基礎(chǔ)生物技術(shù)

1、基礎(chǔ)生物技術(shù)基礎(chǔ)生物技術(shù)Basic BiotechnologyBasic Biotechnology第八章第八章特定應(yīng)用特定應(yīng)用人類健康和檢驗(yàn)人類健康和檢驗(yàn)第一節(jié)第一節(jié)醫(yī)學(xué)應(yīng)用醫(yī)學(xué)應(yīng)用(application in medicine)(application in medicine)學(xué)習(xí)目標(biāo)學(xué)習(xí)目標(biāo) 本章將會學(xué)習(xí)到：本章將會學(xué)習(xí)到： 1. 1. 生物技術(shù)在人類健康問題典型應(yīng)用生物技術(shù)在人類健康問題典型應(yīng)用 2. 2. 生物技術(shù)在人類健康問題主要應(yīng)用生物技術(shù)在人類健康問題主要應(yīng)用基因治療基因治療 基因治療(gene therapy)指的是正?；蛱娲毕莼蛞猿C正遺傳疾病的分子生物科技, 其程序

2、與基因剔除(gene knockout)技術(shù)相反,包括: 1)替代治療(replacement therapy): 需要添加完整的基因于病人基因組中以補(bǔ)足缺陷基因 2)標(biāo)的基因修復(fù)(targeted gene repair): 不干擾DNA上的基因調(diào)節(jié), 修復(fù)后細(xì)胞能回復(fù)原來的功能基因治療的類型基因治療的類型 基因治療分成兩種: 1)體細(xì)胞基因治療(somatic cell gene therapy): 此種操作僅限于體細(xì)胞, 不能遺傳給后代 2)生殖細(xì)胞基因治療(germline gene therapy): 針對生殖細(xì)胞和性細(xì)胞(精子和卵子)操作,可遺傳于后代基因治療的方法基因治療的方法

3、矯正生物缺陷基因有兩種方法: 1. 離體基因?qū)牒筮M(jìn)入體內(nèi)(ex vivo)： -離體基因?qū)牒筮M(jìn)入體內(nèi)的策略是將病人的細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)室操作后，將改善之細(xì)胞殖回病人體內(nèi) 基因治療的方法基因治療的方法 2. 活體內(nèi)(in vivo) ： -活體內(nèi)基因治療是利用基因傳遞系統(tǒng)(例如：載體或脂質(zhì)體liposomes)將矯正基因直接殖入體內(nèi)基因治療工具基因治療工具 基因治療工具是基于傳輸系統(tǒng)與序列運(yùn)送 1)病毒傳遞系統(tǒng)： -此系統(tǒng)包含四種類型，分別為逆轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses) 、腺病毒(adenoviruses)、腺結(jié)合病毒(adeno-associated viruses)和慢病毒(lenti

4、viruses)等 2)標(biāo)的基因修補(bǔ)工具： -包括三股型寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotides) 、同型組合(homologous recombination)和目標(biāo)病毒基因(viral gene targeting)基因治療工具基因治療工具 目前用于基因療法的方法為藉由病毒載體送入，其優(yōu)點(diǎn)在于轉(zhuǎn)殖效率佳，表現(xiàn)可能較好，而缺點(diǎn)卻在于其潛在性的危險(xiǎn) 非病毒載體方法就恰好相反，雖然其安全性較高，比較沒有副作用，但其轉(zhuǎn)殖效率及表現(xiàn)基因方面可能都有很大的限制病毒傳遞系統(tǒng)病毒傳遞系統(tǒng)三股型寡核苷酸三股型寡核苷酸(triplex-forming (triplex-for

5、ming oligonucleotides)oligonucleotides)TFOTFO 三股型寡核苷酸是由單股DNA分子與其所能辨識的完全或幾乎完全相同的雙股DNA結(jié)合，并進(jìn)一步形成三股結(jié)構(gòu) 此技術(shù)有兩種方法： 1)具有缺陷基因的矯正序列之寡核苷酸結(jié)合雙股DNA片段，因此取代缺陷基因 2)將寡核苷酸單獨(dú)使用，于三股型寡核苷酸形成后會破壞突變基因的活性三股型寡核苷酸三股型寡核苷酸(triplex-forming (triplex-forming oligonucleotides)oligonucleotides)TFOTFO三股型寡核苷酸三股型寡核苷酸(triplex-forming (tr

