DNA提取中各種實(shí)驗(yàn)試劑作用原理

1、DNA提取中各種實(shí)驗(yàn)試劑作用原理PrePared On 24 NOVember 2020DNA提取中各種實(shí)驗(yàn)試劑作用原理1、STE是TriS-HCI S EDTAS RCl的混合液。其總體作用是為IAA提供保護(hù)環(huán)境，在此環(huán)境下DA可以呈穩(wěn)定態(tài)，最少限度地受到破壞。提供緩沖體系，DNA在這一體系中呈穩(wěn)定態(tài)。EDTA :是DNA酶的抑制劑，可以防止細(xì)胞破碎后DNA酶降解DNAONaCII有利于IAA的溶解。2、SDS的作用：利用高濃度的陰離子去垢劑SDS （十二烷基磺酸鈉，SOdiUm dodecyl SUIfate）使DM與蛋白質(zhì)分離，在高溫（5565C°）條件下裂解細(xì) 胞，使染色體離

2、析，蛋白變性，釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度 的方法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀，3、苯酚的作用：使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了 DNaSe的降解作用。用苯酚處理勻 漿液時(shí)，由于蛋白與DA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯 酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DA溶于水相。使用酚的優(yōu)點(diǎn)：1-有效變性蛋白質(zhì)；2.抑制了 DNaSe的降解作用。缺點(diǎn)：1. 能溶解10-15%的水，從而溶解一部分POIy （A） RNAO 2.不能完全抑制RNaSe 的活性。TriS酚的顏色，一般為黃色。如果變成粉紅色，說明被氧化，不能再用。4、氯仿的作用克服酚的缺點(diǎn)；加速有機(jī)相與液相分層。最后

3、用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）5、異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DM的 水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。6、用乙醇沉淀IAA時(shí)，為什么加入單價(jià)的陽離子用乙醇沉淀DA時(shí)，通常要在溶液中加入單價(jià)的陽離子，如YdCl或NaACJNM中和DA分子上的負(fù)電荷，減少DA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚 集沉淀。7 -為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分 不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)(P

4、Ka二)和硼酸系統(tǒng)(pKa=)等雖然也都符 合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH).可作DA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根 離子的種類及數(shù)量將與52 +產(chǎn)生Ca3 (P04) 2沉淀，在DNA反應(yīng)時(shí)，不同的酶 對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃 度，采用TriS-HCI (PKd二)的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TriSH+/Tris1不存在 金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DA時(shí)，大都采用TriS-HCI系統(tǒng)，而 TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定。8、STE是TriS-HCI S EDTAS Rcl的混合液。其總體作用是為DA提供保護(hù) 環(huán)境，在此環(huán)境下DA可以呈穩(wěn)定態(tài)，

5、最少限度地受到破壞。提供緩沖體系，DNA在這一體系中呈穩(wěn)定態(tài)。EDTA :是DNA酶的抑制劑，可以防止細(xì)胞破碎后DNA酶降解DNAoNaCII有利于DM的溶解。9、SDS的作用：利用高濃度的陰離子去垢劑SDS (十二烷基磺酸鈉，SOdiUmdodecyl SUIfate)使IAA與蛋白質(zhì)分離，在高溫(55 65C°)條件下裂解細(xì) 胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度 的方法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀，10、苯酚的作用：使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了 DNaSe的降解作用。用苯酚處理 勻漿液時(shí)，由于蛋白與DA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基

6、團(tuán)與 苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DA溶于水相。使用酚的優(yōu)點(diǎn)有效變性蛋白質(zhì)；2.抑制了 DNaSe的降解作用。缺點(diǎn)能溶解10-15%的水，從而溶解一部分Poly (A) RNAO 2.不能完全抑 制RXaSe的活性。TriS酚的顏色，一般為黃色。如果變成粉紅色，說明被氧化，不能再用。11、氯仿的作用克服酚的缺點(diǎn)；加速有機(jī)相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。(酚易溶于氯仿中)5、異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張 力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DM的 水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。12、用乙醇

7、沉淀DM時(shí)，為什么加入單價(jià)的陽離子用乙醇沉淀DA時(shí)，通常要在溶液中加入單價(jià)的陽離子，如XdCl或NaACINM中和IAA分子上的負(fù)電荷，減少IAA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚 集沉淀。TriS中文品名：三甕甲基氨基甲烷；氨基丁三醇；緩血酸胺TriS結(jié)構(gòu)式英文品名：Tris; TriS (HydrOXymethyI) aminomethane英文別名：2-Amino-2- (hydroxymethyl)-1, 3-propanediolTHAM; TriS base; TrOmetamOI通用 CAS : 77-86-1產(chǎn)品純度：100%(USP藥典級)/ %(實(shí)驗(yàn)室技術(shù)級)產(chǎn)品級別：US

8、P藥典級,符合USPEPCGMP對藥物賦形劑的要求分 子式：NH2C(CH20H)3分子量：使用用途：生物制藥,體外診斷,個(gè)人護(hù)理及化妝品原料等保存溫度：常溫密封避光保存TRIS是一種最常用的生物緩沖液，常配成PH值為，。其PH值隨溫度變化 很大。一般來說，溫度每升高一度，PH值下降。IM TRIS-HCI 和 1. 5M TRIS-HCI 是 SDS-PAGE 最常用的試劑。而由TRlS配成的TAE, TBE等是DM電泳最常用的試劑I TE ()主要用于溶解DNAO TE 為 TriS 加 EDTA 合稱。緩沖特性：TriS為弱堿，在室溫(25C。)下，它的為；根據(jù)緩沖理論，TriS緩沖液的

9、有效緩沖范圍在到之間。TriS堿的水溶液PH在左右，一般加入鹽酸以 調(diào)節(jié)PH值至所需值，即可獲得該P(yáng)H值的緩沖液。但同時(shí)應(yīng)注意溫度對于TriS 的PKa的影響。衍生緩沖液：由于TriS緩沖液為弱堿性溶液，DNA在這樣的溶液中會被去質(zhì)子化，從而提高 其溶解性。人們常常在TriS鹽酸緩沖液中加入EDTA制成“TE緩沖液”，TE緩 沖液被用于DM的穩(wěn)定和儲存。如果將調(diào)節(jié)PH值的酸溶液換成乙酸，則獲得 “TAE緩沖液” (TriS/Acetate/EDTA),而換成硼酸則獲得“TBE緩沖液” (Tris/BOrateEDTA) O這兩種緩沖液通常用于核酸電泳實(shí)驗(yàn)中。制備：TriS可以由兩步反應(yīng)生成：先由硝基甲烷生成中間體三輕甲基硝基甲烷 (HOCH2)3CN02) I然后再由該中間體還原得到TriSo用途：TriS緩沖液不僅被廣泛用作核酸和蛋白質(zhì)的溶劑，還有許多重要用途。T