中標(biāo)的國家自然基金標(biāo)書

1、申報(bào)學(xué)科代碼1科學(xué)部編號(hào)項(xiàng)目類別C010704國家自然科學(xué)基金申請(qǐng)書項(xiàng)目名稱迷走反射調(diào)節(jié)胰腺分泌的神經(jīng)傳遞機(jī)制研究申請(qǐng)者所在單位郵政編 碼通訊地 址電話傳真電子信箱(Email):申請(qǐng)日 期：2002年3月10日國家自然科學(xué)基金委員會(huì)1997年制填報(bào)說明一、填寫申請(qǐng)書前，請(qǐng)先查閱國家自然科學(xué)基金有關(guān)項(xiàng)目申請(qǐng)辦法及規(guī) 定。申請(qǐng)書各項(xiàng)內(nèi)容，要實(shí)事求是，逐條認(rèn)真填寫。表達(dá)要明確、嚴(yán)謹(jǐn)，字跡 要清晰易辨。外來語要同時(shí)用原文和中文表達(dá)。第一次出現(xiàn)的縮寫詞，須注出 全稱。二、申請(qǐng)書為十六開本，復(fù)印時(shí)用 B5復(fù)印紙，于左側(cè)裝訂成冊(cè)。第三頁起 各欄空格不夠時(shí)，請(qǐng)自行加頁。一式六份（至少一份為原件），由所在單位

2、審查 簽署意見后，按申報(bào)學(xué)科投送國家自然科學(xué)基金委員會(huì)對(duì)口科學(xué)部。地區(qū)科學(xué) 基金項(xiàng)目，申請(qǐng)書另報(bào)送?。ㄗ灾螀^(qū)）科委一份原件。三、封面右上角“科學(xué)部編號(hào)”由對(duì)口科學(xué)部填寫，項(xiàng)目類別和申報(bào)學(xué)科 代碼 1由申請(qǐng)者填寫。四、下列人員不得作為申請(qǐng)項(xiàng)目的負(fù)責(zé)人提出申請(qǐng)，但可作為項(xiàng)目組成員 參加研究：在讀（含在職）研究生已離退休的科研人員申請(qǐng)單位的兼職科研人員五、申請(qǐng)者和項(xiàng)目組中具有高級(jí)專業(yè)技術(shù)職務(wù)的主要成員申請(qǐng)（含參加）的 項(xiàng)目數(shù)，連同在研的國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目數(shù)（不含重點(diǎn)項(xiàng)目、重大項(xiàng)目），不 得超過兩項(xiàng)。六、同一項(xiàng)目組研究內(nèi)容相近的項(xiàng)目，只允許報(bào)送一個(gè)學(xué)科。七、申請(qǐng)者可因同類項(xiàng)目競(jìng)爭等原因，提出不宜評(píng)議

3、本項(xiàng)目的專家名單（姓 名與單位， 3人以內(nèi)） ，密封于信封中，釘在申請(qǐng)書原件封面，或另專函相關(guān)學(xué) 科，供科學(xué)部選擇同行評(píng)議人時(shí)參考。科學(xué)部將對(duì)此信息保密。八、國家自然科學(xué)基金委員會(huì)地址：北京市海淀區(qū)雙清路83 號(hào)，通訊地址：北京 8610 信箱。郵政編碼： 100085、簡表研 究 項(xiàng) 目名 稱中 文迷;走反射'調(diào)節(jié)胰腺分泌必的神經(jīng)傳遞I機(jī)制研究英 文The mechanism of the vago-vagal reflex circuit in mediating pancreatic secretion evoked by luminal factors類別A.自由申請(qǐng)B.高技術(shù)

4、探索C.青年D.咼技術(shù)探索 項(xiàng)目主題號(hào)E.重大F.重點(diǎn)H.專項(xiàng)A申報(bào) 學(xué)科名稱1消化生理學(xué)名稱2消化系內(nèi)科學(xué)A.基礎(chǔ)研 究A代碼1C010704代碼2C03030204申請(qǐng)金24.00萬起止年月2003年1月至200胖用|基12月所用實(shí)驗(yàn)室A.國家重點(diǎn)B.兀部門 開放頭驗(yàn)至編號(hào)1-研 究 內(nèi) 容 和 意 義摘要通過細(xì)FI胞內(nèi)標(biāo)記逆向追迷走感覺細(xì)FI胞由生通Q理過記細(xì)錄丿胞內(nèi)結(jié)標(biāo)合記胰逆 腺向 分蹤、 功能迷走證頭腸細(xì) 道丿胞受電 刺生激后迷錄7走神結(jié) 經(jīng)合 通刀胰過腺Gl丿J u泌和功SP日能 將信kLL息頭上傳A道 至孤刺束激核/I1迷走I T背核誦過NPYJ 1 LISP1 U及1 口SS

