關于慢病毒感染的相關知識總結

1、慢病毒使用操作手冊一、慢病毒的儲存與稀釋:      1.  病毒的儲存：收到病毒液后在很短時間內即使用慢病毒進行實驗，可以將病毒暫時放置于4 保存；如需長期保存請放置于-80（病毒置于凍存管，并使用封口膜封口）       病毒可以存放于-80 6個月以上；但如果病毒儲存時間超過6個月，建議在使用前需要重新滴定病毒滴度       反復凍融會降低病毒滴度：每次凍融會降低病毒滴度10%；因此在病毒

2、使用過程中應僅盡量避免反復凍融，為避免反復凍融,建議收到病毒后按照每次的使用量進行分裝。      2.  病毒的稀釋：如果需要稀釋病毒，請將病毒取出置于冰浴融解后，使用培養(yǎng)目的細胞用PBS或無血清培養(yǎng)基(含血清或含雙抗不影響病毒感染)?；靹蚍盅b后4保存(請盡量在三天內用完) 分裝后使用。      二、慢病毒用于體外（In Vitro）實驗：      感染培養(yǎng)原代細胞和建系細胞。慢病毒對各種細胞和組織的

3、親嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通過查閱相關文獻，了解慢病毒對您的目的細胞的親嗜性，感染復數（MOI 值）以及在體（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果沒有相關文獻支持，可以通過感染預實驗得到合適的感染復數（MOI 值）（使用24孔板檢測病毒對目的細胞的親嗜性）。      慢病毒感染目的細胞預實驗      1.  慢病毒感染目的細胞預實驗注意事項：       測定慢病毒對目的細胞的親嗜性時，需要同

4、時設置對慢病毒親嗜性較高的細胞(HEK293T，Hela）作為平行實驗的對照細胞。       在進行慢病毒感染實驗時，可以用完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)目的細胞用）稀釋；理論上，含有血清，雙抗或者其他營養(yǎng)因子的完全培養(yǎng)基不影響慢病毒的感染效率。       一般慢病毒單位為TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒顆粒數。如：病毒滴度為>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108個具有生物活性的慢病毒顆粒。    

5、;  2.  以24孔培養(yǎng)板為例，進行目的細胞和HEK293T 細胞的感染預實驗實驗前按照不同的MOI設置不同的感染孔，并根據MOI和細胞數量計算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者無血清培養(yǎng)基稀釋病毒原液。      第一天，準備細胞：在24孔培養(yǎng)板接種若干孔，每個孔內接種35X104個目的細胞，鋪板時細胞的融合率為50%左右，每孔培養(yǎng)基體積為100 l；進行病毒感染時細胞的融合度約為70%左右。      第二天，準備病毒：取出4保

6、存的病毒，使用臺式離心機離心20 秒（使病毒完全懸于離心管底部即可）；如果是凍存在-80的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根據實驗室的實際情況將按照MOI準確計算好的慢病毒稀釋到培養(yǎng)基中，并盡可能保證所獲得的含有慢病毒的培養(yǎng)基的總體積為最小體積，以期獲得最佳的感染效率。      第二天，感染目的細胞：病毒準備好之后，從培養(yǎng)箱中拿出細胞，首先察細胞生長狀態(tài)，如細胞狀態(tài)較好則開始實驗。      a使用移液器吸取準確體積的病毒液加入準備好的培養(yǎng)基。  &#

7、160;   b吸去培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基（如果細胞生長良好，密度適宜，則不用換液）。      c在目的細胞和對照細胞中分別加入計算好的病毒液。      d混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱（37、5%CO2）孵育過夜。      注：感染前細胞的狀態(tài)好壞對最終的感染效果高低影響很大，所以務必保證加病毒之前細胞處于良好的生長狀態(tài)。亦可以將預先準備好的培養(yǎng)基和慢病毒的混合液直接加入培養(yǎng)器皿中

8、。慢病毒對目的細胞的感染效率較低，通過提高MOI 值可以提高病毒的感染效率，但是當MOI高于20時，我們建議在培養(yǎng)基中加入ploybrene（8 g/ml左右）來提高病毒的感染效率。      第三天，更換培養(yǎng)液：一般在24小時候后將含有慢病毒的培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液；在感染后觀察細胞狀態(tài)，如果慢病毒對細胞有明顯毒性作用而影響細胞生長狀態(tài)，可以最短在加病毒4小時候更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)（建議在8-12小時更換為宜）。第一次換液后，如果慢病毒對細胞沒有明顯毒性作用，按照正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)換液。   

