纖維素柱的制備及其在超氧化歧化酶提純中的應(yīng)用

1、纖維素柱的制備及其在超氧化歧化酶提純中的應(yīng)用武余波 王曉東（武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)教改班 ）摘要： 本實(shí)驗(yàn)以纖維素銅氨溶液制得高分子的分級(jí)、尺寸排除色譜的纖維素填料，用梯度洗脫法分離經(jīng)過(guò)離心的從豬血中提取的超氧化歧化酶，并在2 8 0 nm處用紫外吸收法測(cè)定吸光度繪制淋洗曲線。關(guān)鍵詞 ： 纖維素 超氧化歧化酶 部分收集 梯度洗脫一、前言高分子與小分子的一個(gè)顯著的區(qū)別在于其性質(zhì)與其分子量密切相關(guān)。 在生物高分子的研究中需要 對(duì)生物大分子進(jìn)行分級(jí)。但是，傳統(tǒng)的有機(jī)沉淀劑的使用會(huì)導(dǎo)致生物大分子的變性失去活性，尺寸排 斥色譜可以避免上述的問(wèn)題，因而在生物大分子的研究中得到了廣泛應(yīng)用。尺

2、寸排斥色譜的基本原理是基于高分子的分子量不同而得到分離的。 當(dāng)高分子流過(guò)孔徑具有一定 尺寸分布的色譜柱填料時(shí)，分子量小的高分子由于尺寸小進(jìn)入空隙的幾率較大，運(yùn)動(dòng)的路徑較長(zhǎng)，其 保留時(shí)間較長(zhǎng)，較晚流出色譜柱，從而達(dá)到分離的目的。常用的分級(jí)填料是交聯(lián)葡聚糖凝膠，瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠，但價(jià)格昂貴，難于大規(guī)模應(yīng) 用。利用來(lái)源豐富的纖維素置備色譜柱填料不僅價(jià)格低廉而且節(jié)約石油資源保護(hù)環(huán)境。盡管使用纖維素作為原料已制備了強(qiáng)度高，尺寸穩(wěn)定性好，分辨率高的 SEC 填料；但由于孔徑太窄，分級(jí)范圍很 窄，應(yīng)用受到很大的限制。通過(guò)最新的研究發(fā)現(xiàn)，使用聚乙二醇和纖維素銅氨溶液共混可以得到孔徑 合適的填料，本文

3、通過(guò)對(duì)這種新型填料在超氧歧化酶分離中的應(yīng)用表征了填料的性能。超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于生物體中，按照其所含有的金屬離子的不同分為：銅鋅超氧 化物歧化酶（Cu Zn- SOD）,錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD），鐵超氧化物歧化酶（Fe-SOD）。其催化反 應(yīng)如下：2O2 -+2H+t HQ+Q在生物體內(nèi)，它是一種重要的自由基清除劑，能專(zhuān)一的清除O2- ，保護(hù)細(xì)胞，能治療多種疾病，并能抗衰老，對(duì)生物體有保護(hù)作用。在豬血液中，Cu Zn- SOD與血紅蛋白等共存于紅血球中。當(dāng)紅血球破裂后，用氯仿-乙醇處理溶血液，使血紅蛋白沉淀，Cu Zn- SOD則留在水-乙醇溶液中。將磷酸氫二鉀加入水-乙

4、醇溶液中時(shí)， 由于其極易溶于水中，而在乙醇中的溶解度很小，溶液明顯分層，上層是具有Cu Zn- SOD的含水乙醇相，下層是磷酸氫二鉀的水相。 分液后向上層含 Cu Zn- SOD的水-乙醇相中加入丙酮使 SOD沉 淀。極性有機(jī)溶劑能使蛋白質(zhì)脫去水化層，并降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用，致使蛋白 質(zhì)顆粒凝聚而沉淀。將所得的蛋白質(zhì)在 PH=7.6 磷酸緩沖溶液中，用尺寸排斥色譜柱進(jìn)行純化。 二、試劑與儀器 2 1. 試劑CuSO4 5出0，20%NaOH，PEG2000，短棉絨，4%硫酸，異丙醇，濃氨水， 95%乙醇，氯仿， K2HPO4 3H2O，K2HPO4，0.9%NaCI，丙酮，1

