shù)在血細(xì)胞分析儀中的應(yīng)用.使血細(xì)胞分析儀的檢測原理不斷完善、測量參數(shù)不斷增加、檢測水平不斷提高.尤其在白細(xì)胞五分類技術(shù)方面，已發(fā)展到利用多項(xiàng)技術(shù)（如射頻、細(xì)胞化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)和熒光染色技術(shù)等）聯(lián)合同時檢測一個白細(xì)胞.再用先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)區(qū) 分、辨別經(jīng)上述方法處理后的各自細(xì)胞間的細(xì)胞差別.綜合分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出較為準(zhǔn)確的白細(xì)胞分類結(jié)果。為臨床疾病的診斷、治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。近年來?？梢詫Π准?xì)胞進(jìn)行五分類計(jì)數(shù)的血細(xì)胞分析儀已經(jīng)普遍使用。本文就目前血細(xì)胞五分類測定中常用技術(shù)及其最新應(yīng)

2、用進(jìn)展作一綜述。1血細(xì)胞五分類技術(shù)的原理1.1 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry , FCM）是一種綜合應(yīng)用光學(xué)、機(jī)械學(xué)、流體力學(xué)、電子計(jì)算機(jī)、 細(xì)胞生物學(xué)、分子免疫學(xué)等學(xué)科技術(shù)，使被測溶液流經(jīng)測量區(qū)域，并逐一檢測其中每一個細(xì) 胞的物理和化學(xué)特性，從而對高速流動的細(xì)胞或亞細(xì)胞進(jìn)行快速定量測定和分析的方法。首先，待測細(xì)胞經(jīng)處理或染色后被壓人流動室，與此同時，不含細(xì)胞的緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管人口方向與待測樣品流成一定角度，這樣鞘液就能被包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細(xì)胞在包繞下單行排列，依次通過檢測區(qū)域.在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩個光源信

3、號分別反映了細(xì)胞體積的大小和內(nèi)部的信息.經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號，再通過模，數(shù)轉(zhuǎn)換器.將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識別的數(shù)字信號，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，可將分析結(jié)果顯示在屏幕上。為了保證細(xì)胞單個排列地逐一通過檢測區(qū)域，鞘流技術(shù)在流式細(xì)胞術(shù)中被廣泛應(yīng)用。根據(jù)層流理論，由于兩種液體的流速和壓力不同。在一定條件下樣品溶液與包裹它的鞘液在流動中可以保持相互分離并且同軸。同時鞘液流可以加速樣品溶液中顆粒的流動并迫使他們的流動軌跡保持在液流的中軸線上，使細(xì)胞單排列地逐一通過檢測區(qū)域，這便是所謂的液流聚焦原理1_2阻抗法根據(jù)庫爾特原理，將不良導(dǎo)體血液按一定比例稀釋于等滲的電解液中，在小孔電極的兩側(cè)加一恒流

4、源在負(fù)壓作用下，使稀釋的血細(xì)胞通過小孔。當(dāng)細(xì)胞通過截面時會由于電阻增大產(chǎn) 生相應(yīng)的脈沖，其脈沖的幅度與細(xì)胞的體積成正比，脈沖的頻度與細(xì)胞的數(shù)量成正比。這便是著名的庫爾特原理或稱變阻脈沖原理。利用庫爾特原理可以有效地區(qū)分淋巴及單核細(xì)胞。1.3 激光散射法/多角度偏振光散射技術(shù)根據(jù)光散射理論，當(dāng)激光照射到流動室內(nèi)流過的每一個細(xì)胞時，由于細(xì)胞的物理特性，部分光線從細(xì)胞上經(jīng)不同的角度散射。其中，前向小角度散射光的光強(qiáng)可以反應(yīng)細(xì)胞體積；大角度散射光的光強(qiáng)可以反應(yīng)細(xì)胞核，漿復(fù)雜度和細(xì)胞顆粒的信息；而側(cè)向散射光的光強(qiáng)可以反應(yīng)細(xì)胞膜、核膜、細(xì)胞質(zhì)的變化。因此，可以依據(jù)細(xì)胞表明光散射的特點(diǎn)對細(xì)胞進(jìn)行分類。用激光