9、0;  第六天，感染效率檢測：在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，估計慢病毒感染目的細胞的效率；如何由于目的基因較大而造成選擇的載體不能攜帶Marker Gene的，可以通過Real-timeRT-PCR檢測目的基因的表達來拍評估感染效率。      注意：      有些慢病毒載體上帶有GFP 綠色熒光蛋白，使用者可以在病毒感染96小時后用倒置熒光顯微鏡觀察GFP 綠色熒光，以觀察病毒對目的細胞的感染情況。如果慢病毒載體攜帶其他Marker Gene如RFPBFP

10、可以用熒光顯微鏡在對應的激發(fā)光波長下觀察熒光表達的情況。      慢病毒表達時間較慢，熒光表達所需時間較長，建議感染后96小時后觀測熒光表達。      感染后的細胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周，通過觀察熒光的表達時間和表達強度來確定慢病毒對目的細胞的感染情況。感染期間請根據細胞生長的情況對細胞進行及時換液，以保證細胞良好的生長狀態(tài)。      三、慢病毒使用安全使用規(guī)范    

11、0; 慢病毒中的毒性基因已經被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒因此沒有毒性作用。但該病毒仍然具有可能的潛在的生物學危險，不建議使用編碼已知或可能會致癌的基因的假型病毒。除非已經完全公認某個基因肯定沒有致癌性，否則均不建議采用假型病毒進行生物學實驗。使用時請參照如下所示進行實驗：      1病毒操作時最好使用生物安全柜。如果使用普通超凈工作臺操作病毒，請不要打開排風機。      2病毒操作時請穿實驗服，帶口罩和手套。   &

12、#160;  3操作病毒時特別小心不要產生氣霧或飛濺。如果操作時超凈工作臺有病毒污染，請立即用70%乙醇加1%的SDS 溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養(yǎng)板，培養(yǎng)液請于84 消毒液或1%SDS 中浸泡過夜后棄去。      4用顯微鏡觀察細胞感染情況時應遵從以下步驟：擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板。用70%乙醇清理培養(yǎng)瓶外壁后到顯微鏡處觀察拍照。離開顯微鏡實驗臺之前，用70%乙醇清理顯微鏡實驗臺。      5如需要離心，應使用密封性好的離心管，或者用封

13、口膜封口后離心，而且盡量使用組織培養(yǎng)室內的離心機。      6脫掉手套后，用肥皂和水清洗雙手。  四、懸浮細胞感染方法概要       1.  根據細胞的量將細胞在1.5ml 管中離心收集然后用100-200ul 的無血清培養(yǎng)液稀釋細胞沉淀，以細胞完全浸沒在培養(yǎng)基中為準。      2.  按照MOI 換算病毒顆粒數量，吸取病毒液加入細胞中，將1.5ml 管放在37度培養(yǎng)箱中

14、孵育30 分鐘。      3.  將管中混合溶液吸出加到培養(yǎng)皿中或孔里。      4.  加入足夠量的新鮮培養(yǎng)液。      5.  12 小時后換液。      6.  96 小時后觀察細胞陽性率。五、相關專業(yè)術語：MOI：病毒感染復數傳統(tǒng)的MOI 概念起源于噬菌體感染細菌的研究。其含義是感染時噬菌體與細菌的數量

15、比值，也就是平均每個細菌感染噬菌體的數量。噬菌體的數量單位為pfu。一般認為MOI 是一個比值，沒有單位，其實其隱含的單位是pfu number/cell。后來MOI 被普遍用于病毒感染細胞的研究中，含義是感染時病毒與細胞數量的比值，本手冊中提到的MOI都是沿用這個概念。然而，由于病毒的數量單位有不同的表示方式，從而使MOI 產生了不同的含義。能產生細胞裂解效應的病毒例如單純皰疹病毒等習慣上仍用pfu 表示病毒數量，因此其MOI 的含義與傳統(tǒng)的概念相同。      六、細胞培養(yǎng)器皿的相關參數 Flask/DishSurfac