5、調(diào)節(jié)1 S 胰I.腺分丿1J泌闡明米冃-走彳運(yùn)X動(dòng)神經(jīng)2兀接受特定刺激丿人后丿興tXr奮0有ITJ 特神經(jīng)遞質(zhì)It 的胰腺內(nèi)神經(jīng)調(diào)節(jié)丿口特/ 、的胰腺內(nèi)1 T外»分沁功口 J 臺(tái)F,從r J，而F屮一 確»從迷-走咸1覺神經(jīng)內(nèi)空|、:M外擊分 1炫泌功能巳1從炫1 而空II確1從米走:感4®覺覺1 神1A »丿兀主題詞1.主題詞數(shù)量不多于三個(gè)；2.主題詞之間空一格（英文用 /分隔）。|中文后Zk英文NeurochemTcal' transmiss Vago-vagaireflex7 Jcircuit/Pa ncreatic secreti on簡

6、表填寫要求一、簡表內(nèi)容將輸入計(jì)算機(jī)，必須逐項(xiàng)認(rèn)真填寫，采用國家公布的標(biāo)準(zhǔn)簡化漢字。簡表中所有代碼以最新發(fā)布的國家自然科學(xué)基金申請(qǐng)項(xiàng)目分類目錄及代碼 為準(zhǔn)填寫。高技術(shù)探索課題主題號(hào)按高技術(shù)新概念新構(gòu)思探索課題項(xiàng)目指南中主題號(hào)填寫，申請(qǐng)其重點(diǎn)項(xiàng)目時(shí)項(xiàng)目類別也填寫B(tài),并在申請(qǐng)書封面右上角加注“高技術(shù)探索課題重點(diǎn)項(xiàng)目”。二、 凡選擇性欄目，將相應(yīng)提示符A B等之一填入該欄的右下角。三、部分欄目填寫要求：項(xiàng)目名稱一一應(yīng)確切反映研究內(nèi)容和范圍，最多不超過25個(gè)漢字（包括標(biāo)點(diǎn)符號(hào)）。基礎(chǔ)研究一一指以認(rèn)識(shí)自然現(xiàn)象、探索自然規(guī)律為目的，不直接考慮應(yīng)用目標(biāo)的研究活動(dòng)。應(yīng)用基礎(chǔ)研究一一指有廣泛應(yīng)用前景，但以獲取新原

7、理、新技術(shù)、新方法為主要目的的研究。申報(bào)學(xué)科一一申請(qǐng)項(xiàng)目所屬的最基礎(chǔ)學(xué)科。如涉及多學(xué)科可填寫兩個(gè)，先填為主學(xué)科。申請(qǐng)金額一一以萬元為單位，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，注意小數(shù)點(diǎn)。起止年月一一起始時(shí)間從申請(qǐng)的次年1月算起。終止時(shí)間為完成年度的 12月。所用實(shí)驗(yàn)室一一系指研究項(xiàng)目將利用的實(shí)驗(yàn)室，僅填寫國家計(jì)委批準(zhǔn)的國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室或部門批準(zhǔn)的開放實(shí)驗(yàn)室。所在單位名稱及代碼一一按單位公章填寫全稱。例如“中國科學(xué)院西安光學(xué)精密機(jī)械研究所”不得填“中科院西安光機(jī)所”或“西安光機(jī)所”。全稱中的數(shù)字，一律寫中文，例如：中國航天工業(yè)總公司第七O所。首次申請(qǐng)國家自然科學(xué)基金的單位，尚未編入單位代碼，其代碼暫不填寫。參加單位

