坦布蘇病毒簡(jiǎn)介

1、坦布蘇病毒簡(jiǎn)介1、坦布蘇病毒病概述2021年4月以來(lái)在我國(guó)大局部養(yǎng)鴨地區(qū)發(fā)生了一種以傳播迅速、突發(fā)性的產(chǎn)蛋急劇下降為主要特點(diǎn)的新鴨病.臨床主要表現(xiàn)為：產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋嚴(yán)重下降,產(chǎn)蛋率從90%降至10%以內(nèi),甚至絕產(chǎn),給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(李玉峰,2021).該病最初命名為“鴨出血性卵巢炎,“鴨病毒性腦炎,“鴨產(chǎn)蛋下降綜合癥,“鴨傳染性卵巢炎(黃欣,2021;李玉峰,2021;廖敏等,2021)等.蘇敬良等從病鴨中別離出了一種新型黃病毒,并 命名為BYD病毒,屬于在鴨上首次發(fā)現(xiàn).2021年該病被確診是鴨坦布蘇病毒 (DuckTembusuvirus, DTMUV).到目前為止,更有報(bào)道本病在蛋

2、雞、雞群及鵝群 (傅光華等, 2021;黃欣梅,2021)中發(fā)現(xiàn).關(guān)于本次在鴨上傳播的鴨黃病毒,病毒學(xué)家,法國(guó)馬賽第二 大學(xué)的訪問(wèn)學(xué)者ErnestGould表示,由蚊子造成的傳播不應(yīng)該是一種必然的結(jié)果,并指出這種病毒傳播期間的溫度變化與由蚊子傳播的其他黃病毒并不一致.(鴨子在早春的嚴(yán)寒氣 候中開(kāi)始患病,而推測(cè)起來(lái),蚊子種群在此時(shí)還很虛弱,而疾病的爆發(fā)那么會(huì)一直持續(xù)到秋 季.)鑒于該病為鴨群新發(fā)生的疫病,除該病的病原學(xué)外,其致病機(jī)理、免疫機(jī)理、快速診 斷技術(shù)和防制舉措等,都有待進(jìn)一步深入研究.2、病原學(xué)鴨出血性卵巢炎的病原與恩他耶病毒群的坦布蘇病毒(Tem-busuvirus, TMUV)印尼和

3、泰國(guó)病毒株的核甘酸同源性為87%91%,氨基酸同源性為98%99%;而與同群的Ntaya病 毒、Sitiawan 病毒、Theiler'smurineencephalomye-litisvirus(TMEV Bagaza病毒的核甘酸同 源性大于70%,國(guó)際上對(duì)黃病毒屬成員的分類標(biāo)準(zhǔn)為NS5基因3'端長(zhǎng)約1kb的區(qū)域中同種病毒的核甘酸序列同源性大于84%.因此確定該病原為黃病毒科黃病毒屬恩他耶病毒群的TMUVo 鴨坦布蘇病毒(DuckTembusuvirus, DTMUV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)、黃病 毒屬(Flavivirus).TMUV的病毒粒子直徑 405

4、0nm,有脂質(zhì)囊膜(胡旭東等,2021). 病毒基因組為單股正鏈RNA,大小為.病毒基因組結(jié)構(gòu)鴨坦布蘇病毒基因組為不分節(jié)段的單股正鏈 RNA,分子量約為X 106(Shustov,AVetal.,2007)由 10990 個(gè)核甘酸構(gòu)成(Yun,Tetal.,2021)=病毒基因組由 3'非編 碼區(qū)(3' untranslatedregion , UTR) , 5'非編碼區(qū)(5' non-codingregion, NCR 及一個(gè)開(kāi)放性閱讀框openreadingframe, ORF組成.3'非編碼區(qū)由618個(gè)核甘酸構(gòu)成,與其 他黃病毒不同,3非編碼區(qū)還含

5、有一個(gè) poly A尾,包括起始、調(diào)節(jié)基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄 的保守二級(jí)或三級(jí)RNA元件.5'非編碼區(qū)由94個(gè)核甘酸構(gòu)成,在黃病毒屬中該結(jié)構(gòu)保守 性較差,其主要功能是在 RNA復(fù)制過(guò)程中作為正鏈合成的起始位點(diǎn).病毒基因組的開(kāi)放性 閱讀框ORF包含10230nt,編碼一個(gè)大多聚蛋白,由3426個(gè)氨基酸構(gòu)成,可以裂解為3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白C、M、E蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1, NS2A, NS2B NS3, NS4A NS4B NS5Mukhopadhyay,Setal.,2005> E、NS1、NS3 NS5蛋白具有保守性和抗原性. C蛋白的 氨基酸同源性低,含有大量的堿性氨基酸,參與病毒組裝

