流式細(xì)胞術(shù)在科研中的應(yīng)用描述

1、 流式細(xì)胞術(shù)在科研中 的應(yīng)用 什么是流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀實(shí)物BD FACSVantageBD-Calibur 流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到的細(xì)胞參數(shù)流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到的細(xì)胞參數(shù)顆粒度細(xì)胞大小=前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積 =側(cè)向角散射光（SSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對(duì)復(fù)雜性外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖 熒光信號(hào)熒光信號(hào)熒光信號(hào)雙色直接染色 流式報(bào)告的圖一般分為四種，即散點(diǎn)圖、直流式報(bào)告的圖一般分為四種，即散點(diǎn)圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點(diǎn)圖和直方圖。散點(diǎn)圖和直方圖。 幾個(gè)概念： %Gated：陽(yáng)性細(xì)胞百分比。反映細(xì)胞群體中陽(yáng)

2、性細(xì)胞的數(shù)量。 Mean：平均熒光強(qiáng)度，與被檢測(cè)物質(zhì)的表達(dá)量有關(guān)，在正態(tài)分布時(shí)一般用該值。 Geo Mean：幾何平均熒光強(qiáng)度，在陽(yáng)性細(xì)胞為偏態(tài)分布時(shí)一般用該值。 散點(diǎn)圖 密度圖二維等高圖直方圖圖 報(bào)告中常見(jiàn)的幾種流式細(xì)胞圖R1File: 4Acquisition Date: 06-Mar-03QuadEvents% Gated X MeanY MeanUL2542.4037.47461.36UR106710.08816.86468.89LL529149.9819.574.41LR397537.55418.809.87圖 Annexin V/PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡和壞死流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析=點(diǎn)圖

3、分析流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析=直方圖分析圖中100101（M1）為陰性細(xì)胞，101以上的（M2）為陽(yáng)性細(xì)胞 當(dāng)前流式細(xì)胞分析發(fā)展趨勢(shì)v 從相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)到絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù) v 從相對(duì)定量到絕對(duì)定量分析v 從單色到多色熒光分析 v 從細(xì)胞膜成分到細(xì)胞內(nèi)成分分析v 從細(xì)胞分析到可溶性成分的流式細(xì)胞分析 今天主要內(nèi)容： 流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中的應(yīng)用 流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤細(xì)胞DNA倍體中的應(yīng)用 流式細(xì)胞儀的分選功能 流式細(xì)胞術(shù)在蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用細(xì)胞凋亡檢測(cè)1、半胱氨酸蛋白酶3檢測(cè)法（早早期）2、Annexin V-FITC/PI 法（早期）3、Apo2.7檢測(cè)法（早期）4、TUNEL 法（晚期）5、DNA含量分析

4、法（晚晚期）6、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡的分析細(xì)胞凋亡的分析 細(xì)胞凋亡的主要表現(xiàn)細(xì)胞凋亡的主要表現(xiàn) 細(xì)胞內(nèi)水解酶改變：如細(xì)胞內(nèi)水解酶改變：如Caspase-3活化活化 細(xì)胞膜不對(duì)稱性改變，磷脂酰絲氨酸外翻，細(xì)胞膜不對(duì)稱性改變，磷脂酰絲氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI 細(xì)胞核細(xì)胞核DNA的斷裂改變：的斷裂改變：TUNNEL實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)（APO-BRDU，APO-DIRECT） 凋亡相關(guān)蛋白：凋亡相關(guān)蛋白： Fas Bcl-2細(xì)胞凋亡Active Caspases-3細(xì)胞凋亡Caspases-3細(xì)胞凋亡Annexin

5、凋亡檢測(cè)（Annexin V/PIAnnexin V/PI法） PIAnnexin V-FITCDNA倍體的流式分析細(xì)胞DNA含量檢測(cè)（Propidium iodide碘化丙啶）， 單參數(shù)直方圖圖中2N代表G0/G1期細(xì)胞，4N代表G2/M期細(xì)胞，兩者中間代表S期細(xì)胞。這是以2倍體和4倍體細(xì)胞為主的流式DNA圖 DNA細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期 200 400 600 8001000DNA含量細(xì)胞數(shù)量2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體含量與凋亡關(guān)系 DNA亞G1峰的檢測(cè)：利用PI染色，檢測(cè)具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。 凋亡過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解

6、成小的片段，在標(biāo)本制備中的固定處理時(shí)，細(xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞內(nèi)降解的DNA片段從細(xì)胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。Date acquired: 14-Jan-03File: 7Gy 4hr.001Source: dongboDIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 R1圖 FCM測(cè)試細(xì)胞周 期分布和凋亡流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選功能分選：

