糖化酶的固定化及其在葡萄糖生產(chǎn)中的應(yīng)用工藝

1、廣州大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱：糖化酶的固定化及其在葡萄糖生產(chǎn)中的應(yīng)用工藝學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)年級：學(xué)號：姓名：組員：指導(dǎo)老師：王小蘭、柯德森1 / 9摘要：利用有關(guān)固定化酶的理論和方法，研究固定化糖化酶的效率與固定時(shí)間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中測定固定化糖化酶偶聯(lián)率、相對活力、 活力回收來衡量其生產(chǎn)工藝的優(yōu)劣，并探討糖化酶的濃度對固定化效果及結(jié)合牢固程度的影響和驗(yàn)證固定化糖化酶催化生產(chǎn)葡萄糖的重復(fù)使用能力及其效率。制備固定化糖化酶的方法為離子吸附法，并且使用DNS 法測定固定化酶的活力。結(jié)果顯示：在該次實(shí)驗(yàn)中，固定化60min 時(shí)，固定化糖化酶的效率最好；固定化 10min 時(shí)，固定化酶的活力回收為3.4

2、7 ，偶聯(lián)率為48.10 ，相對活力為7.23 ；固定化 20min 時(shí)，固定化酶的活力回收為4.74 ，偶聯(lián)率為54.76 ，相對活力為8.66；固定化 30min 時(shí)，固定化酶的活力回收為4.71 ，偶聯(lián)率為53.42 ，相對活力為8.82；固定化 40min 時(shí)，固定化酶的活力回收為3.84 ，偶聯(lián)率為58.13 ，相對活力為6.62；固定化 50min 時(shí)，固定化酶的活力回收為4.04 ，偶聯(lián)率為60.59 ，相對活力為6.67；固定化 60min 時(shí)，固定化酶的活力回收為6.34 ，偶聯(lián)率為70.00 ，相對活力為9.06。重復(fù)使用葡萄糖固定化酶的過程中，固定化酶的利用效率降低。 酶

3、與載體的濃度比例較高固定化酶葡萄糖生產(chǎn)效率高。關(guān)鍵詞： 固定化酶效率時(shí)間酶活力1、前言：糖化酶，又稱葡萄糖淀粉酶，糖化酶的底物專一性較低，它除了能從淀粉鏈的非還原性未端切開a-1.4 鍵處，也能緩慢切開a-1.6。因此，它能很快的把直鏈淀粉從非還原性未端依次切下葡萄單位，在遇到1.6 鍵分割，先將a-1.6 鍵分割，再將a-1.4 鍵分割，從而使支鏈淀粉水解成葡萄糖。糖化酶用于以葡萄糖作發(fā)酵培養(yǎng)基的各種抗生素、有機(jī)酸、氨基酸、維生素的發(fā)酵； 本品還大量用于生產(chǎn)各種規(guī)格的葡萄糖?？傊?，凡對淀粉、糊精必需進(jìn)行酶水解的工業(yè)上，都可適用。酶固定化后一般穩(wěn)定性增加，易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離，且易于控制，能反復(fù)

4、多次使用。便于運(yùn)輸和貯存，有利于自動(dòng)化生產(chǎn)，但是活性降低，使用范圍減小，技術(shù)還有發(fā)展空間。固定化酶是近十余年發(fā)展起來的酶應(yīng)用技術(shù)，在工業(yè)生產(chǎn)、 化學(xué)分析和醫(yī)藥等方面有誘人的應(yīng)用前景。酶的固定化方法通常按照用于結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)的類型進(jìn)行分類，大致有三種：非共價(jià)結(jié)合法、 化學(xué)結(jié)合法、 包埋法。本實(shí)驗(yàn)利用離子結(jié)合法制備固定化糖化酶。離子結(jié)合法就是酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的不溶性載體的固定化方法，常用的載體有：DEAE-纖維素， DEAE葡-萄糖凝膠 ,CM-纖維素等。本實(shí)驗(yàn)采用:GF-201 大孔強(qiáng)堿陰離子交換樹脂，應(yīng)用離子交換結(jié)合法制備固定化酶， 該法操作簡單， 條件溫和， 酶活性中心和高級

5、結(jié)構(gòu)不易受到破壞，酶活回收率比較高。 其缺點(diǎn)是： 結(jié)合力弱， 容易脫落， 受溶液離子強(qiáng)度和 pH 影響較大。2 / 9使用共價(jià)結(jié)合法不會使酶容易脫落，國外研究者已研究出用氧化鋯涂層多孔玻璃或多孔陶瓷，然后硅烷化，最后用重氮基、醛基和異硫氰基衍生物偶聯(lián)糖化酶，結(jié)果使酶活較高，并且能連續(xù)生產(chǎn)3 個(gè)酶半衰期。在此次實(shí)驗(yàn)中還使用用DNS 法測定固定化酶、殘留酶、原酶的活力。2、材料與方法：2.1 材料（1）糖化酶液， GF-201 大孔強(qiáng)堿陰離子交換劑，葡萄糖，可溶性淀粉 (20g/L) ，CuSO4.5H2O，次甲基蘭，酒石酸鉀鈉，氫氧化鈉，亞鐵氰化鉀，乙酸，乙酸鈉(配制 pH4.6 緩沖液 )，無

