CBA試劑盒原理及問題

1、Cytometric Bead Array (CBA)，即微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定 量技術(shù)是一個(gè)基于流式細(xì)胞檢測系統(tǒng)的多重蛋白定量檢測 方法，它能夠同時(shí)對(duì)單個(gè)樣品中的多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行檢測。日常 實(shí)驗(yàn)中，常需對(duì)溶液體系中的可溶性蛋白進(jìn)行定量檢測，如 細(xì)胞培養(yǎng)上清或血清中的細(xì)胞因子含量的定量分析，由于這些因子的含量較少，低于一般常規(guī)方法的檢測下限，使用常 用的蛋白檢測方法 western Blot等很難檢測。BD公司利用 流式細(xì)胞儀可對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行級(jí)數(shù)放大的特性，只需使受檢的可溶性因子附著于一些具有近似細(xì)胞直徑的微粒上，即可對(duì)受檢樣品中的各種可溶性因子進(jìn)行檢測。為此，BD公司開發(fā)了的微量樣本多指標(biāo)流式

2、蛋白定量系統(tǒng)，簡稱CBA系統(tǒng)，通過利用一系列帶有熒光標(biāo)記的微小、分散的微球連結(jié) 特定的捕獲抗體以捕捉溶液系統(tǒng)中的待測物，通過對(duì)應(yīng)各種不同檢測物的特異微球上所帶有熒光強(qiáng)度不同從而同時(shí)測 定分析樣本中多種可溶性成分的數(shù)量。BD的CBA系統(tǒng)的工作原理簡單，對(duì)應(yīng)受檢系統(tǒng)中的每一個(gè) 檢測指標(biāo)都設(shè)有不同的捕獲微球，不同的捕獲微球上包被有特異的捕獲抗體，并具有不同的熒光強(qiáng)度，通過捕獲微球與 待測樣品溶液混合后，微球上的特異性抗體就與樣品(血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)液)中的相應(yīng)抗原或蛋白結(jié)合，最后，加入 熒光的檢測抗體以形成 三明治”夾心復(fù)合物，通過流式細(xì)胞 樣進(jìn)行熒光檢測，便可對(duì)樣品中的各檢測因子的含量進(jìn)行分 析

3、。由于BD的CBA系統(tǒng)中每一個(gè)微球都能夠提供一個(gè)和特 定蛋白結(jié)合的表面，因此，每個(gè)微球就相當(dāng)于一個(gè)單獨(dú)的、 包被女?的ELISAS;相對(duì)于傳統(tǒng)的 ELISA技術(shù)，熒光信號(hào)顯 色的靈敏度比一般化學(xué)發(fā)光的靈敏度高，加上利用流式細(xì)胞儀對(duì)于熒光信號(hào)的高敏感性及放大作用，使用這種技術(shù)檢測未知樣品中的指標(biāo)所需要的樣品濃度更低，實(shí)驗(yàn)時(shí)間更短； 另外，常規(guī)的ELISA操作，每次只能對(duì)一個(gè)樣本中的一個(gè)指 標(biāo)進(jìn)行檢測，各檢測子標(biāo)間的操作需分開進(jìn)行，往往造成珍 貴樣本的耗費(fèi)，如病患者血液中向免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子包括 IFN-v TNF-a、IL-2等，通過 BD CBA系統(tǒng)，可同時(shí)對(duì)一個(gè)對(duì) 樣品中的多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行檢測，這

4、為一些ELISA技術(shù)無法滿足的實(shí)驗(yàn)提供了新的檢測手段?，F(xiàn)時(shí)，BD公司為了滿足各種實(shí)驗(yàn)所需，符合各種要求的檢 測試劑盒逐漸增多，隨著對(duì) CBA檢測技術(shù)的不斷完善，BD 的CBA系統(tǒng)的使用者亦不斷上升，為了方便BD的CBA系統(tǒng) 使用，我們對(duì)CBA系統(tǒng)操作中一些常見問題及實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 進(jìn)行了總結(jié)，希望以下的總結(jié)，可使客戶在以BD的CBA系統(tǒng)在開展實(shí)驗(yàn)時(shí)，能更有效、更準(zhǔn)確、省時(shí)的完成實(shí)驗(yàn)。Q :我能不能使用 Coulter XL去分析我的CBA數(shù)據(jù)？A :雖然CBA試劑盒是為 BD FACScan和FACSCalibur流式 細(xì)胞儀設(shè)計(jì)的，CBA試劑盒也可以通過 Coulter XL細(xì)胞儀檢 測，CB