16、e (mm)Cell numberMedia Volume96 well plate501.5-5.0×10100 l48 well plate1003.0×104-1.0×10200 l24 well plate2008.0×104-2.0×10500 l12 well plate4011.6-4.0×101.0 ml6 well plate9623.0-8.0×102.0 ml35mm9623.0-8.0×102.0 ml60mm28271.0-2.5×10 6.0 ml100mm78542

17、.5-6.4×1010.0 ml 慢病毒重組慢病毒簡介在轉染遺傳物質到細胞基因組中的工作中，重組慢病毒載體是一個強大和有效的工具。慢病毒能作用于細胞周期的G0/G1期，同時具有嗜核性，所以可以感染分裂期細胞和非分裂期細胞，感染包括幾乎所有的哺乳動物細胞、干細胞和原代培養(yǎng)的細胞。慢病毒載體具有攜帶基因片段容量大、轉染效率高、可感染分裂細胞及非分裂細胞、目的基因可在宿主細胞中長時間穩(wěn)定表達以及安全性好、免疫反應小等優(yōu)點。所以獲得了較廣的應用范圍。慢病毒載體也是RNAi表達的主要手段，同化學合成和酶切形成的siRNA相比具有幾個優(yōu)點：其一，可以攜帶GFP或螢光素酶等報告基因共表達

18、，便于跟蹤、選擇和富集轉染的細胞；其二，可以根據需要表達不同類型的小RNA分子（siRNA、shRNA或miRNA）；其三，具有較高的轉染效率，使基因沉默維持較長時間。目前Pubmed中收錄有關慢病毒載體用作實驗的文章超過7萬多篇，僅Nature,，Science,，Cell上便超過600篇。已成為國際上最通用的轉染系統(tǒng)，廣泛用于各類實驗室。 慢病毒的安全操作規(guī)范深圳百恩維提供的慢病毒均采用第三代系統(tǒng)的慢病毒載體。水泡性口炎病毒來源的VSV-G基因代替HIV-1的env基因，這既提高了慢病毒的安全性，又使其能夠感染的細胞種類大大增加。本系統(tǒng)的慢病毒顆粒是“自身失活型(SIV)”，整合

19、入靶細胞后，不會產生完整長度的RNA，僅僅具有攜帶目的基因的功能，感染目的細胞后不再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產生新的病毒顆粒。盡管如此，該病毒仍然具有潛在的生物學危險性，因此建議不要使用編碼已知或可能會致癌的基因的假性病毒；并強烈建議將本系統(tǒng)生產的慢病毒視為二級生物安全水平的生物，而且嚴格遵守BSL-2或BSL-2+操作手冊并進行相應的廢棄物消毒?；静僮饕?guī)范如下：1、在實驗室工作時，任何時候都必須穿著連體衣、隔離服或工作服；應戴上合適的手套和口罩。2、病毒操作時最好使用生物安全柜。如果使用普通的超凈工作臺操作病毒，請不要打開風機。3、所有的技術操作要按盡量減少氣溶膠和微小液滴形成的方

20、式來進行。如果出現病毒污染，請立即用70%的酒精加1%SDS溶液擦拭干凈。4、如需離心，應使用密封性好的離心管，可用Parafilm膜封口后離心，而且最好使用組織或細胞培養(yǎng)室內的離心機。5、用顯微鏡觀察細胞感染情況時遵從以下步驟：擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板，并在使用70%乙醇清理所有受到污染的材料、標本和培養(yǎng)物在廢棄或清潔再利用之前，必須清除污染。廢棄的含病毒的培養(yǎng)基加入84消毒液（1:20左右），浸泡一天后丟棄。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養(yǎng)板等其他物品可用84消毒液稀釋液處理，也可以用煮沸處理半小時或高壓濕熱滅菌（121，30min）。6、手套用完后，應先消毒再摘除，隨后必須洗手。詳細操作規(guī)范

21、請參閱衛(wèi)生部發(fā)布的微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則（WS233-2002）、美國疾病控制中心出版的微生物和生物醫(yī)學實驗生物安全（第五版）和世界衛(wèi)生組織出版WHO生物安全手冊。操作慢病毒時請依照現有的使用指南。 包裝細胞293T細胞（下述流程來自深圳百恩維，如果使用不同公司系統(tǒng)請參考各公司提供的方案，本流程僅供參考） 293T細胞的凍存1、隨著傳代的次數增加，293T細胞會出現生長狀態(tài)下降，出現突變等，所以要在細胞購進時就進行備份。2、在細胞對數生長期進行凍存，增加細胞復蘇成活率。3、倒去細胞上清液，加入D-Hank's液洗去殘留的培養(yǎng)基。4、加入0.25%的胰