6、iplex-forming oligonucleotides)oligonucleotides)TFOTFO同型組合同型組合(homologous (homologous recombination)recombination) 同型組合也稱為小片段同型更換(small fragment homologous) ，利用染色體間DNA小片段的交換發(fā)展細(xì)胞之能力，以正確核苷酸序列取代具有缺陷基因 此片段與錯(cuò)誤位置之基因序列互補(bǔ)，完成后會形成合成寡聚合物，因而啟動細(xì)胞DNA的修補(bǔ)機(jī)制目標(biāo)病毒基因目標(biāo)病毒基因(viral gene targeting)(viral gene targeting) 部分

7、正?；虮徊迦胗趩喂蒁NA病毒并轉(zhuǎn)型入宿主基因組中，于插入基因組后，宿主細(xì)胞會利用出入基因修補(bǔ)基因組中錯(cuò)誤的部份基因治療的狀況基因治療的狀況 基因治療最早的案例發(fā)生于法國，其為應(yīng)用基因治療于腺苷酸去胺酶(adenosine deaminase; ADA)缺乏癥的病人，此種疾病為基因缺陷影響所編碼之酵素，造成自體性退化型嚴(yán)重免疫不全(SCID) ，嚴(yán)重者會造成死亡 基因治療方式為將病人的T細(xì)胞次族群分離并與攜帶ADA基因載體混合，經(jīng)病毒感染后，于實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)T細(xì)胞，確定目標(biāo)基因具活性在注入病人體內(nèi)基因治療的狀況基因治療的狀況 目前已應(yīng)用于基因治療的疾病包括囊性纖維化、Duchene肌肉萎縮癥(遺

8、傳性疾病)及家族性高膽固醇癥 基因治療在單一基因疾病較適用，但大部分的疾病并非單一基因所造成 基因治療離成功還很遙遠(yuǎn)，目前基因治療上無法適用于生命中不能復(fù)制細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞) 基因治療的費(fèi)用而貴，誰該進(jìn)行?該不該進(jìn)行?基因治療的挑戰(zhàn)基因治療的挑戰(zhàn) 基因治療發(fā)展緩慢的原因?yàn)椋?1. 了解基因功能(understanding gene function)： 2. 基因傳輸(gene delivery)： 3. 多基因特性(multigenic traits)： 4. 成本高(high cost)：DNA/RNADNA/RNA疫苗疫苗(DNA/RNA Vaccines)(DNA/RNA Vaccin

9、es) 疫苗是用以保護(hù)身體免于受到侵害, 需要再感染前施用且在不同期間具不同程度之防御效果 重要的疾病: -完全撲滅(天花) -減少病例(A型肝炎,B型肝炎,麻疹,斑疹傷寒癥及破傷風(fēng)) 免疫反應(yīng)免疫反應(yīng) 免疫系統(tǒng)如何運(yùn)作？ 抗原：為一種造成免疫反應(yīng)的分子，一般為蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段及多醣體，對于病原具有特異性 主動免疫(active immunity)：宿主因自然感染或人工預(yù)防接種而具后天性免疫力 被動免疫(passive immunity)：使用抗體 疫苗是一種抗原劑，注射入血液中，可以刺激免疫系統(tǒng)合成抗體，以保護(hù)身體免于感染Humoral Immunity (Antibodies)Humor

10、al Immunity (Antibodies)傳統(tǒng)疫苗傳統(tǒng)疫苗 一般傳統(tǒng)疫苗是利用殺死或部分變?nèi)醯牟≡鷣碇苽?，以誘導(dǎo)宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體攻擊所察覺的入侵者 由死的病原所制造：A型肝炎與小兒麻痹疫苗 由病原中分離抗原：B型肝炎次單元疫苗 減毒活疫苗：具有雙重活性，且有能力透入細(xì)胞以誘導(dǎo)殺手細(xì)胞攻擊，包括麻疹、腮腺炎、德國麻疹、小兒麻痹及天花等疫苗基因疫苗基因疫苗 基因疫苗(genetic vaccines)是在質(zhì)體上插入一個(gè)或兩個(gè)抗原蛋白基因，且經(jīng)基因重組使其不具致病力 以重組蛋白質(zhì)方式生產(chǎn)疫苗：分離病毒鞘殼上某一種蛋白質(zhì)的基因，再利用重組技術(shù)，表現(xiàn)成重組蛋白質(zhì)，則此重組蛋白質(zhì)將可作為疫苗可