8、數(shù)指研究項(xiàng)目組主要成員所在單位數(shù)，包括主持單位和合作單位(合作者所在單位)，以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。項(xiàng)目組主要成員指在項(xiàng)目組內(nèi)對(duì)學(xué)術(shù)思想、技術(shù)路線的制訂與理論分析及對(duì)項(xiàng)目的完成起重要作用的人員，本人 應(yīng)在申請(qǐng)書上親自簽名。本欄雙線右側(cè)內(nèi)容不輸入計(jì)算機(jī)。研究內(nèi)容和意義一一摘要與主題詞均錄入軟盤。2-二、立論依據(jù)(包括項(xiàng)目的研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析，并附主要參考文獻(xiàn)及出處)對(duì)基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國際科學(xué)發(fā)展趨勢(shì)，論述項(xiàng)目的科學(xué)意義； 對(duì)應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿、圍繞國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中的重要科 技問題，論述其應(yīng)用情景。餐后胰腺分泌是食物消化吸收過程中的重要組成部分，目前認(rèn)為這一過程 主要由內(nèi)分泌

9、激素膽囊收縮素(CCK及迷走一迷走反射作用于胰腺的迷走神經(jīng) 膽堿能節(jié)后神經(jīng)調(diào)節(jié)1-3。但餐后迷走神經(jīng)信號(hào)的上傳、中樞整合后控制胰腺分 泌信號(hào)的下傳神經(jīng)通路及在這一通路中參與的神經(jīng)遞質(zhì)還未闡明，病理研究證 實(shí)迷走神經(jīng)初級(jí)傳入纖維位于腸上皮以下粘膜固有層內(nèi)，提示腸道接受刺激后 并不直接作用于迷走神經(jīng)傳入纖維，而通過間接途徑起作用。5羥色胺(5-HT)為傳遞內(nèi)臟感覺的神經(jīng)遞質(zhì)，美國 Michigan大學(xué)胃腸肽研究中心報(bào)道迷走神經(jīng) 初級(jí)傳入纖維含有大量CCK-A及5-HT3受體，腸道內(nèi)的刺激，如碳水化合物、高 滲鹽水及粘膜磨擦等，可導(dǎo)致腸粘膜嗜鉻細(xì)胞(EC)釋放5-HT，繼而作用于迷 走傳入神經(jīng)末梢的

10、5- HT3受體，引起迷走反射主導(dǎo)的胰腺分泌4-6。迷走感覺神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)電生理記錄進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)5-HT與CCK可能協(xié)同作用刺激迷走神經(jīng)傳入纖維。然而這種信號(hào)如何上傳以及參與其傳遞過程的神經(jīng)遞 質(zhì)仍不清楚。迷走神經(jīng)節(jié) (vagal no dose gan glia ) 及孤束核 (nu cleus tractus solitarius, NTS為迷走傳入的重要部位。迷走神經(jīng)節(jié)及孤束核內(nèi)均有多種神 經(jīng)遞質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸鹽(glutamate，Glu)及P物質(zhì)(substanee P, SP ) 在迷走神經(jīng)節(jié)內(nèi)合成并釋放至孤束核 ，而起興奮性神經(jīng)遞質(zhì)作用。Glu及SP 是否參與腸道刺激后迷走神經(jīng)的信

11、號(hào)傳入尚未見報(bào)道。我們推測(cè)腸道刺激后， 腸道EC細(xì)胞釋放5-HT，5-HT作用于迷走初級(jí)傳入神經(jīng)末梢的5HT受體，興奮迷走傳入神經(jīng)，將信號(hào)傳至迷走神經(jīng)節(jié)，迷走神經(jīng)節(jié)利用Glu及SP作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)將信號(hào)傳至孤束核。因此，在本研究的前半部分，我們將通過腸腔刺 激觀察迷走神經(jīng)節(jié)內(nèi)興奮性神經(jīng)元神經(jīng)遞質(zhì)Glu及SP的表達(dá)，并通過神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)電生理記錄證實(shí)Glu及SP作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)參與信號(hào)上傳。同時(shí)孤束核 內(nèi)Glu及SP受體表達(dá)增加，電生理記錄確定興奮性神經(jīng)元，通過神經(jīng)元染色證 實(shí)迷走傳入神經(jīng)將Glu主SP作為興奮性遞質(zhì)將外因刺激的信號(hào)傳至中樞。中樞對(duì)胰腺分泌功能的調(diào)節(jié)主要是通過迷走運(yùn)動(dòng)背核(do

12、rsal motor nucleus, DMN )發(fā)出的副交感運(yùn)動(dòng)神經(jīng)起作用。以往零星的研究發(fā)現(xiàn)DMN微量注射甲狀腺素激素(thyrotropin-releasinghormone, TRH能刺激胰腺分泌，而胰多肽(pancreatic polypeptide, PP )則能抑制胰腺分泌何。腦內(nèi)注射生 長抑素(somatostatin, SS)、鈣調(diào)基因相關(guān)肽(calcitonin gene-regulated peptide, CGRP 及胰高血糖素類似肽(Glucagon-like-peptide-1, GLP-1 )亦 對(duì)胰腺分泌有抑制作用11-13。但各種中樞神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)胰腺分泌的作用

