ELISA試驗(yàn)中本底及假陽性產(chǎn)生的原因分析

1、ELISA實(shí)驗(yàn)中本底及假陽性產(chǎn)生的原因分析?1 .基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別1.1 基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達(dá)系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)：a.分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到數(shù)百個氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。b.穩(wěn)定性好。包被的抗原的穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的試劑盒效期只有3-4個月，采用基因工程抗原后效期大大延長了。c.基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。d

2、.純化難度大。基因工程抗原的純化技術(shù)難度較大。1.2 合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。 合成肽抗原有以下特點(diǎn)：a.分子量太小b. 一般只含有一個抗原決定簇c.純度高d.穩(wěn)定性差由于基因工程抗原較于合成肽抗原有無可比擬的優(yōu)越性，ELISA診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。就 HCV ELISA試劑盒來講，第一代產(chǎn)品為合成肽抗原，主要是HCV特異性抗原決定簇的肽片段； 第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當(dāng)時的基因工程抗原不全，僅包括了 HCV的核心區(qū)片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗 原包括更多、更穩(wěn)定、

3、純度更高的HCV特異性抗原。第三代試劑的敏感度大大提高了。由于歷史的原因，人們往往以反應(yīng)本底的好壞來衡量ELISA反應(yīng)試劑盒，因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學(xué)敏感度不夠，穩(wěn)定性也成問題。值得欣慰的是也有廠家堅(jiān)持試劑盒高的流行病學(xué)敏感度，科學(xué)得對待反應(yīng)結(jié)果。2 .假陽性本底產(chǎn)生的原因3 . 1抗原因素3.1. 1 融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷試劑盒為例為例，因?yàn)榘坏幕?工程抗原為融合蛋白， 包含了來自表達(dá)載體的一些序列，因此可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生了可疑標(biāo)本。2.1.2 錯誤排序的影響。 合成肽在制備

4、過程中，如果某些肽序列錯誤，會導(dǎo)致合成肽特異性改變而產(chǎn)生假陽性。另外，在構(gòu)建基因工程表達(dá)載體時引入的HCV核甘酸發(fā)生相位改變或點(diǎn)突變也會對抗原的特異性產(chǎn)生不利的影響，但由于基因工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，由工藝原因造成的抗原特異性降低會逐漸被克服。3.2. 3抗原純度對特異性的影響。以HCV抗原為例，利用大腸桿菌大規(guī)模表達(dá)后需經(jīng)破碎細(xì)胞、鹽析、粒子交換柱等分離純化步驟才能最后的到一定純度的HCV抗原。目前的工藝還不能做到抗原純度為100%,因此抗原中還混有大腸桿菌的其它雜蛋白，受過大腸桿菌感染的人，血清中 的抗大腸桿菌抗體可和這些雜蛋白產(chǎn)生反應(yīng)而引起假陽性。2.2 人血清中的正常 IgG人血清中IgG

5、的濃度對HCV試劑盒有較大的影響。HCV試劑盒采用的間接法，酶標(biāo)抗抗體能與人所有IgG結(jié)合，而IgG吸附于板孔的能力很強(qiáng)，因此我們采用100微升樣稀加10微升血清來將其稀釋以降低本底。到成人時，據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)調(diào)查，成人的IgG為12mg/ml ,而有些人的IgG濃度會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于此，這部分人的血清經(jīng)ELISA反應(yīng)后往往會顯色。2.3 人血情中異常的IgG結(jié)締組織?。ㄏ到y(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性骨髓瘤等）等病癥時，血清中的風(fēng)濕小體和其它異常IgG（IgG濃度達(dá)到50mg/ml）會引起本底升高或假陽性。2.4 溶血的影響當(dāng)溶血時，紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有過氧化物酶的性質(zhì)，當(dāng)其通過吸附或“PP效