6、水乙醇，鹽酸。硫代硫酸鈉（0.05M ），碘溶液（次碘酸鈉，0.1M ）。硫酸2M 。（2）酶液、固定化酶及固定化后的殘留酶液。2.2 實(shí)驗(yàn)儀器恒溫水浴鍋（可達(dá)99， 5 個(gè)），酸度計(jì)（3 個(gè)），容量瓶，量筒，燒杯，移液管，比色管，漏斗，玻璃棒，錐形瓶，試管架，吸耳球，pH 試紙，濾紙，離心機(jī)，離心管，分光光度計(jì)等。2.3 試劑（1）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液 （ 1mg/mL ）：精確稱取100mg 葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至100mL。（ 2） 3,5-二硝基水楊酸試劑：精確稱取3,5-二硝基水楊酸 1g，溶于 20mL 2mol/L NaOH 溶液中，加入50mL 蒸餾水， 再加入 30g 酒石酸

7、鉀鈉， 待溶解后用蒸餾水定容至100mL 。蓋緊瓶塞，勿使CO2 進(jìn)入。若溶液混濁可過濾后使用。（ 3） 0.1mol/L pH5.6 的檸檬酸緩沖液A 液：（ 0.1mol/L檸檬酸）：稱取C6H8O7 · H2O 21.01g ，用蒸餾水溶解并定容至1L 。B 液：（ 0.1mol/L檸檬酸鈉）：稱取Na3C6H5O7 · 2H2O 29.41g，用蒸餾水溶解并定容至1L 。取 A 液 55mL 與 B 液 145mL 混勻，既為 0.1mol/LpH5.6 的檸檬酸緩沖液。（ 4） 1%淀粉溶液：稱取 1g 淀粉溶于 100mL 0.1mol/L pH5.6 的檸檬酸

8、緩沖液中。2.4 操作步驟試劑的配制（1）糖化酶液： 市售商品化糖化酶,去離子 pH7 的磷酸緩沖液配制，根據(jù)標(biāo)稱的活力單位配3 / 9制為 1 萬單位 /ml 的溶液，離心去除不溶性雜質(zhì)，共配4000ml, 4備用。（ 2） 2mol/L 氫氧化鈉： 8gNaOH-100ml ，共配 3000ml 。（ 3） 2mol/LHCL:17ml 濃鹽酸 -100ml ，共配 3000ml 。固定化酶實(shí)驗(yàn)步驟（1）載體的預(yù)處理A ：乙醇處理： 15 克濕離子交換劑-50ml 燒杯加入30ml 去離子水，攪拌，倒去水。注入2倍體積無水乙醇，乙醇浸泡過夜（12h），然后用去離子水連續(xù)沖洗以除去乙醇。B：

9、堿處理： 2 倍體積（ 50ml）的 2mol/lNaOH 浸泡并充分?jǐn)嚢?，再以去離子水沖至pH6.0-7.0C：酸處理 :用 2 倍體積的 2mol/L HCl 溶液處理陰離子交換樹脂，然后用去離子水洗至pH6.0 。D：重復(fù) B（ 2）酶的固定化取 4 份糖化酶液，每份 30ml ，分別倒入 4 個(gè)貯液槽中，并各加入預(yù)處理的離子交換劑15g，不斷輕輕攪拌，開始進(jìn)行酶的固定化。分別在10min 、 20min 、 30min 、60min 后過濾去未固定的酶液， 測量每份固定化酶及反應(yīng)后殘留酶液活性。保存固定化后的酶于冰箱以備下一實(shí)驗(yàn)。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取 7 支干凈的具塞刻度試管（可用封

10、口膠代替），編號，按表1 加入試劑：表 1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作管號試劑1234567葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ mL）00.20.61.01.41.82.0蒸餾水（ mL）2.01.81.41.00.60.20葡萄糖含量（ mg）00.20.61.01.41.82.03,5- 二硝基水楊酸（ mL）2.02.02.02.02.02.02.0搖勻，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20mL。以 1 號管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在540nm波長下比色測定光密度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（ 2）酶活力的測定：取6 支干凈的試管，編號，按表3-2 進(jìn)行操作。表 3-2酶活力測

11、定取樣表4 / 9操作項(xiàng)目淀粉酶活力測定固定化酶活力測定1%淀粉溶液 /ml1.01.01.01.01.01.0將各試管和淀粉酶溶液置于40恒溫水溶液中保預(yù)保溫溫 10min淀粉酶原液 /ml0.10.10.10.2g0.2g0.2g（空白管的酶預(yù)先煮沸失活）在 40恒溫水溶液中準(zhǔn)確保溫5min保溫取反應(yīng)液 0.1ml ，加入去 1.9ml 水，迅速加入以下DNS3,5- 二硝基水楊酸 /ml2.02.02.002.02.0將各試管搖勻，顯色后進(jìn)行比色測定光密度，記錄測定結(jié)果，操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線（煮沸，定容）。，裝柱模擬葡萄糖的生產(chǎn)將上周保存于冰箱的固定化酶全部裝柱，加足夠量的淀粉溶液進(jìn)行洗脫操作