13、通路， 它們對(duì)迷走傳出神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)、對(duì)胰腺內(nèi)神經(jīng)元的調(diào)控，以及特定神經(jīng)遞質(zhì) 對(duì)胰腺分泌的特異性調(diào)節(jié)作用尚未見報(bào)道。DMN勺迷走傳出神經(jīng)對(duì)胰腺分泌的 調(diào)控是非常復(fù)雜的，其 方面接受 NTS的傳入信 息，另 方面也接受高級(jí)中樞 3a 節(jié)是眾多興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)綜合作用的結(jié)果，迷走神經(jīng)傳出纖 維作用于胰腺內(nèi)神經(jīng)，后者綜合各種中樞信息，調(diào)節(jié)胰腺功能。研究發(fā)現(xiàn)DMN迷走傳出神經(jīng)有多種神經(jīng)遞質(zhì)，如乙酰膽堿、NOS及各種神經(jīng)肽(VIP、NPYGRP等16，因此，我們推測(cè)特定的刺激可以作用于某一組迷走運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，它 們有特定的神經(jīng)遞質(zhì)，這些傳出纖維作用于具有不同的特有神經(jīng)遞質(zhì)的胰腺內(nèi) 神經(jīng)元，從

14、而調(diào)控不同的胰腺功能。綜上所述，雖然以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腸道刺激后，腸粘膜 EC釋放5-HT, 作用于迷走傳入神經(jīng)末梢5-HT3受體最終引起胰腺的分泌，但這種刺激上傳通 路及參與的神經(jīng)遞質(zhì)均不明確。DMN內(nèi)微量注射某些神經(jīng)遞質(zhì)已證實(shí)對(duì)胰腺的 分泌功能有興奮或抑制作用，但中樞傳出對(duì)胰腺分泌的調(diào)控通路及其相關(guān)的神 經(jīng)遞質(zhì)尚不清楚。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了本研究，希望能初步確定腸道刺激引起胰 腺分泌的一個(gè)完整的神經(jīng)通路，即腸道刺激激發(fā)迷走傳入沖動(dòng)到NTS DM1傳出沖動(dòng)到胰腺調(diào)節(jié)胰腺分泌功能。這一研究將證實(shí)存在腦-胰通路(Brai n-Pa ncreas In teraction )的假說，豐富對(duì)胰腺分泌調(diào)節(jié)

15、機(jī)制的認(rèn)識(shí)， 對(duì)胰腺疾病的救治具有重要的意義。參考文獻(xiàn)1. Li Ying, Owyang C. Endogenous cholecystokinin stimulated pancreatic enzyme secretion viaa vagal afferent pathway. Gastroenterology, 1994;107(2) :525-5312. Li Ying, Hao Y, Owyang C. High-affinity CCK-A receptors on the vagus nerve mediatesCCK-stimulated pancreatic secret

16、ion in rats. Am J Physiol, 1997;273(3Pt1):G679-G6853. Li Ying, Owyang C. Pancreatic secretion evoked by cholecystokinin andnon-cholecystokinin-dependent duodenal stimuli via vagal afferent fibers in rat. J Physiol, 1996;491(3):773-7824. Li Ying, Hao YB. Zhu JX, OwyangC. Serotonin released from intes

17、tinal ECcells mediate luminal non-CCK stimulated pancreatic secretion in rats. Gastroenterology, 2000;118(6):1197-12075. Li Ying, Hao YB, Zhu JX, Owyang C. Intestinal serotonin acts as a paracrine substance tomediate pancreatic secretion stimulated by non-CCK dependent luminal factors. AmJ Physiol,

18、2001;281(4):G916-G9236. Zhu JX, Wu XY, Owyang C, Li Ying. Electrophysiological evidence that intestinal 5-HT actsas a paracrine to mediate vagal signal transmission evoked by luminal factors in the rat.J of Physiol, 2001;530(3):431-4427. Li Ying., WuYX, OwyangC. Serotonin and cholecystokinin synergi

19、stically stimulate at vagal primary afferent neurons. Gastroente ogy, 2001;120(5):A38328. Granata AR, Sved AF, Reis DJ. In vivo release by vagal stimulation of L-(3H) glutamic acidin the nucleous tractus solitarius preloaded with L-(3H) glutamine. Brain Res Bull,1984;12(1):5-9.9. Okumura T, Taylor I