6、應(yīng)”（蛋白質(zhì)間相互吸附的現(xiàn)象）結(jié)合后，可催化A、B液顯色而造成假陽性。2.5 操作不當(dāng)引起任何操作不當(dāng)都會影響結(jié)果，因此在操作過程中保證操作的規(guī)范，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行是得到準(zhǔn)確結(jié)果的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。2.5.1 加樣2.5.1.1 樣品稀釋液少加，或血清多加，都會引起本底增高。對于間接法來說，受上述兩個因素影響更大。因?yàn)檠逯惺軝z的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異的IgG均可以和酶標(biāo)二抗發(fā)生反應(yīng)而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多，高于規(guī)定的稀釋倍數(shù)，必將帶來陰性高值。 2.5.1.2酶結(jié)

7、合物的不正確加入。一般來講，酶也有一定的非特異吸附，將包被好的酶聯(lián)板再封閉，一方面也可避免酶的非特異性吸附。通常每孔加入的封閉液為120心l。如果加入的酶多于120 al或加在較高的孔壁上或孔口，也會引起本底升高或假陽性。 2.5.2 溫育 5.2.1由于試劑盒確定的一定溫度下的反應(yīng)時間并不是反應(yīng)的終點(diǎn)，升高反應(yīng)的溫度，會加快反應(yīng)，同樣增加時間會延長反應(yīng)，這樣得到的反應(yīng)程度會比試劑盒確定的反應(yīng)程度多，也會引起陰性高值或假陽性。 5.2.2由于試劑盒通常設(shè)定的反應(yīng)溫度為37度，在這個溫度下放置30分鐘，蒸發(fā)的水分會很多，對于整個反應(yīng)體系來講，各種反應(yīng)物的濃度會不斷增加，這樣必會導(dǎo)致反應(yīng)最后的值升

8、高。 因此溫育時應(yīng)蓋上膠貼。1.1.1.1 盒在設(shè)計(jì)時，反應(yīng)是在靜置條件下完成的，如果反應(yīng)改變?yōu)檎駝訔l件，會加快分子的熱運(yùn)動，增加反應(yīng)的機(jī)會。5.2.4 試劑盒的溫育過程是在培養(yǎng)箱中進(jìn)行， 但較難將溫度控制在較穩(wěn)定的溫度，往往高于 2.5.3.洗板2.5.3.1各個廠家使用的洗液配方是不同的，常會得到不正常的反應(yīng)結(jié)果，包括本底過高的試劑盒混用。這和水浴的條件不一樣。水浴可是酶聯(lián)板迅速升溫， 37度，同樣會引起高值陰性。是根據(jù)各自試劑的條件配制的，采用不配套的洗液本公司的洗液采用獨(dú)特的洗滌系統(tǒng)不能和其它公司1.1.1.2 試劑盒中提供的洗液是濃縮的，應(yīng)該稀釋到規(guī)定的倍數(shù)使用，過多稀釋洗液，會影響

9、洗液的效果，而使反應(yīng)的本底過高。1.1.1.3 稀釋洗液的水應(yīng)該是新鮮的蒸播水，電導(dǎo)率小于1.2心s。如果水中含有過多的Ca2+、Mg2+,這些離子會占用表面活性劑，影響洗滌效果。1.1.1.4 洗板時，應(yīng)每孔加滿洗液，如果加入的洗液液量不夠，對洗滌的效果影響也是很大的。本公司的酶聯(lián)板板孔為 400心l ,比別的廠家的板孔大，因此洗了別公司的板后要及時調(diào)整液量， 以避免加液量不滿。1.1.1.5 洗板的次數(shù)不夠孔內(nèi)多余的抗原(抗體)或酶結(jié)合物不能徹底去除，也會因此本底升高。1.1.1.6 洗板的強(qiáng)度和洗板的浸泡時間是密切相關(guān)的。洗板機(jī)不同，使用的泵不同，液體加入時的沖力不同。如果加入洗液的沖力

10、不大，也沒有設(shè)定浸泡時間，同樣會使結(jié)果的A值偏高。1.1.1.7 洗板完畢后，要進(jìn)行拍板，盡量采用質(zhì)量好的毛巾和吸水紙，使用易掉渣的紙，紙屑會留在板孔中，由于紙屑中含有氧化劑而造成高值陰性。2.5.4. 顯色。加A、B液準(zhǔn)確，順序不能顛倒，要及時終止顯色。終止后要在3分鐘內(nèi)讀數(shù)，否則強(qiáng)陽性會變低。2.5.5. 槍頭、加樣槽或其它來源的污染如果使用的槍頭、 加樣槽是反復(fù)使用的，必須肯定其沒有來自酶或陽性的污染。酶作為反應(yīng)的催化劑，及其微量也會很明顯影響反應(yīng)。反復(fù)使用的槍頭、加樣槽清洗不當(dāng)，也會干擾反應(yīng)。如將槍頭使用84消毒液浸泡而沒有沖洗干凈，因?yàn)?84是強(qiáng)氧化劑，加入 AB液后就會顯色。同樣