6、過(guò)程.E蛋白是DFV主要外表蛋白,具有促使病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合及膜融合功能,能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體.DFV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是黃病毒中最大的,是病毒感染過(guò)程中產(chǎn)生的主要免疫原,但NS1免疫不能誘導(dǎo)無(wú)明顯的抗病毒抗體產(chǎn)生,發(fā)生抗體增強(qiáng)效應(yīng)的可能性較小TangY, etal.,2021.NS3蛋白具有絲氨酸蛋白酶、核甘三磷酸酶/RNA解旋酶活性,參與蛋白質(zhì)水解加工及病毒復(fù)制,與病 毒的致病性密切相關(guān)鄭杰,2007.NS3與NS2組成病毒復(fù)制體,感染動(dòng)物可產(chǎn)生抗 NS2-3 抗體,但抗NS2-3抗體不具有病毒中和活性鄭杰,2007.基因組RNA就是DTMUV特異性 RNA,具有感染性、攜帶全部遺產(chǎn)信息、在

7、病毒增殖過(guò)程中,直接起 mRNA作用,既可復(fù) 制子代RNA,又可譯出病毒蛋白.生物學(xué)特性TMUV對(duì)乙醴及去氧膽酸鹽敏感.56c加熱15分鐘滅活.最適pH為,pH10以上使其 滅活.對(duì)酸敏感.TMUV在胰酶處理后,感染性喪失.鴨坦布蘇病毒可以在鴨胚、雞胚、 鴨胚成纖維細(xì)胞及局部傳代細(xì)胞系如 Vero細(xì)胞中繁殖.將鴨坦布蘇病毒經(jīng)尿囊腔接種雞胚 和鴨胚,3-5d后可致雞胚和鴨胚死亡.接種 CEFW彳5代不會(huì)產(chǎn)生病變,而將鴨源胚毒第 1代接種DEF就在48h出現(xiàn)了明顯CPE適應(yīng)DEF后的病毒,通常在36-48h就會(huì)產(chǎn)生CPE 隨時(shí)間延長(zhǎng),CPE會(huì)更加明顯,表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮和脫落,細(xì)胞折光性增強(qiáng),細(xì)胞變圓

8、以及 細(xì)胞融合,最終崩解死亡.通過(guò).染色便可見(jiàn)細(xì)胞破碎,并有大量紅染顆粒.通過(guò) RT-PCR 檢測(cè),接種病毒的CEF為陰性,而接種DEF后檢測(cè)為陽(yáng)性李玉峰等,2021.3鴨坦布蘇病毒的研究現(xiàn)狀1997年,溫立斌等溫立斌,2001從石家莊、邢臺(tái)、邯鄲等地發(fā)現(xiàn)康貝爾鴨產(chǎn)蛋下降, 有神經(jīng)病癥,別離到有囊膜 RNA病毒,經(jīng)初步鑒定,疑似黃病毒,初步命名為“鴨病毒性 腦炎.曹貞貞等曹貞貞,2021于2021年將種鴨和蛋鴨發(fā)病死亡病例暫命名為“鴨出血 性卵巢炎.2021年,蘇敬良、高福等蘇敬良等,2021經(jīng)過(guò)大量的研究工作,測(cè)序分析 將其命名為白洋淀BYD病毒.李玉峰等李玉峰,2021發(fā)現(xiàn),除種鴨外,商品

9、肉鴨也發(fā) 病.黃欣梅等黃欣梅,2021報(bào)道鴨鵝均發(fā)病,將其命名為“腦炎-卵巢炎綜合征.隨后, 傅光華等傅光華等,2021;黃欣梅,2021報(bào)道本病在蛋雞、雞群中發(fā)現(xiàn).截至2021年12月15日,GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了 9株鴨源、1株鵝源、1株雞源共11 株DTMUV的基因序列.GenBankYY5株(HQ641390.1)鴨BYD-1 株(JF312912.1)鴨duck/SD/CHN/2021株(JF738022.1)鴨Fengxian 株(HQ833331.1)鴨Huabei 株(JF523187.1)鴨CJD05/CHN/2021株(JF795477.1)鴨HBJL 株(JF4231

10、23.1)鴨JS804 株(NC015843.1)鵝JM株(JN811559.1)鴨FS株(JN811558.1)鴨muscovy/SD/China/2021(JN232077.1)鴨11株鴨坦布蘇病毒的多聚蛋白、NS5 E基因核甘酸序列同源性均大于 98%.其中BYD-1、 JS804 FS JM、muscovy/SD/China/2021、CJD05I? 6株病毒完成了全基因組或聚蛋白基因 序列分析.E基因遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),11株鴨坦布蘇病毒分屬于2個(gè)分支,其中CJD05 Fengxian JS804 muscovy/SD/China/2021等4株的親緣關(guān)系相近,與泰國(guó)蚊源株 THCar