20、L, Pappas TN. Microinjection of TRHanalogue into the dorsal vagal complex 3b 10. Okumura T, Pallas TN, Taylor IL. Pancreatic polypeptide microinjection into the dosal motor nucleus inhibits pancreatic secrtion in rats. Gastroenterology, 1995;108(5): 1517-2511. Li Ying, Jiang YC, OwyangC. Calcitonin

21、gene-regulated peptide inhibits pancreatic exocrine secretion by modulation of vagal parasympathetic outflow. Am J Physiol, 1998;275(5Pt1):G957-G96312. Li Ying, Owyang C. Somotostatin inhibits pancreatic enzyme secretion by a central vagal site of action. Am J Physiol, 1993;265(28): G251-G25713. Li

22、Ying, Zhu JX, Rillamas E, Nozu F, OwyangC. Glucagon-like-peptide-l acts via dorsal vagal complex to inhibit pancreatic enzyme secreation. Gastroenterology, 1998;114 (4): G474114. Li Ying, Wu XY, Owyang C. Hypothalamic regulation of pancreatic secretion is mediated bycentral cholinergic pathway. Gast

23、roenterology, 2000;118(4): A13115. Rogers RC, McTigue DM, Hermann GE. Vagal control of digestion: modulation by central neural and pheripheral endocrine factors. Neuroscience and Biobehavioral Reviews,1996;20(1):57-6616. Wang J, Zheng H, Berthoud H. Functional vagal input to chemically identified ne

24、urons inpancreatic ganglia as revealed by fos expression. Am J Physiol, 1999;277(5Pt1):E958-E9643c -三、研究方案1. 研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)腸道接受刺激后，迷走感覺神經(jīng)利用谷氨酸鹽(Glu)、P物質(zhì)(SP)作為神經(jīng)遞質(zhì)腸道接受刺激后，迷走感覺神經(jīng)通過 Glu、SP將信息傳遞到孤束核，孤束核 內(nèi)Glu受體及SP受體增加，亦參與這一迷走傳入通路腸道接受刺激后，迷走運(yùn)動(dòng)背核通過 SP神經(jīng)肽(neropeptide, NPY)興奮 有特定神經(jīng)遞質(zhì)的胰腺內(nèi)神經(jīng)元，刺激胰腺分泌；并通過

25、生長抑素(SS)作用于有特定神經(jīng)遞質(zhì)的胰腺內(nèi)神經(jīng)元，抑制胰腺分泌研究內(nèi)容腸道刺激后，迷走感覺神經(jīng)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞機(jī)制 利用c-Fos的表達(dá)確定腸道接受各種刺激(碳水化合物、高滲鹽水、5-HT)后，迷走神經(jīng)節(jié)(vagal no dose gan glia)內(nèi)的迷走感覺神經(jīng)元 通過免疫組化雙重染色，觀察 c-Fos陽性神經(jīng)元Glu及SP的表達(dá)，說明腸 道刺激后迷走感覺神經(jīng)Glu及SP表達(dá)增加 通過迷走感覺細(xì)胞的電生理記錄及細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)微粒(neurobiotin)標(biāo)記，確定腸道刺激后被興奮的迷走感覺神經(jīng)元，聯(lián)合細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)微粒標(biāo)記及免 疫組化雙重染色確定這些迷走感覺神經(jīng)元利用Glu及SP作為神經(jīng)遞質(zhì)孤束核

26、對(duì)腸道刺激的反應(yīng) 利用c-Fos的表達(dá)確定腸道接受各種刺激(碳水化合物、高滲鹽水、5-HT)后，孤束核(nucleus tractus solitarius, NTS)內(nèi)的迷走感覺神經(jīng)元 通過免疫組化雙重染色，觀察 c-Fos陽性神經(jīng)元Glu受體及SP受體的表 達(dá)，說明腸道刺激后NTS迷走感覺神經(jīng)Glu受體及SP受體表達(dá)增加 通過NTS內(nèi)迷走感覺細(xì)胞的電生理記錄及細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)微粒標(biāo)記，確定腸道 刺激后被興奮的迷走感覺神經(jīng)元，聯(lián)合細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)微粒標(biāo)記及免疫組化雙4a NTS內(nèi)微量注射Glu受體阻斷劑或SP受體阻斷劑后，觀察胰腺分泌功能， 說明阻斷這一上傳通路，中樞對(duì)胰腺分泌的調(diào)節(jié)不能下傳腸道刺激后迷