11、槍頭和加樣槽不正確清洗，改變加入試劑的PH值，反應(yīng)的結(jié)果也會不正常。常常有人用手紙將加樣槽擦干，但是如果使用的手紙容易掉渣，會將紙上的強(qiáng)氧化劑留在槽中而影響反應(yīng)。2.5.6. 測A值時，微孔條底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面都可能引起A值的升高。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；影響因素；控制方法論文摘要： 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enayme liked immunosorbent assay , ELISA)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種檢測技術(shù)，因其具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的測定，為輔助臨床診斷與生物科研起到了積極的推動作用。但ELISA測定中影響因素較多，

12、操作過程中每個環(huán)節(jié)都會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，出現(xiàn)錯誤的結(jié)果?，F(xiàn)筆者對影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的常見因素及相應(yīng)的控制方法分析探討1試劑的因素1.1 試劑的選擇試劑的選擇是保證血液檢測質(zhì)量的關(guān)鍵要素。雖然國家采用批批檢定的形式對ELISA試劑嚴(yán)格把關(guān)，但不同廠家的試劑在使用效果上仍存在在差異。要選購知名度相對高、具有主證”的試劑，不要用無批號的試劑，最好選用與儀器配套的試劑。更不要使用過期的試劑和混用不同批號的試劑。1.2 試劑的準(zhǔn)備在臨床實(shí)驗(yàn)室，對試劑的準(zhǔn)備一般不太注意，通常的做法是在實(shí)驗(yàn)時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面時間不夠的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。

13、因此，在 ELISA測定中試劑的準(zhǔn)備最為關(guān)鍵的是，將試劑盒先 從冰箱中拿出來，在室溫下放置2030 min后，再進(jìn)行測定，使試劑盒在使用前與室溫平衡，這樣做的目的能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度較快地達(dá)到所需的溫度，以滿足后面的測定需求。2樣本的因素2.1內(nèi)源性干擾因素包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體等1。1.1類風(fēng)濕因子在類風(fēng)濕患者及正常人血清中，常含有較高或不同濃度的類風(fēng)濕因子（RF）,其一般為IgM型，亦有IgG和IgA型，具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點(diǎn)，因?yàn)樵?E LISA測定中，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標(biāo)的特異抗體IgG結(jié)合，

14、從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。避免其發(fā)生的方法有：用 F（ab）2替代完整的IgG。標(biāo)本用聯(lián)有 熱變性IgG的固相吸附劑處理。 檢測抗原時，可用2-疏基乙醇加入到標(biāo)本稀釋液中使RF降解。1.2補(bǔ)體在固相酶免疫測定中，來自哺乳動物的固相抗體和酶標(biāo)二抗均有激活人補(bǔ) 體系統(tǒng)的功能。一方面，固相抗體和酶標(biāo)二抗可因其吸附及結(jié)合過程中抗體分子發(fā)生變構(gòu)， 使Fc段的補(bǔ)體C1q結(jié)合點(diǎn)暴露出來，使 C1q成為一個中介物將二者交聯(lián)起來出現(xiàn)假陽性 結(jié)果。另一方面，固相抗體也會因?yàn)榛罨a(bǔ)體的結(jié)合，封閉抗體和抗原的表位結(jié)合能力而引起假陰性。解決的辦法是：用EDTA稀釋標(biāo)本。56 c 30 min加熱血清使C1q滅活1 , 2。2