5、A版本以上的軟件具有參數(shù)兼容性的特征，可以使用 非BD公司的儀器分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，請(qǐng)參閱軟件的用戶使用指 南或者聯(lián)系技術(shù)支持得到進(jìn)一步的信息。Q :實(shí)驗(yàn)過程中，除了 CBA的分析試劑盒，我們還需要準(zhǔn)備 什么？A :除了試劑盒中所包含的成份外，若要進(jìn)行CBA分析實(shí)驗(yàn)，還需要購買BD的微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)分析軟 件(cat. no. 0421CD/ 550065),此軟件主要是用于分析您的實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)。雖然實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析可以不使用CBA的特定軟件，但是，由于CBA實(shí)驗(yàn)中所采集的數(shù)據(jù)較為繁雜，若不通過專用的CBA軟件進(jìn)行分析，則進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的時(shí)間將顯著增 加。CBA的專用軟件是建立在 Micro

6、soft Excel的基礎(chǔ)上的， 用戶只需要完全安裝 MS Excel 98或者Version即可安裝 CBA的專用軟件。此外，用戶還需要一個(gè)488納米激光器及 3個(gè)熒光參數(shù)的接收的流式細(xì)胞儀 (eg: BD FACScan or BD FACSCalibur cytometer) oQ : CBA中使用的微珠是由什么做的所使用到的微珠的平均 半徑是多少？A : CBA中使用的微珠的原料是聚苯乙烯，約為 m。Q :在CBA分析中我應(yīng)該使用何種型號(hào)的試驗(yàn)管？A :除了 FACSArray外，我們建議使用12x75 mm, 5 ml的聚苯 乙烯管(BD Falcon Cat No. 352008)

7、。Q : CBA分析中在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制時(shí)，有什么需要特別注意的地方？A : CBA試劑盒中所提供的標(biāo)準(zhǔn)樣品是蛋白凍干粉，由于大部份的標(biāo)準(zhǔn)樣品屬細(xì)胞因子類的敏感型蛋白，在重懸標(biāo)準(zhǔn)樣品成溶液或進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋時(shí)，不可采用振動(dòng)混勻及劇烈吹打的方式處理標(biāo)準(zhǔn)樣品，在重懸標(biāo)準(zhǔn)樣品成溶液時(shí)，在加入 溶液后，只需放于室溫下平衡 15分鐘即可。在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣 品的系列稀釋時(shí)，只需輕輕吹打樣品數(shù)次即可。否則，由于制成溶液后的標(biāo)準(zhǔn)樣品不穩(wěn)定，經(jīng)劇烈混勻后易降解失活， 影響實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬制。Q :是不是每次實(shí)驗(yàn)都要使用一瓶新的標(biāo)準(zhǔn)品？A :不管是標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液 （x10）或?qū)嶒?yàn)中的稀釋液中，標(biāo)準(zhǔn)品 在配成溶液后不

8、穩(wěn)定，在配制成儲(chǔ)備液（x10）的12小時(shí)后將不能再使用。在每次實(shí)驗(yàn)前都要重新配置新的標(biāo)準(zhǔn)品溶 液。Q :為什么振動(dòng)混合微珠這個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟如此關(guān)鍵？A:在使用之前，微球必須充分的振動(dòng)混合，從在微球混合 液試管中加入另外一種微球之前，至微珠添加完畢后，直至 在送到儀器進(jìn)行上樣檢測之前，反應(yīng)管都必須充分振動(dòng)混 合，這是由于充分的振動(dòng)能夠防止微珠聚集成團(tuán)。若混合不 足會(huì)導(dǎo)致在進(jìn)行樣品分析時(shí)候出現(xiàn)檢測到很少或者沒有檢 測到微珠的情況。因此在使用流式細(xì)胞儀分析標(biāo)準(zhǔn)品或者樣 品之前，必須充分振蕩混合微珠。試驗(yàn)管在放置到流式細(xì)胞 儀上檢測前需要振蕩混合 3-5秒鐘，這樣在FL3通道里面能 夠更好的分辨出帶有不同