27、走運(yùn)動(dòng)背核對(duì)胰腺分泌的調(diào)節(jié) 腸道接受刺激后，胰腺內(nèi)注射熒光標(biāo)記霍亂毒素B(CTB)，逆向追蹤迷走運(yùn)動(dòng)背核(dorsal motor nucleus, DMN) 內(nèi)CTB陽性神經(jīng)元(支配胰腺神經(jīng) 元)。利用雙重免疫熒光標(biāo)記觀察 CTB陽性神經(jīng)元c-Fos、乙酰膽鹼轉(zhuǎn)移酶 (ChAT)、Glu受體及SP受體的表達(dá)，說明DMF內(nèi)支配胰腺的神經(jīng)元可被腸 道刺激激活 通過微量注射法，腦室內(nèi)或 DMF內(nèi)注射NPY受體拮抗劑、SP受體阻斷劑、 NPY SP SS,通過迷走神經(jīng)胰腺枝的電生理記錄，確定上述神經(jīng)遞質(zhì)可 作用于DMN調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)到胰腺的傳出信號(hào)，調(diào)節(jié)胰腺的分泌功能 腸道接受刺激后，DMh內(nèi)微量注射

28、SP NPY SS,觀察胰腺內(nèi)迷走神經(jīng)元(c-Fos陽性)，利用雙重免疫熒光標(biāo)記，觀察 c-Fos陽性神經(jīng)元ChAT胃 擬解決的關(guān)鍵問題迷走神經(jīng)節(jié)迷走感覺神經(jīng)元內(nèi)電生理記錄迷走神經(jīng)節(jié)迷走感覺神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)微粒注射孤束核內(nèi)迷走感覺神經(jīng)元內(nèi)電生理記錄孤束核內(nèi)迷走感覺神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)微粒注射迷走運(yùn)動(dòng)背核內(nèi)微量注射法迷走神經(jīng)胰腺枝電生理記錄雙重免疫熒光標(biāo)記4b 2. 擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析 研究方法利用c-Fos表達(dá)陽性確定迷走神經(jīng)節(jié)、孤束核、迷走運(yùn)動(dòng)背核及胰腺內(nèi)迷走 感覺神經(jīng)利用免疫組化雙重染色研究迷走神經(jīng)節(jié)內(nèi) c-Fos陽性神經(jīng)元Glu、SP等神經(jīng) 遞質(zhì)表達(dá)利用熒光免疫組化雙重

29、染色研究孤束核內(nèi)c-Fos陽性神經(jīng)元Glu受體及SP受體表達(dá)通過迷走感覺細(xì)胞的電生理記錄，確定腸道刺激后被興奮的迷走感覺神經(jīng) 元，免疫組化雙重染色確定這些迷走感覺神經(jīng)元利用Glu及SP作為神經(jīng)遞質(zhì)。熒光免疫組化雙重染色研究孤束核內(nèi)被興奮神經(jīng)元Glu受體及SP受體表達(dá)胰腺內(nèi)注射熒光標(biāo)記霍亂毒素 B（CTB），逆向追蹤迷走運(yùn)動(dòng)背核內(nèi)CTB陽性 神經(jīng)元（支配胰腺神經(jīng)元）。利用雙重免疫熒光標(biāo)記觀察 CTB陽性神經(jīng)元c-Fos、乙酰膽鹼轉(zhuǎn)移酶（ChAT）、Glu受體及SP受體的表達(dá)通過微量注射法，腦室內(nèi)或 DMF內(nèi)注射NPY受體拮抗劑、SP受體阻斷劑、 NPY SP SS,通過迷走神經(jīng)胰腺枝的電生理記錄

30、，確定上述神經(jīng)遞質(zhì)可作用 于DMN調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)到胰腺的傳出信號(hào)，調(diào)節(jié)胰腺的分泌功能通過迷走運(yùn)動(dòng)背核內(nèi)微量注射 SP NPY SS,利用雙重免疫熒光標(biāo)記，觀察 胰腺內(nèi)迷走神經(jīng)元ChAT胃泌素釋放肽等神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)技術(shù)路線腸道刺激后迷走感覺神經(jīng)的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞機(jī)制奮時(shí)伴SP Glu表-5a 孤束核對(duì)腸道刺激的反應(yīng)腸腔內(nèi)灌注各種刺激液（高滲鹽水、5-HT或碳水化合物）孤束核（nucleus tractus solitarius.NTS迷走感覺神 經(jīng)元電生理記確定被興奮 的感覺神經(jīng)神經(jīng)元內(nèi)神 經(jīng)微粒注射 免疫組化染NTS內(nèi)微量注射Glu受體阻斷劑SP受體免疫組化Glu受體免疫胰腺分泌功能-5b 腸道刺激