5、0mmol/LHCI，鄰苯三酚（用 10mmol/L HCI 作溶劑配 制，4C下保存），新鮮豬血500ml，2.5%草酸鉀，甲醛溶液。2 2. 儀器 燒杯（250mL、500mL、50mL各2個(gè)），量筒（10mL,100mL各一個(gè)），1000mL分液漏斗（1個(gè)），藥匙， 洗瓶，抽濾裝置（抽濾瓶、布氏漏斗各兩個(gè)） ，玻璃攪拌棒，恒流泵，自動(dòng)部分收集器（ 1 個(gè)），淋洗 液瓶（2個(gè)），電磁攪拌器（1個(gè)），試管（5mL ），臺(tái)秤，機(jī)械水泵，真空干燥器，電爐，注射器及針 頭，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，分析天平，低溫高速離心機(jī)，冰箱。23 實(shí)驗(yàn)步驟1. 酶的制備(1) 取新鮮豬血 500mL (已預(yù)先加入

6、50mL2.5%草酸鉀作為抗凝劑)，3000轉(zhuǎn)/min離心20min去除 上層血漿，收集紅細(xì)胞約 250mL，加入等體積的0.9%NaCI溶液，用玻璃棒攪拌充分，洗滌， 3000轉(zhuǎn) /min 離心 20min ，棄去上層清液(如此反復(fù) 3 次)，收集洗凈的紅細(xì)胞放入 800mL 燒杯中，加 250mL 重蒸水，將燒杯置于冰浴中攪拌 40min 以上，得溶血液 500mL 。(2) 往溶液中緩慢加入在 4 C下預(yù)冷過(guò)的95%勺乙醇125mL,然后緩慢加入在4C下預(yù)冷過(guò)的氯仿 75mL, 攪拌15min，室溫下3000轉(zhuǎn)/min離心20min，棄去沉淀，收集上層清液約330mL ,此即酶的粗提取

7、液。(3) 往上述液中加入 141.9gK2HPO4 3H2O和22.3g蒸餾水，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，振蕩后靜止分層 (約15min )。收集上層乙醇一氯仿相(微渾濁)，室溫下離心(3500轉(zhuǎn)/min) 25min，棄去沉淀，得上層清液約 150mL 。(4) 向所得溶液中加入 0.75倍體積的在4C下預(yù)冷過(guò)的丙酮，CuZn-SOD便沉淀下來(lái)。室溫下3500轉(zhuǎn)/min離心20min，收集灰白色沉淀物。 將此灰白色沉淀物溶于約 5mL蒸餾水中(呈懸浮狀)，在4C 下，250mL2.5mmol/L ( PH值為7.6)的磷酸鉀緩沖溶液中透析，每隔半小時(shí)換一次透析液，共換45次。透析液內(nèi)出現(xiàn)沉淀，在室

8、溫下3500轉(zhuǎn)/min離心，棄去沉淀收集上清液于小試管中，在冰箱中保存。2. 纖維素柱的制備( 1 )制備 Cu(OH) 2取16.5g CUSO4 5H2O加132mL水，攪拌加熱至沸后，停止加熱，緩緩加入8mL25%28%的濃氨水，并攪拌。冷卻至室溫后，用水將沉淀洗至中性。倒出清液后，加112mL 水入沉淀中，冰水浴條件下加入53mL 20% NaOH溶液并攪拌，再用水洗至中性，抽濾得天藍(lán)色濕的Cu(OH)2 (含水率約60%)。( 2)制備纖維素銅氨溶液8g纖維素置于56mL濃氨水中，加入13mL水后密封杯口，置于冰箱中冷至10C以下。將10.4g含水率約為 60%的 Cu(OH) 2

9、加入到 6mL 10% NaOH 溶液里，攪拌均勻后倒入上述冷卻的纖維素氨水 溶液中，立即攪拌均勻，置于冰箱中冷卻。冷卻后加水13mL ，繼續(xù)攪拌，再冷卻，再攪拌使纖維素完全溶解，得到藍(lán)色清亮的粘稠溶液( A )，纖維素濃度約為 8%，溶液總質(zhì)量約為 100g。( 3)柱填料的制備將8g PEG-2000溶于40ml水中，得無(wú)色透明粘稠溶液，即20%PEG水溶液(B)。取等體積(約40ml)上步所制纖維素銅氨溶液( A),攪拌下與(B)混合均勻后，在減壓條件下抽氣20分鐘除去其中氣泡后，將其裝入注射器中，均勻用力推出呈絲狀的溶液，直接在10% NaOH 溶液中凝固 15min后，再將其轉(zhuǎn)移至