7、分選： 用熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞，可被有效地分離出來(lái)， 用于分選的效率較高的儀器國(guó)內(nèi)較少，臺(tái)式機(jī)一般分選速度為每秒鐘300300個(gè)細(xì)胞， 大型機(jī)分選速度可達(dá)到每秒上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞488 nm laser+-Fluorescence Activated Cell SortingCharged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector流式分選與分子生物學(xué)研究 除了將分選得到的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)研究外，F(xiàn)CMFCM分選系統(tǒng)可為PCRPCR、FISHFISH等分子技術(shù)提供純度較高的特異性細(xì)胞群，減少研究中的干擾

8、因素，獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Cytometric Beads Array (CBA)流式液相多重蛋白定量技術(shù)導(dǎo)言 常規(guī)的蛋白分析方法：ELISA：一次反應(yīng)只能檢測(cè)一個(gè)指標(biāo)Western blot：不能對(duì)蛋白精確定量不足之處： 檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)需耗費(fèi)大量樣本 分批操作導(dǎo)致組間差異大 操作繁瑣，耗時(shí)耗力 如何能夠從單個(gè)微量樣本中一次檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)蛋白，并加以定量，獲得高精確度的數(shù)據(jù)呢？ 針對(duì)于此，BD-Pharmingen成功研發(fā)了基于流式細(xì)胞儀檢測(cè)平臺(tái)的液相多重蛋白定量技術(shù)BD Cytometric Bead Array，簡(jiǎn)稱CBA CBACBA技術(shù)簡(jiǎn)介 CBA是一系列帶有不同強(qiáng)度紅色熒光、包被有捕獲

9、抗體的微球，類似ELISA的捕獲孔板，可以捕獲液相樣本（血清、血漿或者細(xì)胞培養(yǎng)上清液等）中相應(yīng)的抗原，再結(jié)合PE標(biāo)記檢測(cè)抗體，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測(cè)，便可同時(shí)對(duì)樣本中的多種可溶性蛋白成分進(jìn)行定量+Analyte of interestFluorescent detection Ab capture Bead capture AbBeadBD Cytometric Bead Array123不同強(qiáng)度紅色熒光的捕獲微球，在FCM FL3檢測(cè)不同的目標(biāo)蛋白PE 標(biāo)記的檢測(cè)抗體，在FCM FL2檢測(cè)。 PE的熒光強(qiáng)度即反映靶蛋白的含量456Human Th1/Th2 Lymph

10、okine CBA Th1/Th2 panel: IL2, IL4, IL5, IL10, TNF, IFN 用 FL3熒光的強(qiáng)度不同區(qū)別 種不同的微球（beads） Direct sandwich immunoassay FL2 (PE) detector reagentl樣本處理l6 cytokines from a 50 L samplelThree pipetting stepsl3 hour total incubationlQuantitative results and complete report generation Software assisted quantitati

11、ve analysis, with curve fitting algorithm Result reporting included in softwareHuman Th1/Th2 Lymphokine CBA Chemokine-I CBA Assay Standard0 pg/mlCBA Assay Standard 10 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard20 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard40 pg/mlCBA

12、Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard80 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard156 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard312 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard625 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standar

13、d1250 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard2500 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay StandardHuman Th1/Th2 Lymphokine CBA 標(biāo)準(zhǔn)曲線5000 pg/ml2500 pg/ml1250 pg/ml625 pg/ml312 pg/ml80 pg/ml20 pg/mlIL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-Curve-Fitting Model: 4-P

14、arameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.26 B = 5.00 C = 3.60 D = 3.89 R2 = 0.9973Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.29 B = 4.24 C = 3.43 D = 4.33 R2 = 0.9991Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.34 B = 4.11 C = 3

15、.42 D = 4.45 R2 = 0.9987Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.31 B = 3.86 C = 3.30 D = 4.45 R2 = 0.9980Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.31 B = 3.77 C = 3.37 D = 4.77 R2 = 0.9997Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy =

16、 (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.33 B = 4.08 C = 3.24 D = 4.42 R2 = 0.9987T TN NF F- -a a110100100010000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI II IF FN N- -g g1101001000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F

17、FL L2 2 M MF FI II IL L- -1 10 0110100100010000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI II Il l- -4 4110100100010000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI II IL L- -5 5110100100010000110100100

18、010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI II Il l- -2 2110100100010000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI I總結(jié)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的是處于流動(dòng)狀態(tài)中的被熒光素標(biāo)記的微粒，包括細(xì)胞、細(xì)菌或者微球。對(duì)于可溶性抗原，只能用相應(yīng)的抗體先包被微球，再來(lái)結(jié)合抗原進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀器在臨床和科研中具有廣泛的用途。1、半胱氨酸蛋白酶3檢測(cè)法（早早期）2、Annexin V-FITC/PI 法（早期）3、Apo2.7檢測(cè)法（早期）4、TUNEL 法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）6、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞DNA含量檢測(cè)（Propidium iodide碘化丙啶），