9、標(biāo)志的微珠。Q : CBA操作實(shí)驗(yàn)中，哪些步驟需要避光進(jìn)行為什么？A :凡涉及含捕獲微球以檢測抗體的相關(guān)步驟都需避光操 作。這是由于CBA技術(shù)是使用R-藻紅蛋白檢測樣品的熒光信 號(hào)。由于使用R藻紅蛋白報(bào)告系統(tǒng)，可使獲得CBA達(dá)到最佳 敏感度的分析效果，因此每步添加了檢測試劑后都要避光反 應(yīng)。此外，在加入檢測試劑時(shí)，除了需避光操作外，還需嚴(yán) 格遵守試劑盒的要求規(guī)范操作（比如：精確的加液），因?yàn)?添加的微珠數(shù)量不準(zhǔn)確會(huì)改變有效捕獲面積從而影響檢測 的敏感性。Q :我看不到FL2熒光信號(hào)或者看到的 FL2熒光信號(hào)很弱， 怎樣解決這個(gè)問題？A:檢查樣品的稀釋度，不要隨意的更改要求的孵育時(shí)間， 在孵育過

10、程中，保護(hù)樣品試劑管不受到光照。Q :實(shí)驗(yàn)中，在檢測的時(shí)候我發(fā)現(xiàn)微珠聚集在一起，這是什 么原因？A:這可能是因?yàn)闃悠分械募?xì)胞因子的濃度太高了。此外， 在實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)按試劑盒上的操作說明對(duì)流式細(xì)胞儀上各熒光 補(bǔ)償進(jìn)行仔細(xì)調(diào)節(jié)，以確保所使用流式細(xì)胞儀參數(shù)是對(duì)應(yīng)于 C B A操作的最優(yōu)化設(shè)定。Q :為什么在實(shí)驗(yàn)中我的實(shí)驗(yàn)結(jié)果背景很強(qiáng)/或者全部樣品測。如果所有樣品都顯示陽性或者高于標(biāo)準(zhǔn)品的最高濃度讀 數(shù)，這時(shí)候請(qǐng)對(duì)您的樣品進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋，因?yàn)槟臉悠返臐舛纫迅哂诒鞠到y(tǒng)的正常檢測范圍。Q :為什么在實(shí)驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)看到微珠碎片和沒有看到微珠的 情況？A :如果在樣品分析的時(shí)候在 FSC/SSC勺檢測圖中出現(xiàn)

11、碎片， 上調(diào)SSC的閾值C或者同時(shí)上調(diào) FSC和SSC勺雙閾值。如果 在調(diào)整SSC的閾值以后問題依然存在，請(qǐng)重復(fù)樣品的洗滌步驟或者再次稀釋樣品。Q: CBA的檢測結(jié)果是否可直接與 ELISA的分析結(jié)果進(jìn)行對(duì) 比？A:不可。因?yàn)镃BA是基于熒光的報(bào)告系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的，雖然CBA系統(tǒng)相對(duì)于ELISA分析具有良好的優(yōu)勢，能夠提供更高的敏 感性和更大的濃度檢測范圍。但是兩者得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不能 夠直接比較，需對(duì)CBA的數(shù)據(jù)通過和已有的 ELISA數(shù)據(jù)進(jìn)行 校正，得到兩者的相關(guān)性結(jié)果。Q :在血清和血漿中，CBA試劑盒所能夠檢測到的最低濃度 是多少？A:我們不建議研究者根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線外推低于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低 值的實(shí)驗(yàn)

12、報(bào)告數(shù)值。這樣的外推操作會(huì)增加結(jié)果的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì) 學(xué)上的變化程度和導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差值的增大。最理想的情況是我們做標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候增加額外的稀釋濃度點(diǎn)（比如10, 5,pg/ml）。當(dāng)一些蛋白相對(duì)于背景（0 pg/ml）沒有信號(hào)的情況下， 我們就可以在最后的樣品分析中把這種蛋白排除掉。在常規(guī)的免疫分析中，血清和血漿中的一些細(xì)胞因子的含量低于檢 測的最低值以至于不能被檢測到。這是因?yàn)榻^大部分的細(xì)胞因子在具有特殊的免疫活性的位點(diǎn)附近起作用，它們的作用效率很高，在許多情況下它們的半衰期很短，而且它們?cè)谠S多種類型的細(xì)胞上都起作用。但是，我們可以推測只有在異常的情況下，它們?cè)谙到y(tǒng)液體例如血清和血漿中的含量的測 定值才會(huì)很高。一些作用范圍很廣的蛋白例如細(xì)胞催向因 子、激素、生長因子等在血清和血漿中的含量很高，半衰期 很長和很容易檢測到的情況是不多