31、后迷走運(yùn)動(dòng)背核對(duì)胰腺分泌的調(diào)節(jié)腸腔內(nèi)灌注各種刺激液（高滲鹽水、5-HT或碳水化合物）胰腺內(nèi) 注射熒 光標(biāo)記1，IB逆向追1CTB陽性 確定DMN支配胰 腺神經(jīng)元腦室注射NPY SP受體拮抗劑DM儆量注射NPY SPDMNt 量 注射SS迷走神經(jīng)胰腺枝電生理記錄雙重免疫熒光觀察放電情CTB陽性 C-Fos表達(dá) ChAT表達(dá)SP受體表達(dá)Glu受體表 ST胰腺分說明DMN神經(jīng)元可 被腸道刺激證明DMN 通過NPYSP SS調(diào)節(jié)胰腺分5c DM 注射SP微量 fL"NP1、SSF觀察胰 腺內(nèi)神理雙重免 疫熒光C-Fos陽性神經(jīng)元ChAT表 達(dá)GRP表 達(dá)說明特定 的刺激通 過特定的 神經(jīng)遞質(zhì)

32、，作用 于特定的 胰腺內(nèi)神 經(jīng)元，發(fā)揮調(diào)節(jié)可行性分析課題組已取得本研究初步預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 腸腔灌注后，迷走神經(jīng)節(jié)c-Fos表達(dá)增加，免疫組化雙重染色提示 c-Fos陽性神經(jīng)元內(nèi)Glu表達(dá)增加（圖1） 已建立迷走神經(jīng)節(jié)電生理記錄方法 （圖2）,腸腔灌注5-HT后迷走神經(jīng) 節(jié)內(nèi)神經(jīng)元放電增加（圖3） 已完成迷走感覺神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)微粒注射方法，雙重免疫組化染色顯示 迷走神經(jīng)元中富含SP （圖4） 腸道灌注刺激后，孤束核內(nèi)神經(jīng)元 c-Fos表達(dá)增加，免疫組化雙重染色 提示c-Fos陽性神經(jīng)元Glu受體表達(dá)明顯增加（圖5） 孤束核內(nèi)微量注射Glu受體阻斷劑可減少腸腔灌注5-HT后胰腺分泌（圖 6） 胰腺內(nèi)注

33、射熒光標(biāo)記CTB逆向追蹤至迷走運(yùn)動(dòng)指核，見 CTB免疫熒光 陽性神經(jīng)元，神經(jīng)元內(nèi) ChAT c-Fos、NK1受體表達(dá)增加（圖79） 建立迷走神經(jīng)胰腺枝電生理記錄方法，迷走運(yùn)動(dòng)指核內(nèi)注射NPYf電活動(dòng)明顯增加（圖10） 迷走運(yùn)動(dòng)背核內(nèi)微量注射 SP,胰腺內(nèi)神經(jīng)元c-Fos表達(dá)增加，c-Fos陽 性神經(jīng)元內(nèi)ChAT表達(dá)增加（圖11）上述預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，課題組已掌握了完成本研究的關(guān)鍵技術(shù)，能夠成功解決 關(guān)鍵冋題。-5d 3. 本項(xiàng)目的特色和創(chuàng)新之處本研究使用的免疫組化雙重染色及多重染色技術(shù)、活體內(nèi)電生理記錄技術(shù) 均為當(dāng)今世界先進(jìn)的技術(shù)，結(jié)合胰腺分泌功能的研究將確定一個(gè)完整的神經(jīng)通 路，即腸道刺激激