11、用 人類基因體計(jì)劃人類基因體計(jì)劃 生物科技在人類健康上應(yīng)用之一為基因組學(xué)-結(jié)構(gòu)基因組與功能性基因組 后-基因體學(xué)：知道序列之后，開始研究這些序列的功能性 基因體學(xué) 蛋白質(zhì)體學(xué) 醣類體學(xué)發(fā)現(xiàn)基因解讀基因功能DNADNA文件文件 DNA文件可展現(xiàn)個(gè)體特殊的詳細(xì)基因型態(tài)，并可應(yīng)用于不同的診斷與鑒定 -遺傳性疾病的檢驗(yàn) -遺傳諮詢 生物技術(shù)應(yīng)用于遺傳性疾病檢驗(yàn)有兩個(gè)階段： -未出生前：檢驗(yàn)為決定胚胎或胎兒的遺傳疾病 -未發(fā)病前：癥狀前篩選，診斷過程可于疾病癥狀出現(xiàn)前的任何時(shí)間下進(jìn)行遺傳性疾病的檢驗(yàn)遺傳性疾病的檢驗(yàn) 于胚胎或胎兒的遺傳疾病，傳統(tǒng)的檢驗(yàn)為羊膜穿刺法或絨毛采樣 羊膜穿刺為從胎兒四周收集羊膜液

12、體，此試驗(yàn)通常不能用于懷孕期第15或第16周前，細(xì)胞可經(jīng)培養(yǎng)以進(jìn)行核型分析與生化缺陷分析，且可測試是否罹患生化疾病 絨毛采樣在懷孕約8-10周即可進(jìn)行遺傳諮詢遺傳諮詢 遺傳諮詢是運(yùn)用檢測結(jié)果提供多種信息，協(xié)助客戶面對遺傳病診斷結(jié)果以做出正確的選擇 簡單地說便是由患者或其親屬提出有關(guān)疾病的問題，由醫(yī)生或醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)專業(yè)人員就該病的病因遺傳方式診斷治療和預(yù)測，以及患者同胞、子女再患此病的風(fēng)險(xiǎn)等問題，進(jìn)行解答的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)，又稱遺傳商談。而其主要目的是在防止遺傳病和避免缺陷兒的出生，它更是優(yōu)生的重要內(nèi)容之一 個(gè)體基因藥理學(xué)個(gè)體基因藥理學(xué) 藥物療法已廣泛地使用于治療生理疾病原性不同之疾病，但不同的生物個(gè)體對

13、于單一藥物的反應(yīng)是不同的，某些藥品甚至?xí)胁涣嫉挠绊?個(gè)人化藥物治療為較安全的方法：影響因子包括年齡、營養(yǎng)及一般健康狀況個(gè)體基因藥理學(xué)個(gè)體基因藥理學(xué) 將具有相關(guān)疾病表現(xiàn)行之群組患者分成次群組，依據(jù)群組織次群特性給予藥物處方，以增進(jìn)藥物效能與降低毒性，優(yōu)點(diǎn)包括：改善醫(yī)師處方、專一性對偶基因核苷酸及藥物發(fā)展 專一性對偶基因寡核苷酸(allele-specific oligo-nucleotides; ASO)為一種能與只有一個(gè)核苷酸差異序列雜交之專一性碳針，正常與已知基因突變之核苷酸序列疾病可利用ASOs篩檢出異常者單一核酸多樣性單一核酸多樣性(single (single nucleotide

14、polymorphismsnucleotide polymorphisms；SNP)SNP) SNPs最早發(fā)現(xiàn)的例子是在1919年即發(fā)表的ABO血型，直到1993年才了解這是一個(gè)基因的三種不同的alleles 這是人類個(gè)體與種族之間差異的來源 會造成外觀高矮、胖瘦之類的明顯差異，更可能隱含某種易感染的疾病，或?qū)λ幬锏牟顒e反應(yīng)等等 目前資料顯示大約每1.91kb就存在一個(gè)SNP干細(xì)胞干細(xì)胞 干細(xì)胞(stem cells)是一群尚未完全分化的細(xì)胞 動物干細(xì)胞具無限分化能力并可形成特化細(xì)胞，如同植物的愈合組織 干細(xì)胞能分化成多種結(jié)構(gòu)(例如血液干細(xì)胞產(chǎn)生與血液相關(guān)細(xì)胞，如血小板、紅血球、白血球等) ，