12、，每隔 5min取樣一次，共取 16次。同樣處理后在540nm波長下比色測定每個(gè)樣品的光密度。（ 3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的葡萄糖含量（mg）, 按下列公式計(jì)算酶活力。 酶活力單位（ U） =1mol 葡萄糖產(chǎn)生量 /min 計(jì)算每毫升酶液及每克固定化酶的活力，計(jì)算殘留酶活力，從而計(jì)算酶偶聯(lián)率及相對活力，評價(jià)固定化的效果。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線表 3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（葡萄糖含量/mg）試管號1234567葡萄糖含量 /mg00.20.61.01.41.82.0A54000.0370.1710.3150.4540.6010.6555 / 9表 4原酶吸光值原酶

13、12A5400.2440.272A540 平均值0.258酶活力單位0.8199總活力單位819.9表 5固定化酶與殘留酶吸光值固定化時(shí)A540含量間（ min ）殘留酶平固定化酶平均殘留液體積固定化酶含量均值（ mL）（ g）值100.20.20.150.1400.1454517.10.289931597200.30.30.240.2590.2514715.60.2982342300.20.20.230.2270.2334616.10.26961953400.20.20.240.2580.25348140.23955871500.20.20.280.2480.26743140.2372861

14、9600.10.10.0.2860.2894816.90/ 9表 6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算固定化殘留酶固定化0.1mL0.2g殘留酶固定化活力回相對偶聯(lián)時(shí)間葡萄糖酶葡萄殘留酶固定總活力酶總活收活力率（min ） 含量糖含量活力單化酶單位力單位（ g）（ g）位活力單位1044.328.348.8641.66425.4728.5227.2348.108283.47 2043.1312.478.6262.49370.9138.9068.6654.764844.74 3039.7812.017.9562.40381.8838.6728.8253.422824.71 4037.311

15、1.277.4622.25343.2531.5566.6258.13423.84 5034.3711.856.8742.37323.0733.186.6760.5984.04 6027.3315.405.4663.08245.9752.0529.0670.006.34 表 7 固定化 10min 第一次生產(chǎn) A540試管號A540淀粉溶液生產(chǎn)時(shí)間樣品葡萄總葡萄糖葡萄糖生體積（ mL）（ min ）糖含量含量產(chǎn)效率10.1393050.46914.0572.81120.137100.46313.8802.77630.133150.45113.5252.70540.129200.43913.171

16、2.63450.124250.42412.7282.54660.121300.41512.4622.49270.117350.40412.1082.42280.116400.40112.0192.404表 8 固定化 10min 第二次生產(chǎn) A540試管號A540淀粉溶液生產(chǎn)時(shí)間樣品葡萄總葡萄糖葡萄糖生7 / 9體積（ mL）（ min ）糖含量含量產(chǎn)效率10.1133050.39111.732.34620.102100.35910.772.15430.089150.3209.61.9240.077200.2858.551.7150.059250.2326.961.39260.036300.1

17、644.920.98470.022350.1233.690.73880.018400.1113.330.6664結(jié)論由表 5、表 6 可知，固定化酶的活力回收、相對活力、偶聯(lián)率均隨著固定化的時(shí)間的增加而增加，因此固定化酶效果最好的是60min 。我們小組做的固定化10min，所以以下分析根據(jù)固定化10min 的結(jié)果進(jìn)行分析！固定化酶總活力單位加殘留酶總活力單位僅為453.9948 ，而原酶總活力單位有819.9，占比為 55%，可能原因有：在固定化過程中，損耗的固定化酶的質(zhì)量太多；殘留液測量不準(zhǔn)確；有可能在測量酶活的時(shí)候先加入3,5- 二硝基水楊酸后加入酶液，導(dǎo)致計(jì)算過程中有大誤差。8 / 9在兩次生產(chǎn)過程中，葡萄糖生產(chǎn)效率隨著時(shí)間的減小而減小，符合生產(chǎn)規(guī)律。葡萄糖生產(chǎn)效率最高的時(shí)間點(diǎn)為前5min。5. 實(shí)驗(yàn)心得在本次實(shí)驗(yàn)過程中，我們學(xué)習(xí)到了如何正確的固定化酶，雖然固定化酶的相對活力很低，但是在這過程中，我們學(xué)會了很多新知識，我們可以自己實(shí)操地生產(chǎn)出固定化酶，可以簡單地使用固定化酶生產(chǎn)葡萄糖，這對于我們的相關(guān)知識得到了鞏固！感謝王老師以及柯老師的悉心教導(dǎo)，也謝謝組員們的相互配合！6. 參考文獻(xiàn)1 柯德森 .生物工程下游技術(shù)實(shí)驗(yàn)手冊