5、光源產(chǎn)生的單色光束直接進(jìn)入計(jì)數(shù)池的敏感區(qū)，在不同角度（10度70度）對每個細(xì)胞進(jìn)行掃描分析，測定其散射光強(qiáng)度，從而提供細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)的光散故光散射對細(xì)胞顆粒的構(gòu)型和顆粒射信息。 由于粗顆粒細(xì)胞的散射強(qiáng)度比細(xì)顆粒細(xì)胞更強(qiáng)，質(zhì)量具有很好的區(qū)別能力。多角度偏振散射技術(shù)用偏振激光束射照單個排列細(xì)胞，并進(jìn)一步分辨細(xì)胞。該技術(shù)采用了 l0 度窄角和偏振加消偏振檢測法，分辨能力有所提高。它首先測試中性，單核細(xì)胞，用0度90度的散射數(shù)據(jù)，再測得 90度D的衍射差，將嗜酸性和中性細(xì)胞分開.而嗜堿性粒細(xì)胞、 淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞則按其大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同的復(fù)雜性，所產(chǎn)生的散射光也各異，用可調(diào)較的門限加以區(qū)分。其采用特

6、定程序自動儲存分析數(shù)據(jù)，并經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理，在屏幕上顯示 6 個散點(diǎn)圖和2 個直方圖。1.4 各種細(xì)胞化學(xué)特性應(yīng)用技術(shù)利用五種白細(xì)胞自身不同的化學(xué)性質(zhì).應(yīng)用相應(yīng)的化學(xué)試劑加以區(qū)分由于嗜酸性（或嗜堿性）粒細(xì)胞均有較強(qiáng)的堿性（或酸性），因此在特殊的溶血劑作用下，經(jīng)過特定時間及溫度的孵育，可使除嗜酸性（嗜堿性）粒細(xì)胞之外的所有細(xì)胞溶解或萎縮.經(jīng)處理之后的細(xì)胞根據(jù)阻抗脈沖計(jì)數(shù)法，可得相應(yīng)嗜酸性（嗜堿性）細(xì)胞有效數(shù)值。利用五種白細(xì)胞過氧 化物酶活性的差異對白細(xì)胞進(jìn)行染色，測定其酶反應(yīng)強(qiáng)度，對白細(xì)胞進(jìn)行分析。血液中五種白細(xì)胞的過氧化物酶活性排列順序?yàn)椋菏人嵝粤＜?xì)胞>中性粒細(xì)胞>單核細(xì)胞。淋巴細(xì)

7、胞和嗜堿性粒細(xì)胞均無過氧化物酶。將待測血液加入清洗劑和甲醛的等滲液體內(nèi)經(jīng)孵育，再加入過氧化氫和四氯一萘酚，細(xì)胞內(nèi)過氧化酶分解產(chǎn)生氧離子，使四氯一萘酚顯色并沉淀，并定位于酶反應(yīng)部位。根據(jù)酶反應(yīng)強(qiáng)度的不同，利用光電檢測技術(shù)測定相應(yīng)吸光度值的方法,用以區(qū)分嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞。1.5 電導(dǎo)，射頻法與早期的三分類血液分析儀利用庫爾特原理不同的是，它在內(nèi)外電極上加了一個RF 射頻發(fā)生器。 RF 是射頻電流的簡稱.它是一種高頻交流變化電磁波。按照工作頻率的不同，RF 可以分為低頻（LF）、高頻（HF）、超高頻（UHF）和微波等不同種類.不同頻段的RF工作原理不同，和 HF 頻段一般采用電磁耦