15、.2外源性干擾因素包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本保存時間過長和標(biāo)本凝固不全等。2.1標(biāo)本的溶血血紅蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標(biāo)志的ELISA測定中，如血清樣本中血紅蛋白濃度較高，則很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的 HRP底物反應(yīng)顯色。所以在采血時應(yīng)注意手法，采集的血液勿用力振蕩， 嚴(yán)防標(biāo)本溶血。2.2標(biāo)本的污染菌體可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，可使實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)非特異性顯色。因此，ELISA檢測宜采集新鮮標(biāo)本，如不能當(dāng)時測定，5 d之內(nèi)應(yīng)4c保存，1周后檢測應(yīng)低溫凍存；同時，收集標(biāo)本采用無菌試管，可防止標(biāo)本的污染。2.3標(biāo)本的保存標(biāo)本

16、在冰箱中保存過久，血清中IgG可聚合成多聚體，AFP可形成二聚體，在用間接法測定中會導(dǎo)致本底過深，甚至造成假陽性。冰凍保存的標(biāo)本反復(fù)凍融產(chǎn)生機(jī)械剪切力對標(biāo)本中的蛋白等分子有破壞作用，可引起假陰性結(jié)果。因此， ELISA檢測盡量采用新鮮標(biāo)本， 長時凍存的樣本避免反復(fù)融凍。2.4標(biāo)本凝固不全凝固不全的血清中含有部分纖維蛋白原，可使結(jié)果呈假陽性。解決的方法 有：于采血管中加入適當(dāng)?shù)目鼓齽粚⒉杉蟮难悍旁诩茏由显俜湃?7 c水浴中1h,待充分凝固后再離心分離血清。3操作中的因素3.1 加樣孵育前加樣時間過長， 酶試劑加出孔外，使用滴瓶滴加試劑時， 滴加的角度不同和擠壓 的力度不同，致使滴加的試劑量

17、不準(zhǔn)，都可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確?？刂品椒ǎ簩?shí)驗(yàn)樣本過多時，可分批次操作，以減少實(shí)驗(yàn)時間延長造成的誤差；加酶試劑后，用吸水紙吸干孔外試劑；作定量試驗(yàn)時，使用加樣器加注試劑，并經(jīng)常校正其準(zhǔn)確性，此外，要做到一份樣 本一個移液頭，防止交叉污染。3.2 溫育溫育是ELISA測定最為關(guān)鍵、最容易出現(xiàn)問題的步驟。最為常見的溫育溫度有37c和室溫，其次是43c和28C。目前國內(nèi)售 ELISA 試劑盒溫育時間為 37C, 30 min1 h, 進(jìn)口 ELISA試劑盒則通常為 37 C, 12 h能有較完全的結(jié)合。2.1溫育時間、溫度的選擇一般根據(jù)試劑盒的說明書選擇溫育的時間、溫度。加完樣本和（或）試劑后將微孔板

18、從室溫放入水浴箱或溫箱中時，孔內(nèi)溫度從室溫升至37 c需要一定時間，如果是將微孔板一放較長反應(yīng)時間的條件；用 1個小入溫箱即開始計(jì)時，這樣就容易造成實(shí)際測定中溫育時間不夠，易致弱陽性標(biāo)本測不出來。控制方法：如有兩種溫度，盡量使用較低的溫育溫度、溫度計(jì)放置在板孔反應(yīng)液中測量觀察。2.2邊緣效應(yīng)”的排除邊緣效應(yīng)”是在使用96孔板的ELISA測定中，外周孔顯色較中心孔深的現(xiàn)象。產(chǎn)生的原因可能是為96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度造成的，因此在溫育時盡量采用水浴。3.3 洗板ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機(jī)洗板。采用手工洗板，孔與孔之間液體易交叉，采用半自動洗板機(jī)時， 洗液量不足導(dǎo)致洗板不徹底，洗板針堵塞導(dǎo)致抽吸不完全，洗板不暢導(dǎo)致清洗效果差?？刂品椒ǎ菏止は窗鍟r，拍板時要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離；洗板機(jī)洗板時應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時可用注射器針頭挑出；為了洗滌效果好，實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法，在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板12次，或適當(dāng)增加洗板的次數(shù)，有資料報道洗板7次能達(dá)到理想的洗滌效果。3.4 顯色市售ELISA試劑盒中，如以四甲基聯(lián)苯胺（TMB）為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；如以鄰苯二胺（OPD）為底物，則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉劑。顯色反應(yīng)條件