15、因而具有多能性產(chǎn)生多功能性的干細(xì)胞產(chǎn)生多功能性的干細(xì)胞 人類胚胎干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)于1998年，科學(xué)家可由幾個(gè)來源來獲得干細(xì)胞： -在活體外授精的胚胎：分離自人類胚胎內(nèi)部細(xì)胞塊 -發(fā)育不全胚胎：為終止懷孕婦女的胚胎，墮胎或死胎 -體細(xì)胞細(xì)胞核轉(zhuǎn)移：卵細(xì)胞去除細(xì)胞核之后，與另一個(gè)體細(xì)胞融合而產(chǎn)生全能細(xì)胞成體干細(xì)胞成體干細(xì)胞 成體干細(xì)胞來自于一些成體組成，但一些組織干細(xì)胞仍不能成功分離 成體干細(xì)胞的利用受到一些因子限制，包括數(shù)量太少及離心分離純化困難，如果是遺傳性疾病，成體細(xì)胞也可能有缺陷而不能使用 成體干細(xì)胞在培養(yǎng)一段時(shí)間后會失去分裂和分化能力，并不適于醫(yī)學(xué)上使用 成體細(xì)胞只會與胚胎細(xì)胞融合，變成染色體

16、數(shù)目比正常細(xì)胞還多的巨大細(xì)胞多功能性干細(xì)胞的應(yīng)用潛力多功能性干細(xì)胞的應(yīng)用潛力 為何干細(xì)胞極具潛力? 1. 有助于了解生物發(fā)育期間的相關(guān)機(jī)制，了解先天性疾病與異常細(xì)胞分裂及細(xì)胞特化發(fā)生之關(guān)連性 2. 多功能性干細(xì)胞可作為醫(yī)藥臨床前試驗(yàn)中不同類型細(xì)胞之初期試驗(yàn) 3. 多功能細(xì)胞發(fā)展成分化細(xì)胞，以取代損傷細(xì)胞和組織，并減少器官和組織移植的需要人類胚胎干細(xì)胞人類胚胎干細(xì)胞? ? 黃禹錫沒有如他在2004年所聲稱的那樣克隆成世界第一個(gè)人類胚胎 經(jīng)最終檢驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，并不是與患者體細(xì)胞基因相同的干細(xì)胞 一旦干細(xì)胞自我更新的控制機(jī)制遭一旦干細(xì)胞自我更新的控制機(jī)制遭到移除，結(jié)果將和癌癥的情況相像到移除，結(jié)果將和

17、癌癥的情況相像 一直以來，我們都是干細(xì)胞為萬靈丹，卻沒想到它竟可能轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞，目前已知有幾種癌癥與干細(xì)胞有關(guān)，想要根除這類癌癥，可能先摧毀這些飄忽的兇手 目前已經(jīng)有數(shù)種血液癌癥和實(shí)心腫瘤，證實(shí)由癌癥干細(xì)胞所引起的 腫瘤生長有由一小群類似干細(xì)胞的癌細(xì)胞所造成飼養(yǎng)動物提供器官與細(xì)胞飼養(yǎng)動物提供器官與細(xì)胞 異體移植(xenotransplantation)為異種飼養(yǎng)動物主要器官(例如心與肺)可移植于人體 早期的報(bào)告是將豬的細(xì)胞轉(zhuǎn)殖入人體，為何選擇豬? 大小、容易飼養(yǎng)和照顧 豬會攜帶類病毒-豬內(nèi)生性轉(zhuǎn)錄病毒，此病毒可被傳遞入人體細(xì)胞中及豬抗原半乳糖(Gal)易加速免疫排斥第二節(jié)第二節(jié)法院上的應(yīng)用法院