10、4%的稀硫酸溶液中，放置 30min ，可得透明而均勻的細(xì)絲。用水洗去酸，再把細(xì) 絲剪成1mm以下的圓柱體。放在 70C的水中加熱1小時(shí)，以除去其中的 PEG2000。將制得填料保 存于含 20%異丙醇和 2%甲醛水溶液中備用。此圓柱體為SEC 柱填料 1#同上方法，不用共混液，而直接用纖維素銅氨溶液(A)可制得SEC柱填料2#3. 纖維素柱層析( 1 )裝柱將所得填料 1#和 2# 按體積比 1：1 混合并填充玻璃色譜柱中，填充時(shí)不要混入氣泡，同時(shí)輕輕 敲打管壁，使填料填充緊密均勻。裝好后，填料上部用濾紙覆蓋填料，以保持膠床頂部平整，不受流 入溶液干擾。( 2)層析用 2.5mmol/LpH

11、=7.6 的緩沖溶液作柱層析平衡液，用 2.5mmol/L 200mmol /L ( 100mL) pH=7.6 的磷酸鉀緩沖溶液進(jìn)行梯度洗脫。流速為40mL/h,每管收集4mL，收集大約30管。以磷酸鉀緩沖溶液為參比，在280nm處采用紫外吸收法測(cè)定每管的吸光度，繪制淋洗曲線。裝置如下圖。 MX洱議曲3.結(jié)果與討論(1)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)列表如下:Ve(mL)481216202428323640ABS11.12721.74371.67301.36831.18051.06840.96550.83040.70320.5784ABS21.12721.74071.67301.36831.17901.06840

12、.96460.83040.70280.5779ABS1.12721.74221.67301.36831.17981.06840.96510.83040.70300.5782Ve(mL)44485256606468727680ABS10.47880.31240.38200.23720.19190.15410.12600.11180.09900.0935ABS20.47900.31240.38160.23710.19250.15380.12590.11150.09890.0934ABS0.47890.31240.38180.23720.19220.15400.12600.11170.09900.0

13、935Ve(mL)84889296100104ABS10.08740.10490.07600.07260.07150.0714ABS20.08740.10470.07600.07250.07140.0712ABS0.08740.10480.07600.07260.07150.0713(2)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的洗脫曲線如右下圖:3.2討論(1) 實(shí)驗(yàn)中由于操作過(guò)程中先加入了酶，之后加入緩沖溶液使柱子充滿(mǎn)，造成曲線的前部分丟失。 正確的順序是先加入緩沖溶液使柱子充滿(mǎn)，再緩慢加入酶，之后才能開(kāi)始洗脫。(2) 在制備纖維素銅氨溶液時(shí)，一定要攪拌至變?yōu)樗{(lán)色均勻的粘稠溶液，即無(wú)纖維素顆粒存在，否 則在抽絲過(guò)程中容易

14、堵塞注射器。(3) 實(shí)驗(yàn)時(shí)，若發(fā)現(xiàn)纖維素銅氨溶液太稠，可加入適量蒸餾水，冷卻再攪拌。加入20%的PEG溶 液得混合溶液粘度較小，抽絲較容易。(4) 裝柱時(shí)，填料要填充緊密均勻，不要混入氣泡，保持柱表面均勻?；旌咸盍嫌捎诿芏炔煌o裝 柱帶來(lái)了一定的難度。參考文獻(xiàn)1 D Lecacheux, G Brigand. Carbohydr Polym, 1998(8):1191302 S C Churms. J Chromatogr A, 1996(720): 1511663 G Yang, L Zhang, J Membrane Sci, 1996(114):1491554 G Yang, L Zhang, X Xiong, et al. Chinese J Polym Sci, 2001(19):4155 L Zhang, J Zhou, G Yang, et al. J Chromatogr A, 1998(839): 1316 McCord, J M, Fridovich I. J Biol C