22、酶，消化10-20s后倒去。5、鏡下觀察細胞變圓，細胞間間隙加大時，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻。6、細胞計數。7、將細胞離心，1000rpm，2min。8、根據計數結果加入細胞凍存液（70%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10% DMSO）重懸細胞，密度為3×106個/ml。10、第二天將細胞放入液氮灌，并記錄。 293T細胞的傳代1、當細胞生長至匯合率達到8090%需要對細胞進行傳代操作，以擴大細胞數量，維持細胞良好的生長狀態(tài)。2、消化細胞，方法同上。3、細胞離心結束后，加入完全培養(yǎng)基重懸。密度為3×105個/ml。4、分到10cm培養(yǎng)皿中，10ml/皿。 29

23、3T細胞的復蘇1、當細胞傳代次數過多（超過50代），細胞狀態(tài)變差時或細胞出現污染事故時，需要丟棄并對開始凍存的細胞進行復蘇。2、打開水浴鍋，設置溫度為37。3、查看細胞庫記錄，根據記錄從液氮灌中取出凍存的細胞（需戴上棉手套，防止被凍傷），迅速丟入水浴鍋中并快速晃動，在12 min內使細胞溶液完全溶解。4、將1ml細胞溶液加入9 ml完全培養(yǎng)基中并混勻后轉入10cm培養(yǎng)皿。5、放回37、5%CO2和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6、第二天觀察細胞存活率。倒掉舊的培養(yǎng)基，加入10ml新鮮培養(yǎng)基。 慢病毒的包裝、濃縮和滴度測定1、所用病毒檢測引物為WPRE特異引物，序列如下5'-C

24、CTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2、TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems， cat. no. 4304437)3、TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems， cat. no.

25、401970)4、TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems， cat. no. 4316844)  用于包裝的293T細胞(ATCC No. CRL-11268)必需選擇處于生長旺盛期，細胞狀態(tài)較佳，存活率90%以上，細胞邊緣清晰，傳代次數較低。任何時候細胞匯合率都不準達到100%。 慢病毒的包裝1、預先準備3個T150瓶的293T細胞，培養(yǎng)基為DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-鏈霉素。2、將細胞分到12個T150瓶中，每瓶的細胞密度是8&#

26、215;106個。3、第二天，鏡下檢查細胞。細胞融合度應大致為30-40%，分布均勻。4、轉染前1小時，取出細胞板，去除原有細胞培養(yǎng)基，加入20ml的Opti-MEM培養(yǎng)基，將細胞送回培養(yǎng)箱。5、取兩支無菌的50ml離心管，其中一支中加入252 g pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 載體質粒，168 g pCD/NL-BH*DDD 包裝質粒和84 g pLTR-G質粒，用Opti-MEM培養(yǎng)基補齊到18ml。另一支中加入500 l Trans-EZ溶液和17.5 ml Opti-MEM培養(yǎng)基，用電動移液器輕輕混勻。將Trans-EZ稀釋液滴加到質粒管中，邊加邊輕輕晃

27、勻。關鍵步驟：推薦使用Qiagen質粒大抽試劑盒或相當的試劑盒所制備的質粒。6、室溫孵育20分鐘，使DNA和Trans-EZ充分結合形成轉染復合體。7、取1支5ml的移液管，將得到的DNA-Trans-EZ復合體均勻滴加入到細胞培養(yǎng)板中，每板3ml。來回晃動培養(yǎng)板，混勻后放回到5%二氧化碳培養(yǎng)箱。每一皿細胞培養(yǎng)盤不要超過6盤。8、6小時后，移去細胞上清，更換為17ml的DMEM完全培養(yǎng)基。9、轉染后一天觀察細胞，所有的細胞應當都是健康的并且密度接近60-80%。如果所轉染質粒帶有GFP熒光，那么這時候可以看到大于95%的細胞都是帶有熒光的。10、將細胞送回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2天（36-48小時）。