18、上的應(yīng)用學(xué)習(xí)目標(biāo)學(xué)習(xí)目標(biāo) 本節(jié)中可學(xué)習(xí)到本節(jié)中可學(xué)習(xí)到: : 1. DNA 1. DNA于法院上的應(yīng)用于法院上的應(yīng)用 2. 2. 科學(xué)上的科學(xué)上的DNADNA文件文件什么是什么是DNADNA文件文件? ? DNA文件(DNA profiling)是將DNA應(yīng)用在檢驗(yàn)用途，藉以描繪樣品DNA并與其它已知特性的樣品做比較，可應(yīng)用于健康維護(hù)、司法系統(tǒng)與其他方面 健康維護(hù)上的應(yīng)用，遺傳疾病之診斷，以預(yù)測個(gè)人因親代遺傳疾病而罹患之概率 司法系統(tǒng)上，使用DNA文件來辨認(rèn)犯罪事件的嫌疑犯或親族關(guān)系的爭議(1994年桑普森殺妻案及辜振甫私生女)法庭偵防用的法庭偵防用的DNADNA來源來源 從人體的任一部分皆可

19、獲得DNA，如血液、唾液、體液及尿液 細(xì)胞核與粒線體DNA兩種皆可使用，但因mtDNA含量較高，因此較可能恢復(fù)古老樣本的生物品系 mtDNA可經(jīng)由母系遺傳，因此可解決可提供未知女性的親源關(guān)系分析方法分析方法 RFLP與PCR技術(shù)可以用于DNA文件，傳統(tǒng)DNA文件分析需利用變異數(shù)串連重復(fù)序列(Variable Number Tandem Repeats; VNTRs) DNA技術(shù)的成功有賴于基因組片段的鑒定，音可以使用于族群中單獨(dú)個(gè)體的區(qū)別 不同個(gè)體基因組最常發(fā)生之變異區(qū)序列串列稱為小衛(wèi)星基因(minisatellites)，由2-100個(gè)核苷酸組成，通常為GC-rich小衛(wèi)星基因小衛(wèi)星基因(m

20、inisatellites)(minisatellites) 小衛(wèi)星基因(minisatellites)序列的特性為在兩個(gè)內(nèi)切酶切位間具有縱向重復(fù)排列的DNA序列 GGATGGATGGATGGATGGAT 每一串序列中重復(fù)的次數(shù)約為2-100，此種重復(fù)的核苷酸部分稱為變異數(shù)串連重復(fù)序列 一基因座重復(fù)區(qū)域是多變性的(10%)，為多型性區(qū)域 許多家族之對偶基因皆有VNTR對偶基因，VNTR之雜異性是普遍的變異數(shù)串連重復(fù)序列變異數(shù)串連重復(fù)序列(Variable (Variable Number Tandem Repeats; VNTRs)Number Tandem Repeats; VNTRs) 應(yīng)

21、用RFLP技術(shù)，核酸內(nèi)切酶是可以辨識VNTRs兩側(cè)序列，再以電泳及南方墨點(diǎn)法之RFLP標(biāo)準(zhǔn)操作流程可呈現(xiàn)不同樣品VNTRs之差異 由于同一個(gè)體的任何組織中所得之DNA具VNTRs類型是相同的，此分析法只需要少量的樣本即可以以PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增DNADNA文件文件(PCR-based DNA (PCR-based DNA profiling)profiling) 目前DNA文件采用PCR與短縱排重復(fù)序列(short tandem repeats, STRs)，STRs為短(2-4)VNTRs，STR位置較VNTRs具有較少的對偶基因 1999年美國使用10個(gè)STR基因座，保證10億個(gè)體中有少于

22、一個(gè)具有相同的結(jié)果 FBI目前使用13個(gè)STR基因座位置來提高其樣本有相同DNA文件的概率利用利用RFLP(restriction fragment RFLP(restriction fragment length polymorphism)length polymorphism)與與PCRPCR的的DNADNA文件文件 RFLP為DNA文件利用自然發(fā)生具有高度差異性(每個(gè)基因座上有許多對偶基因)的VNTRs，因此兩個(gè)不相關(guān)個(gè)體具有相同DNA文件是非常不可能的 此技術(shù)的缺點(diǎn)為需要相當(dāng)質(zhì)量的DNA及電泳時(shí)所造成不同的結(jié)果判讀，如斑轉(zhuǎn)移(band-shifting)為相同的片段于膠片上遷移的距離不同，因此需要藉助其它方法來確認(rèn)(單型探針monomorphic probe)利用利用RFLPRFLP與與PCR (polymerase