11、同 屬一個(gè)分支；而 BYD-1、FS JM、duck/SD/CHN/2021等4株的親緣關(guān)系相近,屬于另一個(gè) 分支.NS5基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果說(shuō)明,11株DFV分屬于2個(gè)分支,其中Huabei與其它 10株親緣關(guān)系較遠(yuǎn),與 TembusuvirusnoteN2revived14/6/82同屬一個(gè)分支；而其它 10株的 親緣關(guān)系相近,與泰國(guó)蚊源株 THCar同屬于一個(gè)分支.NS5和E基因進(jìn)化分析結(jié)果提示我 國(guó)的DFV源頭可能來(lái)東南亞,而不同地區(qū)流行病毒株存在遺傳變異情況李玉山I, 2021.4流行特點(diǎn)鴨坦布蘇病毒在自然爆發(fā)時(shí)可感染除番鴨外的所有品種產(chǎn)蛋鴨,包括蛋鴨如金定鴨、紹興鴨、山麻鴨、縉云麻

12、鴨、臺(tái)灣白改鴨、康貝爾鴨卜肉種鴨如北京鴨和櫻桃谷鴨及野鴨等滕巧泱等,2021.也有相關(guān)報(bào)道產(chǎn)蛋雞傅光華、陳仕龍等,2021、鵝自然感染發(fā) 病黃欣梅,2021.在病毒的復(fù)制研究中,也有相關(guān)報(bào)道稱人工肌肉注射或滴鼻接種別離的 病毒在雛鴨、雛雞、蛋鴨、雛鵝中成功復(fù)制出該病并回收到病毒李玉峰等,2021;廖敏等,2021；曹貞貞,2021； SuJing-liangandHuXu-dong 2021；黃欣梅,2021.到目前為止,有相關(guān)領(lǐng)域的研究人員從泄殖腔棉拭子中別離到病毒,說(shuō)明該病毒可經(jīng) 糞便排毒；另一方面,相關(guān)領(lǐng)域的研究人員從鴨場(chǎng)內(nèi)死亡麻雀體內(nèi)檢出鴨坦布蘇病毒,提 示病毒可經(jīng)鳥類傳播；帶毒蚊子和

13、麻雀可導(dǎo)致病原在不同鴨場(chǎng)間的傳播.在病鴨組織樣品 中進(jìn)行病毒別離,卵泡膜的檢出率最高,達(dá) 93%,近期該病毒在種鴨和種鵝上的垂直傳播 也有報(bào)道.5診斷目前可用于鴨坦布蘇病毒病原別離與鑒定的方法主要有SPF雞胚和鴨胚病原別離法(Cao,Zetal.,2021)常規(guī) RT-PCR檢測(cè)方法(Yan,Petal.,2021) 一步法 RT-PCR檢測(cè)方法(張帥 等,2021)、套式 PC諭測(cè)方法(顏丕熙等,2021)、Real-timeRT-PC檢測(cè)方法(Yan,Letal.,2021) 一步法 Real-timeRT-PC諭測(cè)方法(Yun,Tetal.,2021 RT-LAMP檢測(cè)方法(Tang,Y

14、etal.,2021)口 間接ELISAt(姬希文等,2021)等.實(shí)驗(yàn)室診斷鑒于對(duì)鴨坦布蘇病毒病的研究還不夠深入,目前實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)鴨坦布蘇病毒病的病 原的方法不是很多,但是每一種都有自身的優(yōu)缺點(diǎn).常規(guī)的檢測(cè)方法主要是血清學(xué)方法, 包括中和試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、熒光抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以及分 子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等.血清中和試驗(yàn)(Virus-neutralizationtest,VN)中和試驗(yàn)是目前最常用、最可靠的方法,是公認(rèn)的一種權(quán)威方法.通常在雞胚上以固 定血清-稀釋病毒法進(jìn)行,也有人在鴨胚、雛鴨或病毒適應(yīng)細(xì)胞中進(jìn)行試驗(yàn).就目前而言, 此病的中和試驗(yàn)的孵育溫度、病毒量等的最正確

15、條件的研究,還未見(jiàn)報(bào)道.利用中和抗體進(jìn) 行的空斑減少試驗(yàn),微量中和試驗(yàn)也未見(jiàn)報(bào)道.中和試驗(yàn)雖是普遍認(rèn)為的權(quán)威診斷方法, 但其繁瑣、費(fèi)時(shí)、本錢高,不能用于快速診斷,難以在基層中推廣應(yīng)用.在診斷其他鴨病 上被認(rèn)為是一種最可靠的方法,但用該方法診斷鴨坦布蘇病毒病的研究還未見(jiàn)報(bào)道,相信 在不久的時(shí)間內(nèi)該方法的研究報(bào)道將接踵而來(lái).酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)當(dāng)前酶免疫測(cè)定技術(shù)中 應(yīng)用最廣泛的技術(shù),姬希文等(姬希文等,2021)首次建立了間接ELISAt以檢測(cè)鴨坦布蘇病 毒(DTV)抗體,利用純化的DTV奉賢株(FX2021