8、合原理，而 UHF 及微波頻段的RF 一般采用電磁反射原理。在血液分析儀中多采用高頻電磁波，其原理是交變電流通過導(dǎo)體時，會在導(dǎo)體周圍形成交變電磁場，形成電磁波。因?qū)w的密度及導(dǎo)電性質(zhì)等差異，其周圍所形成的電磁場也不相同。因此當(dāng)射頻電流穿透細(xì)胞膜透入胞內(nèi)時，由于核的大小、化學(xué)組分、顆粒多少以及漿核比例的不同， 使 RF 信號發(fā)生不同的變化。借此可以將體積大小相同但內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同的細(xì)胞區(qū)分開來，如淋巴細(xì)胞與嗜堿性細(xì)胞。1.6 熒光法利用不同細(xì)胞的細(xì)胞膜、胞內(nèi)因子以及胞內(nèi)DNA、RNA、胞內(nèi)離子鈣等不同染色特性，選用具有特異性抗原或抗體的熒光染料載體，使待分離的細(xì)胞分別標(biāo)記相應(yīng)的熒光物質(zhì)，經(jīng)過特定波長

9、的激光照射激發(fā)出不同波長的熒光，利用各種PMT 管檢測熒光信號的個數(shù)，可以完成待檢細(xì)胞的計(jì)數(shù)如進(jìn)一步分析計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞等2 血細(xì)胞五分類技術(shù)的應(yīng)用及展望2.1 五分類血液分析儀的現(xiàn)狀全自動五分類血細(xì)胞分析儀是多學(xué)科相互交叉、滲透、 綜合的產(chǎn)物，涉及技術(shù)領(lǐng)域包括電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、傳感器技術(shù)、信號處理技術(shù)、生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、精密機(jī)械、光學(xué)、自動控制、流體力學(xué)等領(lǐng)域。絕大多數(shù)“五分類 ”分析儀采用了流式細(xì)胞分析方法，而聯(lián)合檢測法則代表了五分類血細(xì)胞分析儀的最新發(fā)展趨勢。BECKMAN COULTRER GENS 全自動五分類血球分析儀采用其獨(dú)特的VCS 技術(shù)，其中V（體積法）用于分析

10、細(xì)胞體積；C（電導(dǎo)法）用于分析細(xì)胞核型；S（散射法）則用于分析細(xì)胞的顆粒特性。測試時。 患者標(biāo)本經(jīng)過分血片等樣本分配系統(tǒng)進(jìn)入攪拌杯中，再加入溶血劑攪拌 . 溶血 .完全破壞紅細(xì)胞，剩下的白細(xì)胞在樣本壓力作用下進(jìn)入流式通道。運(yùn)用 VCS 聯(lián)合檢測方法，在流式通道的某一位點(diǎn)。對通過的單列白細(xì)胞，進(jìn)行逐個的、同時的、三重的檢測以及三維分析，以確定其亞群性質(zhì)。雅培公司新推出的CELL-DYN Ruby 全自動血液分析儀運(yùn)用合并流式細(xì)胞術(shù)及多角度偏振散射分離技術(shù)檢測白細(xì)胞。其采用多角度偏振散射技術(shù)對白細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分和按序分離，通過四個角度的光學(xué)檢測進(jìn)行白細(xì)胞分析。其中， 0 度用于區(qū)分細(xì)胞體積大??；10

11、度用于區(qū)分細(xì)胞的復(fù)雜性；90 度用于區(qū)分細(xì)胞核的分葉性；90 度 D 用于區(qū)分細(xì)胞的顆粒性。通過 90度偏振和90 度去偏振區(qū)分嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，同時通過多個散點(diǎn)圖分析來鑒別和分類未成熟細(xì)胞和干擾物質(zhì)。拜爾公司的ADV IA120 利用化學(xué)特性中過氧化物酶活性與激光散射技術(shù)結(jié)合原理進(jìn)行白細(xì)胞五分類測定。該儀器有4 個測量通道：血紅蛋白測量通道、紅細(xì)胞血小板測量通道、嗜堿性粒細(xì)胞測量通道、過氧化物酶測量（白細(xì)胞分類）通道。其利用五種白細(xì)胞過氧化物酶活性的差異對白細(xì)胞進(jìn)行染色.測定其酶反應(yīng)強(qiáng)度，對自細(xì)胞進(jìn)行分析。在測試過程中.每個細(xì)胞產(chǎn)生2 個信號：組化染色結(jié)果與光散射結(jié)果。 以 X 軸