28、在這個過程中，細胞會逐漸融合形成多核體，大多數的細胞依然貼壁。11、收集所有的上清，分裝到50ml離心管中。12、4，500g離心10分鐘，除去脫落的細胞和大的細胞碎片。13、總的上清約為204 ml，用250-ml 0.45 m PVDF過濾裝置過濾。如果發(fā)現濾膜被堵住，表現為過濾速度變慢，更換新的濾器。 慢病毒的濃縮與純化方法一：超速離心沉淀法1、取6個Ultra-clear SW28離心管，用70%乙醇消毒后，放在超凈工作臺中打開紫外燈繼續(xù)消毒30分鐘。2、每個Ultra-clear SW28離心管中加入約32ml的預先處理的病毒上清液。3、取一支10ml的移液管，吸取12 m

29、l 20%的蔗糖溶液。將移液管一直插入到離心管的底部，緩慢將蔗糖溶液打出4 ml。同樣地，將剩下8 ml的蔗糖溶液分別加入到另兩個離心管中。另取一支干凈的移液管，對剩下3管進行同樣處理。4、用PBS調整各管的重量，使對應的離心管之間的重量相差不超過0.1g。5、按次序將所有6個離心管放入Beckman SW28 超速離心轉頭中。6、小心將管子從轉頭中取出。倒掉上清，將離心管倒扣在紙巾上放置10分鐘使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底應當有可見的沉淀。7、每管中加入100ml 不含鈣和鎂的PBS洗下沉淀。8、將SW28超速離心管插入到50ml錐底離心管中，蓋上蓋子。9、在

30、4溶解2小時，每隔20分鐘輕輕震蕩。10、4，500g離心1分鐘，使溶液集中于管底。11、用200l 移液器輕柔吹打使沉淀重懸。避免產生泡沫。將所有管中的液體集中到一個SW28離心管中。12、集中后的病毒懸液分裝成50l 每份，保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲存在-80 。 方法二 PEG-8000濃縮法5X PEG8000+NaCl配制稱取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q純水中；121攝氏度 30min 濕熱滅絕 30min；保存在4。1、使用0.45m濾頭過濾慢病毒上清液

31、；2、每2030min混合一次，共進行3-5次；3、4度放置過夜；4、4度，4000 g，離心 20min；5、吸棄上清，靜置管子12分鐘，吸走殘余液體；6、加入適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；7、集中后的病毒懸液分裝成50 l每份，保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲存在-80  病毒滴度的測定稀釋計數法滴度單位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數。”TU”為”transducing units”的縮寫，中文為“轉導單位”，表示可以感染并進入到靶細胞中的病毒基因組數。第一天細胞準備將生長狀態(tài)良好的293T細胞消化計數后稀釋至1×105/ml，加入

32、96孔板，100l/孔，為每個病毒準備10個孔。放入37，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)10個稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準備10個1.5ml EP管，每管加入90l培養(yǎng)液，往第一個管中加入10l病毒原液，混勻后，吸取10l加入第二個管混勻。依此類推，做十個稀釋度（1010-8）。吸取96孔板中原有的培養(yǎng)基，加入含稀釋好的病毒液。并做好標記。第三天追加培養(yǎng)液在每個孔再加入100l完全培養(yǎng)液，利于細胞的生長。第五天觀察結果并計算滴度在熒光顯微鏡下觀察結果，并數出最后兩個有熒光的熒光細胞克隆數。假設為X和Y，則滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*1000/

33、2/X孔的病毒液的含量（l）。 定量PCR法病毒感染1天前，取6孔板接種HOS細胞，每孔細胞為5×104個。接種細胞24小時后，取兩個孔的細胞用血球計數板計數，確定感染時細胞的實際數目，記為N。棄去其他培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，更換為含有5g/ml polybrene的新鮮培養(yǎng)基。將濃縮病毒用培養(yǎng)基稀釋200倍，也就是取1l病毒加入到199l的培養(yǎng)基中。在3個培養(yǎng)孔中分別加入0.5l，5l和50l的稀釋病毒。感染開始后20小時，除去培養(yǎng)上清，換為500l含DNaseI (Takara Mirus Bio，終濃度為10 U/ml)的新鮮培養(yǎng)基。在37消化15分鐘，這一步是要除去殘余的

34、質粒DNA。然后換為2ml正常的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化細胞，在37放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗下，離心收集細胞。按照DNeasy試劑盒的說明抽提基因組DNA。每個樣品管中加入200l洗脫液洗下DNA。用DNA定量試劑盒定量（Bio-Rad）?；蚪MDNA可以穩(wěn)定保存在-20至少2個月。準備PCR所需的試劑和樣品。為病毒序列檢測引物配總管：2× TaqMan Master Mix25 l × nForward primer (100 pmol ml-1)0.1l × nReverse primer (100 pmol m