16、)乍為包被抗原,建立了檢測(cè) DTV血清抗體 的間接ELISAT法,并且對(duì)各種檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化.優(yōu)化后確定的抗原最適包被濃度為小g/孔,抗原最正確包被條件為37c放置2h后,4c下過(guò)夜,血清的最正確稀釋度為1 : 200,酶 標(biāo)二抗的最正確作用時(shí)間為45min,酶標(biāo)抗體最適稀釋度為1 : 2000.在優(yōu)化條件下,陰陽(yáng)性 臨界值判定標(biāo)準(zhǔn)為.用建立的間接ELISAT法對(duì)禽流感病毒、新城疫病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病 病毒、I型鴨肝炎病毒、呼腸孤病毒、禽白血病病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行了檢測(cè),均無(wú)交叉反響, 說(shuō)明該方法具有良好的特異性.批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)的最大變異系數(shù)分別為麻口,顯示該方法具有很好的穩(wěn)定性.用間接 E

17、LISA方法對(duì)140份疑似鴨坦布蘇病血清樣品進(jìn)行檢測(cè), 有108份樣品呈現(xiàn)陽(yáng)性,而瓊擴(kuò)試驗(yàn)只有32份呈陽(yáng)性結(jié)果,而且用該方法檢測(cè)的陽(yáng)性樣品 包括了瓊擴(kuò)試驗(yàn)的陽(yáng)性樣品,證實(shí)該方法具有較高的敏感性和特異性.間接ELISAT法雖然具有靈敏度高,操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),很多學(xué)者也建立了用 以診斷DTV的這種方法,但因所用的檢測(cè)試劑包被液、封閉液、酶標(biāo)抗體等尚未標(biāo)準(zhǔn) 化,病毒的純化和DTV陰性血清的制備等均存在一定難度,該方法在鴨坦布蘇病毒的檢測(cè) 診斷方面還未能彳#到廣泛的應(yīng)用姬希文等,2021.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)近兩年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速開(kāi)展,專家學(xué)者對(duì)鴨坦布蘇病毒的研究不斷地 深入,已經(jīng)建立起

18、檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的分子生物學(xué)方法.曹貞貞、張存等在對(duì)不同地區(qū)的 15份樣品進(jìn)行病毒別離后,RT-PCR僉測(cè)結(jié)果顯示禽流感、鴨瘟病毒、水禽細(xì)小病毒、鴨呼 腸孤病毒、鴨甲肝病毒、鴨形狀病毒、鴨圓環(huán)病毒、鴨冠狀病毒、雞傳染性支氣管炎呈陰 性,15份樣品中,1份樣品新城疫病毒陽(yáng)性,為自然病例的混合感染現(xiàn)象；僅黃病毒RT-PCR 檢測(cè)呈陽(yáng)性.這對(duì)于鴨坦布蘇病毒的準(zhǔn)確分類以及建立快捷的診斷方法奠定了根底曹貞 貞等,2021.顏丕熙等根據(jù)鴨坦布蘇病毒 E基因序列,設(shè)計(jì)了 2對(duì)重疊引物,建立了檢測(cè)鴨坦布蘇 病毒的套式RT-PC時(shí)法,該套式RT-PCR匕一般PCR敏感性高10倍,且具有良好的特異性. 應(yīng)用該套式

19、RT-PCR寸臨床病料進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證,結(jié)果說(shuō)明該套式RT-PCR1檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的有效手段,可用于鴨坦布蘇病毒的臨床診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查.采用該方法對(duì)安徽 省、河北省、山東省、浙江省、上海市等地發(fā)病鴨場(chǎng)的63份樣品進(jìn)行了檢測(cè),陽(yáng)性檢出率為48/63 %,而病毒別離率僅為13/63 %.由此說(shuō)明,與其他方法相比擬,所建立 的套式RT-PC時(shí)法具有快速、敏感、特異優(yōu)點(diǎn),可用于鴨坦布蘇病毒的流行病學(xué)調(diào)查及病 毒的木測(cè)顏丕熙,2021.云濤等建立的一步法實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR僉測(cè)方法,利用MGB探針,在3'非編碼區(qū) 設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針,最低能檢出 10Copies L的體外轉(zhuǎn)錄RNA量,在保證快速、準(zhǔn)確、特異的根底上,大大提升了檢測(cè)的敏感性,有利于,為鴨坦布蘇病毒病的疫病監(jiān)測(cè)和限制 提供技術(shù)支持(云濤等,2021) o王友令等以新別