12、代表吸光率（組化染色酶反應(yīng)強(qiáng)度），Y軸代表光散射（細(xì)胞大?。?，一起定位于細(xì)胞圖上（cytogram）。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對存儲資料進(jìn)行分析處理，并結(jié)合嗜堿性或分葉細(xì)胞通道結(jié)果計(jì)算出白細(xì)胞總數(shù)及分類。值得一提的是，該設(shè)備對RBC 及 PLT 的測定也摒棄了傳統(tǒng)的阻抗法，而是采用激光法對其進(jìn)行測定的。希森美康（SYSMEX） 公司五分類血液分析儀的檢測原理按生產(chǎn)時間的先后可分為三大類：多通道阻抗與射頻聯(lián)合檢測技術(shù).代表機(jī)型有SE 一 9000；激光流式細(xì)胞檢測結(jié)合細(xì)胞組化染色技術(shù)，代表機(jī)型有SF 一 3000；激光流式細(xì)胞檢測結(jié)合核酸熒光染色技術(shù)，代表機(jī)型有SF 2100。SYSMEX XE 2100全自

13、動血細(xì)胞分析儀是綜合了前向散光、側(cè)向散光和側(cè)向熒光三種光學(xué)檢查技術(shù)，結(jié)合電阻抗技術(shù)來進(jìn)行白細(xì)胞分類的。直流電阻抗法（DC）用于測量細(xì)胞體積大小。激光散射產(chǎn)生的前向散射光、側(cè)向散射光可用于探測白細(xì)胞體積大小、細(xì)胞內(nèi)含物的情況（細(xì)胞核以及顆粒情況），側(cè)向熒光則可以反映細(xì)胞內(nèi)脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA） 的含量。綜合各個測量方法，得到白細(xì)胞五分類的圖形和數(shù)據(jù)。SYSMEXXT 一 2000i 全自動血液分析儀運(yùn)用核酸熒光染色技術(shù)，配合激光流式分析系統(tǒng)，保證了精確的 WBC 五項(xiàng)分類結(jié)果。HORIBA ABX 公司生產(chǎn)的Pentra系列五分類血液分析儀采用獨(dú)有的雙鞘流通道，結(jié)合阻抗法、化

14、學(xué)染色技術(shù)及吸光度法對白細(xì)胞進(jìn)行精確的分析。流式通道內(nèi)有兩個檢測裝置，60um 的鞘流微孔用于阻抗法體積檢測，42um 的光窗用于吸光度測定分析細(xì)胞內(nèi)容物。實(shí)現(xiàn)對大量細(xì)胞進(jìn)行的順序、快速、準(zhǔn)確地分析與測定。以上所介紹的幾種血液分析儀是目前我國醫(yī)療機(jī)構(gòu)常見的具有代表性的幾種測定白細(xì)胞五分類的機(jī)型。另外，日本光電公司生產(chǎn)的MEK 一 8222K 在中國的擁有量也較大.因其工作原理與雅培公司的CELL DYN Ruby 相似 .也是采用半導(dǎo)體激光法和多角度激光散射技術(shù)，只是試劑的配方有所區(qū)別，因此不再贅述。國內(nèi)邁瑞公司生產(chǎn)的BC 一 5500 的白細(xì)胞分類結(jié)合了液流聚焦技術(shù)、激光散射技術(shù)和化學(xué)染色技術(shù)。其光源采用半導(dǎo)體激光系統(tǒng)，通過多角度的激光散射，提供細(xì)胞的大小、細(xì)胞核、細(xì)胞顆粒大小及復(fù)雜性的信息.并結(jié)合試劑對嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞的特異處理，將嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞區(qū)分開來，剛篩選出各類異毒細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)精確的五分類檢測結(jié)果。由于不同儀器的檢測原理及相關(guān)試劑的差異，各類設(shè)備均有其相應(yīng)的特點(diǎn)?？傮w來講，光學(xué)檢測法結(jié)合特種化學(xué)試劑如染色物質(zhì)等.由于其針對某一被檢物質(zhì)的特異性，因此其測定及分析結(jié)果較電阻法精確度要高，但相應(yīng)的試劑成本加大，同時對操作人員及環(huán)境的要求也會有所提高。2.2 五分類血液分析儀的展望從五分類血液分析儀