34、發(fā)迷走傳入沖動(dòng)到孤束核，迷走運(yùn)動(dòng)背核傳出沖動(dòng)到胰腺調(diào) 節(jié)胰腺分泌功能。這一研究將證實(shí)存在腦胰通路(Brai n-Pa ncreasIn teraction)的假說，豐富對(duì)胰腺分泌調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識(shí)。5f 4. 年度研究計(jì)劃及預(yù)測(cè)進(jìn)展2003年1月2003年12月（第一年度） 腸道刺激后迷走神經(jīng)節(jié)c-Fos表達(dá) c-Fos陽性神經(jīng)元Glu、SP表達(dá) 腸道刺激后迷走神經(jīng)節(jié)電生理記錄 迷走神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元神經(jīng)微粒標(biāo)記及 Glu、SP表達(dá) 腸道刺激后孤束核c-Fos表達(dá) c-Fos陽性神經(jīng)元Glu、SP表達(dá)2004年1月2004年12月（第二年度） 腸道刺激孤束核神經(jīng)電生理記錄 孤束核內(nèi)神經(jīng)元微粒標(biāo)記及 Gl

35、u受體、SP受體表達(dá) 孤束核內(nèi)微量注射Glu受體阻斷劑對(duì)胰腺分泌的調(diào)節(jié) 胰腺內(nèi)注射，逆向追蹤，迷走運(yùn)動(dòng)背核 c-Fos表達(dá) c-Fos陽性神經(jīng)元ChAT Glu受體及SP受體的表達(dá)2005年1月2005年12月（第三年度） 迷走運(yùn)動(dòng)背核微量注射對(duì)迷走神經(jīng)胰腺枝電生理作用及胰腺分泌功能的 影響 迷走運(yùn)動(dòng)背核微量注射對(duì)胰腺內(nèi)迷走感覺神經(jīng)元的影響 課題總結(jié)，發(fā)表論文，申報(bào)成果5. 預(yù)期研究成果 初步確定腦胰軸（Brain-Pancreas Interaction）的神經(jīng)通路，即腸道刺激激發(fā)迷走傳入至孤束核，迷走運(yùn)動(dòng)背核傳出沖動(dòng)到胰腺，調(diào)節(jié)胰腺分泌。 本研究完成后，將申報(bào)國家科技成果獎(jiǎng)。 SCI收錄期

36、刊上發(fā)表論文數(shù)篇。四、研究基礎(chǔ)61.與本項(xiàng)目有關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績2.已具備的實(shí)驗(yàn)條件，尚缺少的實(shí)驗(yàn)條件和擬解決的途徑（包括利用國家重 點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和部門開放實(shí)驗(yàn)室的計(jì)劃與落實(shí)情況）7-6. 申請(qǐng)者和項(xiàng)目組主要成員的學(xué)歷和研究工作簡歷，近期已發(fā)表與本項(xiàng)目有關(guān)的主要論著目錄*和獲得學(xué)術(shù)獎(jiǎng)勵(lì)情況及在本項(xiàng)目中承擔(dān)的任務(wù)； 青年科學(xué)基金申請(qǐng)者還應(yīng)注明學(xué)位論文名稱及導(dǎo)師姓名與工作單位論文：作者題目刊名年份卷（期）頁碼 專著：作者書名出版者年份8a 論文：作者題目刊名年份卷（期）頁碼 專著：作者書名出版者年份8c 五、經(jīng)費(fèi)預(yù)算支出科目金額 （萬元）計(jì)算根據(jù)及理由1.合計(jì)2.科研業(yè)務(wù)費(fèi)3.科研業(yè)務(wù)費(fèi)4.儀器設(shè)備費(fèi)5.實(shí)驗(yàn)室改裝費(fèi)6.協(xié)作費(fèi)7.管理費(fèi)注：預(yù)算支岀科目按下列順序填寫：1.科研業(yè)務(wù)費(fèi)2.實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)3.儀器設(shè)備費(fèi)4.實(shí)驗(yàn)室改裝費(fèi)5.協(xié)作費(fèi)6.項(xiàng)目組織實(shí)施費(fèi)。開支范圍詳見國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目財(cái)務(wù)管理辦法第二章。9-六、申請(qǐng)者正在承擔(dān)的其它研究項(xiàng)目（攀登計(jì)劃、863計(jì)劃、攻關(guān)任務(wù)和各部委、省市任務(wù)等項(xiàng)目的名稱及編號(hào)、任務(wù)來源、 起止年月、負(fù)責(zé)或參加以及與本申請(qǐng)項(xiàng)目的關(guān)系等情況）七、申請(qǐng)者承擔(dān)（負(fù)責(zé)或參加）國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目的情況批準(zhǔn)號(hào)項(xiàng)目名稱起止年月負(fù)責(zé)或參進(jìn)展或完成情況加-10-對(duì)申請(qǐng)者負(fù)責(zé)的前一個(gè)已結(jié)題科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目名稱及批