35、l-1)0.1l × nProbe (100 pmol ml-1)0.1l × nH2O19.7l × nn = number of reactions. 例如：總反應數為40，將1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，4l forward primer，4l reverse primer，4l probe 和788l H2O混和。震蕩后放在冰上。為人基因組序列檢測引物配總管：2× TaqMan Master Mix25 l × n10×RNaseP primer/p

36、robe mix2.5 l × nH2O17.5l × nn = number of reactions. 例如：總反應數為40，將1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，100l 10×RNaseP primer/probe mix和700l H2O混和。震蕩后放在冰上。在預冷的96孔PCR板上完成PCR體系建立。從總管中各取45l加入到A-D各行的孔中，從總管中各取45l加入到E-G各行的孔中。分別取5l質粒標準品和待測樣品基因組DNA加入到A-D行中，每個樣品重復1次。另留1個孔加入5l的水做為無模板

37、對照（no-template control）。分別取5l基因組標準品和待測樣品基因組DNA加入到E-G行中，每個樣品重復1次。另留1個孔加入5l的水做為無模板對照（no-template control）。所使用定量PCR儀為ABI PRISM 7000定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設定為： 50 2分鐘，95 10分鐘，然后是95 15秒，60 1分鐘的40個循環(huán)。數據分析：測得的DNA樣品中整合的慢病毒載體拷貝數用基因組數加以標定，得到每基因組整合的病毒拷貝數。滴度（integration units per ml，IU ml-1）的計算公式如下：IU ml-1 = (C ×N&

38、#215; D×1000)/V其中： C = 平均每基因組整合的病毒拷貝數 N = 感染時細胞的數目（約為1×105） D = 病毒載體的稀釋倍數 V = 加入的稀釋病毒的體積數 慢病毒的儲存與稀釋慢病毒的儲存1、病毒的運輸采用干冰保溫，收到病毒液后若幾天內用于實驗，可于4保存（于一周內用完）。2、若病毒量較大，需長期保存。則根據每次實驗用量分裝后放于-80冰箱。一般病毒可以放于-80約12個月以上，但若超過6個月后使用，請重新檢測病毒滴度。3、避免反復凍融，否則會降低病毒滴度。每次凍

39、融會降低病毒滴度10%。 慢病毒的稀釋需要稀釋病毒時，將病毒取出后置于冰上融解，用細胞培養(yǎng)用D-Hank's、PBS或培養(yǎng)基稀釋到所需濃度后混勻分裝后4保存，并盡快用于實驗（于一周內用完）。 慢病毒在細胞水平的使用什么是MOI？“MOI”為”multiplicity of infection”的縮寫，中文為“感染復數”或“復感染指數”，含義為感染時病毒和細胞數量的比值，即平均每個細胞感染的病毒活性單位數（TU number /cell）。在實驗中將某種細胞感染達到80%時的MOI定義為這種細胞的MOI。MOI與整合事件以及目的基因的表達相關。一定范圍內，表達水平和M

40、OI呈正相關。MOI取決于多種因素，如細胞狀態(tài)，目的基因的大小與性質，細胞的感染效率等。所以，實驗前需查閱相關文獻，確定慢病毒對目的細胞的親嗜性、MOI以及在體（in vivo）注射所需病毒量。若無文獻支持，可以通過預實驗得到合適的MOI。實際上，即使有文獻支持，但由于所用細胞代數、細胞狀態(tài)以及目的基因的差異，實際的MOI和文獻報道也會不同，所以要安排預實驗以確定所需MOI以及病毒對細胞生長的影響。 目的細胞感染預實驗及實驗體系的放大實驗目的：確定細胞感染所需的MOI，以及是否需要添加感染增強劑Polybrene。實驗材料：96孔板，1.5ml EP管，長勢良好的目的細胞一瓶，已知滴度的慢病毒溶液，Polybrene（10mg/ml），目的細胞培養(yǎng)基等。第一天：細胞準備將長勢良好的目的細胞接種到96板，消化好細胞（懸浮細胞不需要消化，直接離心收集細胞后加新鮮培養(yǎng)基重懸即可）后把濃度調為3×1045×104個/m